ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA

LABORATORIO CLINICO
Curso: Química Clínica General.

METODOS DE DETERMINACION
DE PROTEINAS EN EL LABORATORIO.
CLINICO.

Propiedades fisicoquímicas de las proteínas.

Métodos en la determinación de proteínas

Profesor: Víctor Neyra

Email: [email protected]
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Propiedades Fisicoquímicas de las proteínas

 Constituidos por aminoácidos, polares, apolares

(hidrofóbicos), cargados negativamente o positivamente
a pH fisiológico.
 Enlace peptídicos (capaces de interactuar con metales).
 Absorbancia a 280 nm (aminoácidos aromáticos, enlace
peptídicos).
 Punto Isoeléctrico (carga neta cero) a determinado pH.
 Precipitación en medio acido (TCA) y en presencia de
cationes y aniones.
 Capacidad de dispersar la luz cuando forman complejos.
2
 Propiedades de los aminoácidos
 Los aminoácidos en soluciones acuosas absorben luz
ultravioleta en el rango de 280 nm, esta propiedad es
aprovechado para su detección y cuantificación.

 Solo los aminoácidos aromáticos (Tyr y Trp) absorben luz

UV a 280 nm debido al efecto resonante de sus anillos.

 Phe absorbe luz UV a 257 nm.

 El enlace peptídico; presenta resonancia y capacidad de

absorber la luz UV a 205 nm.
Propiedades de los aminoácidos
Absorbancia a 205 nm vs 280 nm
Características de las Proteínas

Contenido de Presencia de
enlaces
Nitrógeno
peptídicos-
Formación de
complejos

Precipitación Propiedades
de las Propiedades de las
proteínas de la proteínas de
proteína de adherirse a
Absorber colorantes

Grupos
Dispersión amino
de la luz libres

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 Métodos de análisis
 Nitrógeno Total
◦ Kjeldhal (Digestión con H2SO4, CuSO4, Destilación de NH3, Valoración
mediante titulación del NH3).
 Proteínas Totales
◦ Biuret, Bradford, Lowry, BCA.
◦ Enlace a colorantes
◦ Absorción Ultra violeta
 Fraccionamiento, identificación y cuantificación de proteínas
específicas
◦ Precipitación con sales
◦ Enlace a colorantes
◦ Electroforesis, Electroforesis capilar, Isoelectroenfoque.
◦ Métodos inmunoquimicos
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Nitrógeno total
No es de utilidad
◦ Método de Kjeldhal practica en medicina

Esta mas enfocado a

la industria alimenticia,
la ganadería y la
agricultura.

También es utilizado
en el análisis de agua
y suelos.

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10
Proteínas totales
◦ Método de Biured
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre
el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en
medio básico. 1Cu2+ interactua con 4 NH.

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Proteínas totales
◦ Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-
250 (también Serva Blue) a las proteínas.

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Proteínas totales
◦ Método BCA
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto
capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones
Cu2+ en medio alcalino.

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Proteínas totales
◦ Método BCA
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto
capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones
Cu2+ en medio alcalino.

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Cuadro comparativo de sensibilidad de las técnicas de
cuantificación de Proteínas

15
16
 Anormalidades de proteína total
 La medición del contenido de proteína plasmática total
provee información general que refleja estados de
morbilidad en muchos sistemas orgánicos.
 Hipoproteinemia
 Hiperproteinemia

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 Electroforesis
 Técnica usada para separar una mezcla de moléculas
cargadas, mediante migración a través de un soporte
poroso (papel de acetato de celulosa, capas de sílice o
alúmina, almidón, agar, o poliacrilamida) en respuesta a un
campo eléctrico.

 La mezcla es separada, visualizándose bandas .

 En Química Clínica, las macromoléculas de interés son

Proteínas.
 Electroforésis
Principio:
Factores que influyen en la velocidad de
migración
 Naturaleza de los compuestos con carga eléctrica.
• Carga.- depende del pH
• Tamaño.- fuerzas de fricción y electrostáticas.
• Forma.- fuerzas de fricción y electrostáticas.

 Campo Eléctrico.
• Intensidad.-La velocidad de migración es directamente
proporcional a la intensidad
• Voltaje.- La velocidad es proporcional a la diferencia de potencial
Resistencia.- La velocidad de migración es inversamente
proporcional a la resistencia.
 Tampón o Buffer.
 Medio soporte.
 Electroforesis SDS-PAGE
 Migración de moléculas cargadas a través de un soporte
poroso (poliacrilamida) en respuesta a un campo eléctrico.
 Las proteínas son denaturadas previamente a su
resolución, mediante SDS (dodecilsulfato de amonio) y 2-
Me (beta-mercaptoetanol).
 Separación de moléculas proteicas por medio de su carga
negativa debido al SDS.
 La distancia de migración de las proteínas a lo largo del gel
esta relacionada en forma lineal al log del PM. Esto hace
posible estimar el peso molecular de las proteínas
Polimerización de la Bis-a y Acrilamida
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)

CH3(CH2)11SO3- Na+
Electroforesis SDS-PAGE
Agentes denaturantes
Grupos Sulfidrilos

Beta-mercaptoetanol Ditiotreitol
Análisis de Proteínas
Multiméricas

- Se puede determinar el número

y tamaño de subunidades
mediante la electroforesis bajo
condiciones denaturantes

Agentes denaturantes
frecuentemente usados:
- Dithiotreitol (DTT)
- β-mercaptoetanol (βME)
El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante
Inicio de corrida
(donde inicia el gel separador)

Frente de corrida
(línea donde termina el colorante)
Extrapolación-Curva estándar

RF = distancia recorrida por la banda

distancia total al frente de la corrida
Electroforesis Bidimensional
Separación por punto isoeléctrico y tamaño

a) Isoelectroenfoque
a) Isoelectroenfoque b) SDS-PAGE
Bandas Oligoclonales en Fluido cerebro espinal

Utilizado como
prueba
complementaria
en el diagnostico
de Esclerosis
múltiple

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Punto isoelectrico Punto isoelectrico
igual pero diferente diferente
tamaño pero del mismo tamaño
Electroforesis Bidimensional

Electroforesis
Bidimensional de Suero
Electroforesis Acetato de Celulosa
 La electroforesis es una técnica basada en los
movimientos de moléculas cargadas en un campo
eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de
carga opuesta (cátodo y ánodo).
 Movimiento de las proteínas debido a su carga,
condicionado por el buffer del medio, pH=9.
 Las proteínas presentan grupos ionizables (COO- y
NH3+) pueden encontrarse cargadas positivamente o
negativamente, dependiendo de punto isoeléctrico.
 proteínas de suero se pueden separar mediante esta
técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9
(Albúmina) y 7,4 (Gamma-globulinas).
Electroforesis en Acetato de Celulosa
Electroforesis en Acetato de Celulosa

α1
antitripsina,

γ
antiquimiotripsina
(+) α1 α2 β (-)
α2
macroglobulina,
haptoglobulina

β
LDL
Transferrina
C3

γ
Anticuerpos
CRP
Electroforesis en Acetato de Celulosa
Inflamación Aguda Síndrome Nefrotico

Cirrosis Hipergammaglobulinemia
Electroforesis en Acetato de Celulosa

(+) α1 α2 β γ (-)
Electroforesis en Acetato de Celulosa de alta
resolución.

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Electroforesis en agarosa

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Esquema Electroforesis capilar
Electroforesis capilar en
suero
Problemas sobre proteínas, carga neta y
punto isoeléctrico.

1.- Una mezcla de proteínas, A (pI=6), B(pI=9), C(pI=2), fueron separadas

utilizando cromatografía de intercambio iónico (Intercambiador aniónico),
cual será el orden de elución de las proteínas, si el sistema utilizo un buffer
cuyo pH fue 6 (Considerar que para eluir la proteína unida a la matriz se
utilizo una gradiente de NaCl)
a) A, B, C
b) B, A, C
c) C, A, B
Intercambiador aniónico
d) B, C, A
Presenta una matriz cargada
e) C, B, A positivamente
+ +
+ +
+ +

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Problemas sobre proteínas, carga neta y
punto isoeléctrico.
En que orden eluirán las proteínas de una columna de intercambio catiónico
con una gradiente de sales si la solución a pH=7 contiene fibrinógeno,
hemoglobina, lisozima, pepsina y ribonucleasa A?
Dato: Fibrinógeno pI=5.8; Hemoglobina pI=7.1; Lisozima pI=11; Pepsina pI=1;
Ribonucleasa A pI=7.8.

a)Fibrinógeno, Hemoglobina, lisozima, Pepsina, Ribonucleasa A

b)Hemoglobina, Fibrinógeno, Lisozima, Ribonocleasa A, Pepsina
c)Ribonucleasa A, Pepsina, Fibrinógeno, Hemoglobina, Lisozima
- -
d)Lisozima, Ribonucleasa A, Hemoglobina, Pepsina, Fibrinógeno
e)NA - -
- -

Intercambiador catiónico
Presenta una matriz cargada
negativa
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