2.

5 Morfología colonial y microscópica

Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células. El
desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias
porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico. El tamaño,
forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo. La morfología de la colonia de
una bacteria puede variar según el medio en que crezca la bacteria.

En el estudio de cultivos de algunos microorganismos los criterios que se emplean para

caracterizarlos incluyen las características microscópicas: tamaño, morfología celular, forma de
agrupación.

Morfología de la colonial:

 Forma  Elevación  Margen

 Puntiforme  Plana  Entero
 Circular y ovalada  Elevada  Ondulado
 Filamentosa  Convexa  Lobulado
 Irregular  Pulvinada  Erosionado
 Rizoide  Umbonada  Filamentoso
 Fusiforme  Montañosa  Rizado
 Crateriforme
Las características morfológicas:
Morfología y crecimiento de las colonias:

1. Crecimiento superficial: a) floculado, b) anillado, c) peliculado d) membranoso.

2. Opacidad: a) ligera, b) persistente c) nula.

3. Cantidad de sedimento: a) escaso, b) abundante c) nulo.

El desarrollo de colonias sobre las superficies de agar permite al microbiólogo identificar las
bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto características.
El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo.
2.6 Métodos de tinción

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie. El
uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar
la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente
sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de
tinción:

 Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

 Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas
o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien
ciertos reactivos complementarios para la tinción.

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y
se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso
conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce
generalmente encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace que las células
parezcan mayores de lo que son realmente.

Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre la célula y el medio que la rodea es la
utilización de colorantes. Estos pueden emplearse también para localizar estructuras específicas
en la célula o para distinguir entre tipos diferentes de células.

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo
tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes
facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología todas las
tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos
(frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares,
se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación
por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en
pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un
mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las
estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético
entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos
de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une aciertas
estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la
presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables
del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos,
los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por
enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el
colorante se une a la desoxirribosa. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos
que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos
aparecen refringentes sobre un fondo negro.

2.6.1 Tinciones simples

La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tinción
puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta
de genciana, azul de metileno, fuscina diluida). La tinción simple se utiliza para destacar el
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas.

TÉCNICA: Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un
portaobjetos con una suspensión de microorganismos previamente secada y fijada a la llama, se
vierte una solución diluida de un colorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a
continuación se lava varias veces con agua y se seca. Debido a que las células son muy pequeñas,
este tipo de preparación suele observarse con aceite de inmersión en la lente objetivo.

Colorantes: En la tinción simple se utilizan tintes como safranina, azul de metileno, cristal violeta y
carbolfuesina.

2.6.2. Tinciones diferenciales: Gram, Ácido resistente, Knaysi, Albert

Tinciones diferenciales

Las tinciones diferenciales son de las más utilizadas en el área de Microbiología por las amplias
aplicaciones que posee para la salud. Este tipo de tinción es cuando se visualiza más de un color
porque se utiliza más de un colorante y sirven para poner de manifestó las características de
afinidad por ciertos colorantes de microorganismos. Se basan en el hecho de que distintos tipos de
células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a
una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su
capacidad de tinción.

Tinción de Gram:

Por medio de esta tinción se divide a los microorganismos en dos grandes grupos, Gram positivos y
Gram negativos, según retenga o no el cristal violeta utilizado en la tinción. Las diferencias en la
composición de las paredes de las células Gram positivas, que contienen una capa gruesa de
peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados de ácido teicoico, y las paredes de las células
Gram negativas, en las que la capa de peptidoglucano es más delgada, explican las diferencias de
tinción de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias. Es probable que la gran cantidad
de enlaces cruzados de ácido teicoico de los microorganismos Gram positivos contribuya a su
capacidad de resistir la decoloración con alcohol. Si bien el colorante de contraste puede ser
captado por los microorganismos Gram positivos, su color violeta no se altera.
Tinción de ácido resistente:

La tinción Ziehl Neelsen o de ácido alcohol resistencia, ha demostrado ser una de las tenciones
características más útiles y significativas para separar los bacilos tuberculosos y los
microorganismos relacionados. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se
pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite diferenciar a las bacterias
en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos
que no lo son. Las muestras clínicas útiles para su uso son múltiples, como el líquido
cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido sinovial, líquido pericárdico, biopsias para cultivo,
abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo, expectoraciones,
aspirados endotraqueales y lavados bronquioalveolares.
Tinción de Knaysi:

El mordente, compuesto de ácido tánico y alumbre de potasio, engrosa la pared, debido al tamaño
molecular del alumbre de potasio.

Tinción de Albert:

Los gránulos meta cromáticos son comunes en corinebacterias, espirilos y bacilos lácticos y su
presencia se utiliza en la identificación de esas bacterias. Estos gránulos tienen una afinidad más
fuerte por colorantes básicos (como la fucsina básica, el cristal violeta, el azul de metileno o el
verde de malaquita) que el resto de la célula. Estos aparecen de un color diferente del color
original del colorante, fenómeno que se conoce como metacromasia. Cuando se tiñen con el
colorante de Albert, que contiene verde malaquita, se observan de un color café verdoso oscuro.

2.7 Métodos de conservación de cepas

La conservación de cepas microbianas, los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar
correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son: que el cultivo a
conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las
células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente estables.

Conservación por congelación. Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente
crio protector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua
se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento.
Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura.
Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el
inconveniente de requerir aparatos especiales.

Conservación por transferencia periódica, la cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo
en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer
indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del
metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es
necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para
conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de
generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas
de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características.

Métodos restringidos, en este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a

los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados
que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos
Spirillum, Rhodospirillum, etc.

Desecación en papel de filtro, se utiliza un papel bastante absorbente (whatmann nº 3) que se

impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles).

Desecación en suelo, arena, silica gel, se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al
desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante
tiempo por este método.

Desecación en bolitas de alginato, este es un procedimiento bastante eficaz. Las células se

encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con
soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su
contenido en agua.

Desecación en sal gorda para halo bacterias, para su conservación por este método se mezclan las
células con sal y se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la
desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua
disponible.

2.8 Análisis de agua

En la naturaleza el agua se puede encontrar en distintos lugares y en distintos estados, así por
ejemplo la nieve, el hielo y el granizo, la bruma, las nubes, los arroyos y ríos, el mar, son nada más
que agua en sus tres estados: Líquido, sólido y gaseoso. CLARIFICACION: La clarificación elimina la
materia orgánica, turbidez y color del agua. Incluye esta operación a la coagulación, sedimentación
y filtración. Coagulación: Mediante esta operación se separan del agua las finísimas partículas que
originan turbidez y color.

Filtración Al igual que en la operación de laboratorio, la filtración en gran escala consiste en

separar un sólido de un líquido por un método físico. El agua límpida conserva aún algunos
materiales en suspensión y es necesario filtrarla para producir una clarificación completa.
Desinfección aunque la carga microbiana puede haber quedado retenida en el filtro de arena fina,
es necesario desinfectar el agua. A partir de la cloración de las aguas, se han podido controlar la
mayoría de las enfermedades de transmisión hídrica como el cólera y las disenterías bacterianas.
El desinfectante utilizado casi universalmente es el gas Cloro, pudiéndose utilizar también el
método de la ozonización.