Métodos de Separación Cromatografía

Cromatografía “Like light rays in the spectrum, the different components of a pigment
mixture, obeying a law, are resolved on the calcium carbonate column and then
can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a
chromatogram and the corresponding method the chromatographic method”.
Mikhail Tswett, 1906

FASE
Técnica para separar ESTACIONARIA
componentes de una mezcla Líquido La cromatografía implica un
(soportado) CGL
por su diferente velocidad proceso entre fases
Gas CG Sólido (interfases) y, por ello, se
de avance a través de una poroso CGS verá muy favorecido cuando
FASE
FASE ESTACIONARIA, cuando MÓVIL Líquido hay mucho contacto entre
son transportados por una CLL ambas fases. Esto se
(soportado)
FASE MÓVIL. Líquido CL consigue trabajando con FE
Sólido
poroso CLS muy finamemente divididas
(cuanto más, mejor).
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Tipos de Cromatografías
Retraso diferencial
de los solutos Clase de Reparto/Interacción TIPO DE CROMATOGRAFÍA Fase Estacionaria SUBTIPO
promovido por …
Polar FASE NORMAL
Solubilidad REPARTO
Apolar FASE INVERSA
Reparto
Tamaño PENETRABILIDAD

Aniónica INTERCAMBIO DE CATIONES

Electrostática INTERCAMBIO IÓNICO
Catiónica INTERCAMBIO DE ANIONES

Hidrofóbica INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Interacción
Afinidad Biológica AFINIDAD

ej.: Cromat. sobre Hidroxiapatito

Inespecífica ADSORCIÓN o Cromat. sobre colorantes
inmovilizados

Modos Cromatográficos
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Resolución Cromatográfica

Tiempo de Retención
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Bomba
peristáltica

Colector de
fracciones
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Perfil de Elución
Elución Isocrática

Midiendo manualmente
la absorbancia de las fracciones

espectrofotómetro

fracciones
El volumen de las
fracciones incide
sobre la
resolución final
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Mejora de la resolución mediante

modificación del gradiente de elución

Elución en
Gradiente
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CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Reparto por tamaño
Cromatografía de filtración en gel ó Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Cantidad de soluto
eluyente
Polímero
microparticulado

Volumen de elución
moléculas
matriz del gel pequeñas
microesferas
porosas moléculas
grandes

HINCHADO Y
EQUILIBRADO

DIÁLISIS

membrana
de diálisis

disolvente
Cromatografía de penetrabilidad: Permite separar a
disolución las biomoléculas en función de su tamaño (y forma),
a desalar conforme eluyen en orden decreciente de tamaño.
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CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD

Soportes Comerciales para Cromatografía de Penetrabilidad Convencional

Diámetro Intervalo Diámet. Intervalo
Fabricante Nombre comercial partícula Matriza fraccion. Fabricante Nombre comercial partícula Matriza fraccion.
(µm) (kDa) (µm) (kDa)
BIO-RAD BIO-GEL A 0.5m 75-150 AG 10 :500 IBF ULTROGEL AcA 22 60-140 AG/AC 100 : 1200
BIO-GEL A 1.5m 75-150 AG 10 :1500 ULTROGEL AcA 34 60-140 AG/AC 20 :350
BIO-GEL A 5m 75-150 AG 10 :5000 ULTROGEL AcA 44 60-140 AG/AC 10 :130
BIO-GEL A 15m 75-150 AG 40 :15000 ULTROGEL AcA 54 60-140 AG/AC 5 :70
BIO-GEL A 50m 75-150 AG 100 : 50000 PHARMACIA SEPHACRYL S-100 HR 25-75 DX/AC 1 :100
BIO-GEL A 150m 75-150 AG 103:150x103 SEPHACRYL S-200 HR 25-75 DX/AC 5 :250
BIO-GEL P 2 45-90 AC 0.1:1.8 SEPHACRYL S-300 HR 25-75 DX/AC 10 :1500
BIO-GEL P 4 45-90 AC 0.8:4 SEPHACRYL S-400 HR 25-75 DX/AC 20 :8000
BIO-GEL P 6 45-90 AC 1 :6 SEPHACRYL S-500 HR 25-75 DX/AC 40 :20000
BIO-GEL P 10 45-90 AC 1.5:20 SEPHACRYL S-1000 SF 40-105 DX/AC 500 : 105
BIO-GEL P 30 45-90 AC 2.5:40 SEPHADEX G-10 55-166 DX - :0.7
BIO-GEL P 60 45-90 AC 3 :60 SEPHADEX G-15 60-181 DX - :1.5
BIO-GEL P 100 45-90 AC 5 :100 SEPHADEX G-25 34-138 DX 1 :5
BIO-GEL P 200 45-90 AC 30 :200 SEPHADEX G-50 40-160 DX 1.5:30
TOSOHAAS TOYOPEARL HW 40F 30-60 ME 0.1:10 SEPHADEX G-75 23-92 DX 3 :70
TOYOPEARL HW 50F 30-60 ME 0.5:80 SEPHADEX G-100 26-103 DX 4 :100
TOYOPEARL HW 55F 30-60 ME 1 :700 SEPHADEX G-150 29-116 DX 5 :150
TOYOPEARL HW 65F 30-60 ME 40 :5000 SEPHADEX G-200 32-129 DX 5 :250
TOYOPEARL HW 75F 30-60 ME 500 : 50000 SEPHAROSE CL-2B 60-200 AG 70 :40000
IBF ULTROGEL A4 60-140 AG 55 :9000 SEPHAROSE CL-4B 45-165 AG 60 :20000
ULTROGEL A6 60-140 AG 25 :2400 SEPHAROSE CL-6B 45-165 AG 10 :4000
aAC: poliacrilamida; AG: agarosa; DX: dextrano; ME: metacrilato copolimerizado con etilenglicol.
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CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna

Ferricianuro
Potásico
(M.W.=329)
Azul
Dextrano
(M.W.=2x106)

Coeficiente de reparto, Kav

Aλ
Azul
Dextrano

Ferricianuro

Vo Vt ml
Volumen de Volumen
exclusión total
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CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna

Mr (x) = 104.5 = 31600

RECTA DE CALIBRADO

4.5

0.39
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CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Separación de biomoléculas por tamaño
Criterio de pureza
Preparación enzimática
HOMOGÉNEA

Criterio de pureza
NEGATIVO
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: Separación por interacción electrostática

Elución mediante Gradientes de Fuerza Iónica

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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: Separación por interacciones biológicas de alta especificidad

Carga Lavado Elución Regeneración

ELUCIÓN
Cambio de buffer Absorbancia
??
pH extremos,
agentes caotrópicos

ELUCIÓN ESPECÍFICA
con agentes que
compitan por la unión Volumen (ml)
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN: HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Columnas de HPLC