Escuela ··de

Tecnología Médica

Edición Nº7, 2014

Autores:
TM. Mg. Cs. Erwin Landskron V.

TM. Mg. Pedro Cortés A.

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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014
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· INTRODUCCIÓN

Esta publicación corresponde a la séptima edición del Manual de ~-

Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico, que ha alcanzado un

nivel y actualización- de contenidos acordes a las necesidades que un
estudiante de Tecnología Médica requiere para desenvolverse en un (\
'--._j
[Link] Microbiología. !\
'0

Como es habitual .en el cambio de ... edición, se ha revisado

cuidadosamente cada capítulo, de. tal manera que el. estudiante podrá
encontrar la información que necesita de una manera organizada y en línea
con los contenidos que se abordan en las clases teóricas y prácticas de la
asignatura .

.Se ha fortalecido la informac;ión referente a drogas antimicrobianas,

en cuanto a resistencia y susceptibilidad, con material actualizado a enero
de 2014 de tal forma que el estudiante pueda realizar su aprendizaje a la
/-......,
vanguardia de los avánces y cambios en esta•[Link]. ·\_j
(\
.'-.../

·,1'
Tal como lo hemos señalado en ediciones anteriores, los aspectos '-._./

como factores de patogenicidad y epidemiología serán abordados en clases /\

'--../

teóricas o trabajos anexos, de manera que se enfatiza·. que .este texto :-=:) .
constituye una herramienta orientada a la información ~ntregada en las f\,
''--../'

cátedras, respondiendo así al programa de la asignatura de Microbiología

Clínica. Por consiguiente, este Manual no excluye otra bibliografía.

Esperamos que este documento sea un aporte para el estudiante

mientras curse la asignatura, y le sirva como apoyo cuando deba
desenvolverse en su campo laboral.

Los autores.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

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RAl~J;§ QI; PAL,.AaRA§ YTl~IÍ-ARA~ J;.~ M~~RQfUQbQ~IA

Los nombres científicos tanto singular corrfo ¡:,lutaJ;,.derjvan de las declinaciones del latin:

Femenino Masculino Neutro

Singular -a -us -um
Plural -ae -i -a
Ejemplos Alga, algae Fungus, fungí Bacterium, bacteria

Algunos ejemplos:

Actinomicetos[Actinomycetes]

m. pi. {Microbio!.) Grupo de bacterias de aspecto bacilar o filamentoso que según el medio de
(
·.._, desarrollo forman bacilos aislados o largos filamentos con aspecto de micelios fúngicos, por lo que
han sido considerados mucho tiempo como hongos.
aktTn(o)- gr. 'rayo', gr. cient. 'con filamentos'+ myket(es) gr. 'hongos' {sign. 1 'moco')+ -o esp.

(
'·- Adenovirus[adenovirus]

m. {Microbio!.) virus de tamaño mediano (90 a 100 nm.), sin envoltura, de 16 lados, con ADN en
doble hebra y lineal; causan enfermedades respiratorias, gastroenteritis, conjuntivitis, ett'.
aden(o)- gr. 'glándula' + [-eid(és) - gr. 'que tiene el aspecto de'] + uTr(us) lat. cient. 'virus' {sign. 1
'veneno')

Aerobio[aerobic]

adj. {Biol.) Se aplica . a la respiración en la que los principios [Link] se oxidan completamente
hasta dióxido de carbono y agua, liberando energía, en un proceso que requiere oxígeno molecular.
··- iiero- gr. 'aire' + bio- gr. 'vida'

Anfítrico, ca[amphitrichous]

adj. (Microbio!.) Que posee un flagelo en cada extremo; se aplica sobre todo a bacilos.
amphí gr. 'de un lado y otro'+ trikh(o)- gr. 'pelo', gr. cient. 'cilio'

e-·'' Arqueobacterias[Archaebacteria, Archaeobacteria]

f. pi. (Microbio!.) Uno de los dos grupos de procariotas, frente al de eubacterias; son

e microorganismos primitivos capaces de vivir en condiciones extremas (medios ácidos, muy

calientes, muy salinos, etc.), similares a las que existían en los orígenes de la tierra.
eí'
arkhaí'o- gr. 'antiguo'+ bakter-i{o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'+ -a [neutro pi.] gr. y lat.
\._

e Auxotrófico, ca[auxotrophic]
e
(...__ adj. (Microbio!.) Se aplica a algas o bacterias que precisan de nutrientes orgánicos externos.
aux- gr. 'crecer'+ -o- gr.+ troph(o}- gr. 'que nutre', 'que se nutre'+ -ik-os/-e gr.
e
e
e Bacilo[bacillus]

e m. (Microbio!.) bacteria en forma de bastoncillo o filamento más o menos largo, recto o encorvado
e según las especies.

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7- 2014

Bacteria[bacterium, bacteria]

f. (Microbio!.) Hoy día se consideran bacterias todos los procariontes (es decir, organismos con
células sin núcleo y con pequeña pared celular), que a su vez se dividen en eubacterias y \
argueobacterias. La distinción entre Eu- y arqueobacterias es importante; todas las células vivas
pertenecen a uno de los tres grandes reinos: eucariotas, arqueobacterias y eubacterias. Por otra
parte, no todas las bacterias tienen forma de bastón (significado del término en griego);
morfológicamente, las bacterias pueden ser: cocos (esfericos), bacilos (en forma de bastón) y
· espirilos {de formas onduladas).

bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'+ -a [neutro pi.] gr. y lat.

Bacteriano, na[bacterial, bacterian]

adj. (Microbio!.) Que está en relación con las bacterias.

bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'+ -iin-u(m)/~a(m) lat.

bacteriocina [bacteriocin]

f. (Microbio!.) agente ~ntibacteriano como la colicina.

bakter-i(o)-. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria' + kol(on) gr. 'colon' + -ik-os/-e gr. + -Tn{a) quím.
'sustancia'

bacteriófago, ga[bacteriophage]

adj, (Microbio!.) Del agente o virus que infecta y se reproduce en el interior de las bacterias
provocando su lisis;
bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'·+ -phag(o)- gr. 'que come'·

biofilm[biofilm]

m. (Microbio!.} Agregado de microorganismos con abundantes relaciones ecológicas entre ellos,

frecuentemente dispuestos en capas, embebidos en una matriz extracelular, adheridos a una superficie viva
o inerte.
bio- gr. 'vida'+ film ingl. 'lámina fina'

Campylobacter[Campylobacter]

m. (Microbio!.) género perteneciente a la familia Campylobacteraceae.

kamp(ylo)- Kaµn:úAoc; gr. 'curvado' + bakter-i(o)- l3aKt~p-tov gr. 'bastoncito', gr. cient.
'bacteria'

Clamidias[Chlamydia]
f. pi. (Microbio!.) género de bacterias intracelulares semejantes a virus, Gram negativas, que provocan varias
enfermedades del ojo, entre ellas el tracoma.
khlamyd(o)- gr. 'capa corta'+ -iu{m) lat.

coco[coccus]

(Microbio!.) micrococo; bacteria de forma esférica.

kokk(o}- gr. 'grano', gr. cient. 'bacteria redondeada'

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Cocobacilo[coccobacillus]

f. (Microbio!.) bacilo de forma oval, intermedia entre la propia de un bacilo y la de un micrococo.

kokk(o}- gr. 'grano', gr. cient. 'bacteria redondeada'+ bacillu(m) lat. 'bastoncillo', lat. cient. 'bacilo'

Coliformes[coliform]

m. pi. (Microbio!.) Grupo de bacterias Gram negativas presentes en el colon y agua, semejantes al colibacilo
(Escherichi co/i).
kol(on) gr. 'colon'++ lat. + [bacillu(m) lat. 'bastoncillo', lat. cient. 'bacilo'] + -forme(m) lat. del gr. 'que tiene
forma de'

Dermatofito [de rmatophyte]

m. (Microbio!.) Se aplica a los hongos microscópicos que se desarrollan en la piel, pelo, uñas, etc.
/
''- der-m(ato)- gr. 'piel' + phyt(o)- gr. 'vegetal'

Diplococo[diplococcus]

m. (Microbio!.) bacterias de forma redondeada que se agrupan de dos en dos.

di- Ól- [6úo] gr. 'dos'+ -plo- gr. 'multiplicado por'+ kokk(o)- KÓKKoc; gr. 'grano', gr. cient. 'bacteria
redondeada'

Endospora[endospore]

f. (Microbio!.) espora asexual que se desarrolla en el interior de células de bacterias muy resistente al calor.
,'
endo t.v6o- gr. 'dentro'+ spor(a) an:opá gr. 'semilla', gr. cient. 'espora'

Espirilos[Spirillum]

m. pi. (Microbio!.) género de bacterias flageladas en forma de espiral, provocan fiebre en humanos.
speir- gr. 'espiral'+ -illu(m) lat. 'pequeño'

Espiroquetas[Spirochaete, Spirochete]

f. pi. (Microbio!.) Clase de bacteria que presenta un filamento axial alrededor del cual se arrolla el
protoplasma en espiral. Algunas son patógenas.
. (~ speir- gr. 'espiral'+ -o- gr. + khaít(e) gr. 'melena', 'cerdas'
·~
Espora [spore]

f. (Microbio!.) Forma de resistencia de las bacterias, cuando las condiciones del medio se han hecho
desfavorables.
spor(o} gr. 'semilla', gr. cient. 'espora'

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Eubacteria[eubacterium]
. ·• .

f. (Microbio!.) Uno de los dos grupos principales de procariotas frente ~I de las arqueobacterias.
eu- gr. 'bien', 'normalidad'+ bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'+ -a [neutro pi.) gr. y lat.

Gonococo [gonococcus]

m. :(Microbio!.) bacteria (/ÍJeisseria gonorrhoeae) causante de la gonorrea.

gon- gr. 'órganos sexuales'+ -o-gr. 'grano', gr. cient. 'bacteria redondeada'

He/icobacter [helicobacter]

m. {Microbio!.) género de bacterias que infecta el mucus del epitelio estomacal humano; provoca
úlceras y algunos tipos de gastritis; la especie helicobacter pylori sólo vive en el estómago humano,
siendo el único organismo conocido que puede subsistir en un ambiente tan extremadamente
.ácido. Es una bacteria con forma de espiral.
helik(o)- gr. 'espiral'+ bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'

Levadura[yeast]

f. {Microbio!.) Nombr.e genenco de ciertos hongos unicelulares, de forma ovoidea, que se

reproducen por gemación o división.
/eua(re) lat. 'levantar'+ -t-üra(m) lat.

Meningococo[meningococcus]

m. (Microbio!.) microorganismo, en forma de diplococo, que es causa de diversas enfermedades y

principalmente de una forma de meningitis llamada cerebroespinal epidémica.
mening(o)- gr. 'membrana', 'meninge'+ gr. 'grano', gr. cient. 'bacteria redondeada'

Micobacterias[Mycobacteria, ~ycobacterium]

f. pi. (Microbio!.) Orden de bacterias aerobias que desarrollan un micelio; algunas son patógenas
como las que provocan la tuberculosis o la lepra.
myk- gr. 'hongo' (sign. 1 'mOco') + bakter-i(o)- gr. 'bastoncito', gr. cient. 'bacteria'+ -a [neutro pi.] gr.
y lat.

Micoplasma[mycoplasm.a]

m. (MicrobioL) género d~ bacterias patógenas que carece de pared celular.

myk- gr. 'hongo' {sign. 1 'moco') +-o-gr. + plás-m(a) gr. cient. 'líquido constituyente'

Neumococo[pneumococcus]

m .. (Microbio!.) bacteria que. provoca cierto tipo de pulmonía.

pneúm(ón} gr. 'pulmón'+ 'grano', gr. cient. 'bacteria redondeada'

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e Oncovirus[oncovirus]

m. (Microbio!.) Subfamilia de retrovirus que integra los virus tumorales de ARN.

onko- gr. 'masa', gr. cient. 'masa cancerosa' + uír(us) l~t. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno'

Papiloma[pa pilloma]

l. m. (Patol. Derm.) tumor benigno del tejido epitelial de la piel o mucosas.

2. m. (Pato!. Derm.) tumor benigno caracterizado por aumento de volumen de las papilas de piel o
mucosas.

e 3. m. (Microbio!.) Papillomavirus: Grupo de virus ADN que infectan la piel y membranas mucosas de
humanos; algunas variedades de virus del papiloma humano son la causa del cáncer de cérvix.
e papi/la(m) lat. 'pezón'+ -o-ma gr. 'tumor'

Parvovirus[p arvovirus]
e
m. (Microbio!.) virus del género Parvoviridae; es de los virus más pequeños que existen; provoca la
r· parvovirosis en perros pero no afecta a humanos.
'- paru-u(m)/-a (m) lat. 'pequeño' + uir(us) lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')
,--
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Picornavirus[Picornavirus]

m. (Microbio!.) Familia de pequeños virus sin cubierta de ARN monocatena rio como los virus de la
poliomielitis, rinovirus, aftovirus, etc.
píceo/o it. 'pequeño'+ RNA ingl. 'ARN' 'ácido ribonucleico '+ uir(us) lat. cient. 'virus' (sign. 1
( 'veneno')
(
'~
poliovirus[po liovirus]
e
m. (Microbio!.) especie vírica del género enterovirus y familia Picornaviridae; causante de la
poliomielitis ; se transmite vía fecal-oral, entran por la boca o nariz, se multiplican en la garganta y
tracto intestinal para luego ser absorbidos y diseminados hasta la médula espinal y las meninges.
poli(o)- gr. 'gris'+ [myel(o)- gr. 'médula'] + uir(us) lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')

Prión[prion]
e
r, m. (Microbio!.) agente infeccioso constituido por proteínas. Puede causar, entre otras, la
encefalopatía espongiforme bovina (E.E.B., enfermedad de las vacas locas}, el temblor (scrapie) de
e las ovejas y en el hombre todas las variantes de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, incluida la
í epidémica que se trasmite desde la vaca con E.E.B.
prote-(Tna) + -Tna gr. y lat. 'sustancia fundamenta l' + in1ec- lat. 'introducir', 'mezclar' + -on quím.
'partícula' · ·

r· provirus[pro virus]

m. (Microbio!.) Estado del genoma de un virus ADN o ARN cuando se está replicando en sincronía
con la célula hospedadora, en cuyo genoma suele integrarse.
r pró gr. 'delante de', 'antes de'+ uir(us) lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')

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Rabdovirus[rhabdovirus]

m. (Microbio!.) virus de ARN de cadena negativa en forma de bala o bastón; entre ellos está el
virus de la rabia.
rhabd(o}- gr. 'vara', 'caña'+ uir(us} lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')

Retrovirus[retrovirus]

m. (Microbio!.) virus que contiene ADN como material genético, cuya información de RNA debe ser revertida
a ADN en un proceso que se conoce como transcripción inversa.
re- lat. 'hacia atrás', 'repetición', 'con intensidad'+ trtins lat. 'a través de', 'más allá de'+ uir(us} lat. cient. 1/ .,
'virus' (sign. 1 'veneno')

Riilovirus[rhinovirus]

m, .(Microbio!.) Grupo de virus de la familia Picornavirus, responsables de los resfriados y otras

enfermedades respiratorias. }
rhin(o}- gr. 'nariz'+ uTr(us} lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')

Rizomorfo[rhizomorph]

m. (Microbio!.) Agrupación densa de hifas que recuerda a raíces; facilita la capacidad conductora o invasora
del hongo.
rhiz(ti} gr. 'raíz'+ -o- gr.+ -morpho- gr. 'que tiene una forma determinada'

Vibrioide[vibrioid]

1. m. (Microbio!.) microorganismo que presenta forma devibrión.

2. adj. (MicrobioL) Que tiene forma de vibrión.
uibr- lat. 'vibrar'+ -i- lat. +-o-gr. + -eid(és} - gr. 'que tiene el aspecto de'

Vibrión[vibrio]

m. (Microbiol.) bacterias de forma encorvada; p. ej., la productora del cólera de gran motilidad.
uibr- lat. 'vibrar'+ -iu(m) lat.

Virus[virus] ·'
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m. (Microbiol.) organismo de estructura muy sencilla, compuesto de proteínas y ácidos nucleicos; y capaz de
reproducirse solo en el seno de células vivas específicas, utilizando su metabolismo. 1'
,J

'~,
,j

uir{us} lat. cient. 'virus' (sign. 1 'veneno')

',.._/
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',./
,,,
~
• m. y f. significan nombre sustantivo masculino y nombre sustantivo femenino, ,-.,_
respectivamente. •~;'

,,-Y
• adj. significa adjetivo. \../
• PI. significa Plural.
~
,_,.)

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A- o An- = de, sin: asepsia, sin infección.

Aden- = glándula: adenitis, inflamación de una glándula.

Art- = articulación: artritis, inflamación de una articulación.

8/ef- = párpados: blefaritis, inflamación de un párpado.

Bradi- = lento: bradicardia, disminución de los latidos del corazón.

Bronq- = referente a los bronquios: bronquiectasia, dilatación de los bronquios.

Cefo/-= cabeza: encefalitis, inflamación del cerebro.

e Cist- = saco o vejiga: cistitis, inflamación de la vejiga.

e Cole-= bilis: colecistectomía, extracción quirúrgica de la vesícula.

Colp- = vagina: colporragia, hemorragia vaginal.

(' Dis- = dolor o dificultad: dispepsia, dificultad para digerir.

,_

Ehcefal- = cerebro: encefalitis, inflama,ción del cerebro.

Entero-= intestino enterosis, se cae el intestino.

Eritro- = rojo: eritrocito, g"Jóbulos rojos.

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l.._. Esta-= detener: estasis, se detiene el flujo de un liquido.

e
/·
Esten- = estrecho: estenosis, estrechamiento de un [Link] natural.

Eu- = bien: euforia, bienestar, sentirse con buena salud.

Febri- = fiebre: febril, con fiebre {*)

r•
1
Fleb- = vena: flebotomía, abrir una vena para sacar sangre.

e Ga/acto- = leche: galactosa, un azúcar de la leche.

r·
'---·
Gastr- = estomago: gastrectomía, excisión del estomago.

Ginec- = mujer: ginecología, rama de la medicina que estudia los padecimientos de las mujeres.
(
Hem- o hemat- = sangre: hematopoyesis, formación de sangre.

Hister- = útero: histerectomía, escisión del útero.

\ ..........

/dio-= el mismo, o por separado: idiopático, una enfermedad de origen desconocido.

Leuc-;,, blanco: leucocito, glóbulos blancos.

e
,' . Mast- = seno: mastectomía, escisión del seno.
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Tecnología Médica
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Meg- o Mega/-= gran: megacolon, colon anormalmente grande. _)

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Meta-= mas allá, cambio: metástasis, cambio en el sitio del cáncer.

Mío-= músculo: mioma, tumor de.or_igen muscular.

Necro- = cadáver, muerto:-necrosis, muerte de célulás.

Nef- = riñón: nefrectomía, escisión quirúrgica del riñón.

0/igo- = poco: oliguria, disminución de _la cantidad de orina.

0$te- (O) hueso: osteítis, inflamación de un hueso.

, ___,,/
Oto-= oído: otorrea, salida de líquido por el oído.

Pat- = enfermedad: patología, ciencia que estudia las enfermedades.

Per- a través, excesivamente: percutáneo, a través de la piel. (*)

Pio- = pus: piorrea, salida de pus.

- __J
Píelo- = pélvis renal: pielonefritis o infección urinaria alta es una infección de las vías urinarias que
ha alcanzado la pelvis renal.

Pneum- o Pneumon- = pulmón (pneum-aire): pneumococo, bacteria que causa neumonía.

_j

Polio-= gris: poliomielitis, inflamación de la substancia gris de la medula espinal.

Proct- = recto: proctosctomia, extirpación quirúrgica del recto.

Pseudo-= falso: pseudoangina, falsa angina.

Rino- = nariz: rinorrea, descarga de secreción nasal.

Sa/ping- = un tubo: salpingitis, inflamación de la trompa uterina

Taqui- = rápido: taquicardia, cuando aumentan los latidos del corazón.

Termo-= calor: hipotermia, disminución de la temperatura corporal.

Tox- o toxic- = veneno: toxemia, envenenamiento de la sangre.

-algía = dolor: cardialgia, dolor en ercorazón.

-asís o -osis = afectado con: leucocitos is, exceso en el número de· leucocitos.

-astenia= debilidad: neurastenia, debilidad nerviosa.

-cele= tumor, hernia: enterocele, cualquier hernia del intestino.

-dda = corte, matar: germicida, que destruye a los gérmenes (*)

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-ectasis = dilatación, estirar: angiectasia, dilatación de un vaso sanguíneo.

-ectomia = escisión: adenectomía, escisión del adenoides.

-emia = sangre: glicemia, azúcar en la sangre.

-estesia = relacionado a la sensación: anestesia, pérdida de la sensación.

-fagia = comer: polifagia, comer en exceso.

-fasia = hablar: afasia, pérdida del habla.

- filo= amor, afinidad: termófilo, que tiene afinidad por el calor.

-genico = que produce: piogénico, que produce pus.

-itis = inflamación: amigdalitis, inflamación de las. amígdalas.

-lisis= pérdida, disolución: autolisis, disolución de células.

-malacia= que se suaviza: osteomalacia, falta de dureza en huesos.

-oma = tumor: mioma, tumor formado a partir de músculo.

-osis {-asís)= que esta siendo afectado con: aterosis; arterioesclerosis.

-(o)stomía = formar una abertura: gastrostomía, la creación de una fístula gástrica artificial.

-(o)tomia = cortar: laparotomía, incisión quirúrgica en abdomen.

-patia = enfermedad: miopatía, enfermedad de un músculo.

-penia = falta de: leucopenia, falta de leucocitos.

-plastia= moldear: gastroplastía, moldear y reformar el estómago.

-poyesis = creación, formación: hematopoyesis, formación de sangre.

-pnea =aireo respiración: disnea, dificultad para respirar.

-ptosis = caída: enteroptosis, caída de los intestinos.

-ritmia = ritmo: arritmia, variación del ritmo normal del corazón.

r~ -rragia = que sale: otorragia, hemorragia del oído.

-rrea = descarga: otorrea, salida de líquido del oído.

í\
,,- -sten (ia) (ico) = correspondiente a la fuerza: astenia, falta de fuerza.
\.,_ -

-taxia o -taxis= orden, arreglo de: ataxia, falta de coordinación mus_cúlar.

-trofia = cuidado: atrof_ia, estropeado, o disminuido.

-uria = relacionado con la orina: poliuria, secreción excesiva de orina

(*)=origen latín.

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El laboratorio de micróbiología tiene la responsabilidad de realizar estudios relacionados
a las enfermedades infecciosas. A diferencia de las otras-secciones del laboratorio se trabaja con
sistemas vivos, dinámicos y los resultados son más cualité!tivos que cuantitativos. Las preguntas
que generalmente plantea el médico al laboratorio son:

1) ¿Existe una infecdón en el paciente?

2) ¿Cuál es el agente cáusal?
3) ¿Bacteria, virus, parásito, hongo? ._./

4) ¿Cuál es su susceptibilidad a los antimicrobianos?

El compromiso del laboratorio con el médico es el de propor_cionarle la información que ·...__,/

,\
requiere en forma gradual conforme se va generando en el [Link] analítico a fin de que 'sea
oportuna y trascendente. Hoy en día, la mayoría de los laboratorios de microbiología realizan el
_j
diagnóstico con 2 elementos básicos:
j

1. Identificación del microorganismo:

· a. Tinciones
b. Medios de cÚltivo
c. Pruebas bioquímicas
./
2. Evaluación de la susceptibilidad a los antimicrobianos:
·. ./.
a. Pruebas de difúsi6n en placa
b. Pruebas de micrbdilución en placa ·- j

c. Pruebas de dilución·en tubo

Para obtener el máximo provecho del laboratorio microbiológico es indispensable que el médico
cumpla con lo siguiente:

• Aportar con·la información clínica indispensable.

• Tener conocimientos básicos de microbiología clínica.
• Conocer las indicaciones y limitaciones de las pruebas.
• Solicitar el estudio en forma precisa.
• Comunicarse constantemente con el laboratorio.
• Alertar al laboratorio sobre patógenos raros
• Tomar las muestras correctamente.

Antes de tomar la muestra es importante:

1) Saber qué es lo que se está buscando específicam·ente.

2) Saber cómo se toma la muestra ideal.
3) · Comunicarse con el laborato'rio para dar y obtener información.

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,,l.,, . Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológic6. Edición Nº7 - 2014
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Etapas del Diagnóstico Microbiológico

. Etapas del Diagnóstico

e : Microbiológico 1 Procedimiento

Muestra correcta y bien tomada, bien rotulada con un

TOMA DE MUESTRA
apropiado transporte y almacenamiento.
( .
"·- MICROSCOPIA Tinciones de la muestra y del cultivo

CULTIVO Sembrar en placas, tubos con el medio apropiado.

Traspasar a medios diferenciales y selectivos, serología,

AISLAR/ IDENTIFICAR
e test ADN
Antibiograma por difusión o CIM, utilizando
SUSCEPTIBILIDAD antimicrobianos apropiados para el sitio de la infección, la
L bacteria aislada y el tipo de paciente.

e PROCEDIMIENTO GENERAL DE SIEMBRA

Introducción:

e La actividad que desarrolla el laboratorio de microbiología está orientada esencialmente al

diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas. Una parte importante de esa
actividad consiste en el aislamiento, la identificación y la determinación de la susceptibilidad a los
antimicrobianos de los microorganismos causales de estas enfermedades. Otra parte importante
de la actividad de un laboratorio de microbiología consiste en la detección de anticuerpos,
antígenos y ácidos nucleicos en diversas muestras {sangre, líquidos estériles, orina, etc.), técnicas
que resultan muy útiles en el diagnóstico precoz de determinadas enfermedades infecciosas. La
,~' - gran diversidad de muestras clínicas y de métodos diagnósticos aplicables, son dos aspectos que
'\..,__
diferencian el laboratorio de microbiología de otros laboratorios clínicos.
e

Preparación del lugar de trabajo para cualquier procedimiento de microbiología:

/"
• mesón limpio ydesinfectado con hipoclorito de sodio al 1%
• guantes desechables

e •
•
lentes de seguridad
pechera
( • mascarilla
• mechero

e •
•
asa calibrada de 0.001 mi
tórulas estériles secas
í
\_
• toalla de papel para demarcar _lugar [Link]
• caja de material cortopunzante
• cajas contenedoras de plástico con agua dorada al 1% para desechos de material sucio
• portaobjetos
• chupete de goma
('
• cubreobjetos
• cámara húmeda
• placas de Petri, caldos, tubos con medios de cultivo
r·. • tarro .de metal para atmósfera de C0 2
• lápiz marcador permanente

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Tecnología Médíca
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Procedimiento:.

• Antes de sembrar la muestra, cerra~ la puerta y no debe existir circulación de gente.

• Encender el mechero. Cada vez que se utilice el asa de siembra, se deberá esterilizar al
rojo en el mechero {en la llama azul) y enfriar en la tapa de la placa o en un borde del
agar. Lo mismo se hace con las pipetas Pasteur.

.El asa de siembra se

maneja cogiéndola deli-----'
mango como si tuera un...__ ___,
lápiz . •.

./

La boca del .tu o se

.flamea [Link]és d.e abrir
y antes de cerrar
Toda .la operación se
-----reanza cerca del
[Link] Bunsen

• Revisar orden de trabajo y muestras, verificando los datos del paciente {nombre, edad,
sexo, etc).
• Reconocer muestras mal tomadas y dar aviso de inmediato a los profesionales de la
sección.
• Identificar con el número de cultivo las placas, tubos y Gram de cada paciente.
', __ )

• Todas las placas de agar chocolate se incuban en atmósfera "de C0 2 en estufa a 372 C (la
atmósfera de C02 se logra eón un tarro al que se introduce una vela encendida).
,\
• Todas las siembras se. realizan con tórula. de origen y se aíslan las colonias con asa de ../
nicróm. Los urocultivos se siembran con asa calibrada estéril. .
• Al sembrar se debe cuidar de destapar las placas al lado del mechero.

Siembras:

En Placas:

• Las siembras de las placas que se realizan en el laboratorio se hacen en estrías, con el fin
de obtener colonias aisladas.
• Destapar la placa Petri al lado del mechero.
• Colocar el asa (o Tórula) con la muestra en un extremo de la placa y distribuirla en forma
de zig-zag, de extremo a extremo, cubriendo aproximadamente la mitad del agar.
• Rotar la placa en 902 y continuar el estriado en el. otro sentido de la placa, tocando las
estrías anteriores solamente una o dos veces, a fin de tomar unos pocos microorganismos.
Cubrir la mitad del espacio no estriado del agar.
• Finalmente, estriar la última sección del agar, girar la placa en 90º y tocar apenas sólo
unas estrías. Cerrar la placa y dejar invertida.
• Llevar a incubación en estufa á 352~372 C.
• Si se utiliza la mitad de una placa de 9 mm para dos pacientes, hacer una marca por la
parte inferior de Ía placa eón un lápiz [Link] rotular cada lado de la placa con la
identificación del paciente: Realizar el mismo procedimiento de siembra anterior, con las
muestras correspondientes.

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( .

En tubos:
( .

1. Si es en tubos con agar sólido inclinado: Con el asa de siembra estéril tomar la muestra e
inocular el tubo realizando un movimiento en zig-zag en la superficie. Comenzar el proceso en el
fondo, y avanzar hacia arriba por el área inclinada. Una vez sembrada la muestra tapar e incubar.

/
1
'--

(
\ __

2. En los tubos que haya que sembrar en profundidad pinchar 2-3 veces el agar, después de haber
sembrado en la superficie. ·

3. Si es en tubos con agar sólido de superficie plana: La muestra se siembra con un asa estéril
enterrándola unos centímetros en el agar del tubo. Tapar e incubar.

4. Si es en tubos de caldo: La muestra se transfiere al caldo, se homogeniza con éste y se tapa.

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5. Si es en tubos con agar Semi-sólido: dejar caer unas gotas en la superficie del agar y luego en
forma recta inocular hacia el interior.

Filamento i

[Link]:a

rnocumción dfJ un medio $t'lmls6lldo por

plcadu~ ton•hflo de stombra.

Bibliografia:

\ _ _¡

1. Murray, P.R., E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken. 1999. Manual of
Clinical Microbiology, 7 ed. American Society for Microbiology. Washington, o.e.
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Betty A. (2009). Editorial Médica Panamericana S.A. 12 edición.

, _/
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S. Alomar P, Berna! A, Harto A, Pérez JL, Picazo JJ, M. L. Sarazá ML. 2000, Seguridad en el
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Microbiología Clínica. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología
Clínica, Madrid;

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r. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas que
son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la bacteria ante situaciones adversas
e (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura y acumulación de metabolitos tóxicos). Estas
estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la
célula bacteriana, pudiendo alcanzar un diámetro considerablemente mayor que el de la bacteria.
La célula acaba por lisarse y morir dejando libre a la endospora. Las endosporas germinarán
cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy
conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium y Bacil/us: Clostridium tetani
(tétanos), C/ostridium perfringens (gangrena gaseosa), Clostridium botulinum (botulismo), Bacil/us
anthracis {carbunco).

Fundamento:

e/ -.
Las endosporas poseen unas cubiertas: ex_clusiv.as que• las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Además; estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio
'---
óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere
-~
dos colorantes:
e 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
e 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo
harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

TINCIÓN DE ESPORAS. Método de Schaeffer y Fultor'l'

Procedimiento:

1.- Cubrir el portaobjetos con una-solución de verde de malaquita al 5% en solución acuosa {en
abundancia), y calentar hasta la emisión de vapores. Mantener durante 3 a 5_minutos.
e 2.- Lavar con agua. ,
3.- Cubrir con safranina al 0,5% en solución acuosa como colorante de contraste durante 1 minuto.
4.- Lavar con agua y secar.
5.- Observar al microscopio (objetivo de inmersión). •

Interpretación:
Las esporas aparecen teñidas de verde y las células vegetativas de rojo.

e Bacteria que
contiene
(
endospora
(

. / .

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Preparación de los colorantes para la Tinción de Esporas (Método de Schaeffer y Fulton)

1) Verde de malaquita al 5%.

Verde de malaquita ....-............. 5 g

Agua destilada ..................... 100 mL
.j

Preparación:
- Disolver el colorante en el agua y dejar en reposo durante una hora y media.
- Filtrar.
- .Guardar en frasco oscuro.

2) Safranina al 0.5%.

Sáfranina ..................................... 0.5 g

~·
Agua destilada ............................ 100 mL . ,)

Preparación:
Disolver. el colorante y filtrar.

/ '

Fundamento: la cápsula bacteriana es la capa rígida con borde definido formada por una serie de
polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular.
Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo
· polialcoholes y aminoazúcares.
La cápsula es una capa rígida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la
tinta china. En cambio, la capa de material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de
[Link] partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa mucosa o glicocalix. Ambas se j
pueden detectar con métodos como la tinción negativa o la tinción de Burri.

La cápsula sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis. También se utiliza
como depósito de alimentos y como lugar de eliminación de sustancias de desecho. Protege de la
desecación, ya que contiene una gran cantidad de agua disponible en condiciones adversas.
Además, evita el ataque de los bacteriófagos y permite la adhesión de la bacteria a las células
animales del hospedador. ,....___
.)
\
\_ ..,./
Procedimiento (Tinción negativa):

l. Tomar un inoculo de cultivo con la cepa capsulada (si está en caldo) o coloque una gota de agua
de la llave y suspenda una pequeña cantidad de su cepa en [Link]· y deposítelo en el centro
sobre el portaobjetos.
2.- Depositar una pequeña gota de tinta china con pipeta Pasteur de vidrio sobre su portaobjetos
que tiene la muestra y mezclar con el asa.
3.- Esterilice su asa.
4.- NO FIJE EL FROTIS AL CALOR. ,...__.
5.- Depositar un cubreobjetos sobre la preparación. ')

6.- O_bservar al rnicro,scopi() en aumento 40X.

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(·,, Interpretación:

La tinta cubre toda la preparación excepto la cápsula y al observar

al microscopio se ve el fondo negro y los microorganismos con
cápsula sin color.

Fundamento: Las paredes celulares lipídicas {ácidos micólicos) de las micobacterias y Nocardia
poseen una característica única, es la gran afinidad y fijación del colorante carbolfucsina (o fucsina
fenicada). Esta fijación es tan fuerte que resiste el desteñido con intensos agentes decolorantes
como alcoholes y ácidos fuertes. La tinción Kinyoun permite teñir· tas bacterias ácido-alcohol
. resistentes sin tener que calentar a la llama la preparación {tinción fría).

Procedimiento:

• Fijar el frotis con calor.

• Cubrir la superficie con fucsina fenicada durante 3 minutos a temperatura
ambiente.
• Lavar con agua.
• Decolorar con solución acuosa sulfúrico al 1%.
• Lavar con agua.
• Cubrir la preparación con azul de metileno po'r 30 segundos.
• Lavar con agua. Secar. Observar a inmersión.

Resultado: las Nocardias se ven de color rojo con el fondo de la preparación de color azul.

• Coloración de azul de metileno de Loeffler:

Esta tinción es una coloración simple que es particularmente útil para la identificación de
especies de Corynebacterium. Los gránulos metacromáticos del C. diphtheriae toman con
facilidad el azul de metileno y aparecen con color azul intenso.

Procedimiento:

- Fijar el frotis con calor. Cubrir la superficie con la solución de azul de metileno durante 1
minuto. Luego lavar.

Resultado: las corinebacterias presentan gránulos inetacromáticos característicos gue toman el

azul de metileno y aparecen de un color azul intenso. -

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Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos es necesario mantenerlos en

un medio en el que dispongan de las .sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e ''-... ... /

indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. Eh estos medios, además de su

desarrollo, los microorganismos. pueden manifestar sus características de crecimiento y sus
propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. Estos preparados, en
los que mantenemos la vida de los microorganismos, se denominan medios de cultivo.

Un medio de cultivo es cualquier preparado, líquido o sólido que contiene todas las sustancias
nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos, deben tener un pH adecuado,
~-.
estar estéril y protegido contra la Contaminaciónanibientéil, ya sea en placas Petri, en tubos, en 1
'-·-..... /

matraces, etc.
1.. ,
Composición de un medio de cultivo:

• Componentes indispensables: agua, nutrientes organicos (hidratos de carbono,

aminoácidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgánicos (P; Fe, N, Mg, S, etc.)-
• Componentes alternativos: ·· isosmotitantes (NaCI), agente solidificante (agar-agar),
tampones, indicadores de pH, etc.
(~

Los sustratos energéticos y plásticos pueden ser suministrados por sustancias · nutritivas \_
contenidas en la maceración de la carne y vísceras. Los aminoácidos o péptidos son aportados por
las peptonas, que contienen todos los productos de degradación de las proteínas, sin vitaminas, y
· su composición exacta es variable según el tipo de sustrato y la enzima utilizc,1dos (pepsina, tripsina
o papaína). Los factores de crecimiento son suministrados por maceración y la adición de sangre,
suero, extracto de levaduras, liquido ascítico, etc.

La importancia de los medios de cultivo es tal, que sin ellos habría sido imposible la creación y el
· progreso de la microbiología. · ·

Las principales ventajas que ellos aportan son:

l. Permiten el aislamiento de los microorganismos a partir de un producto natural (suelo, agua,

excrementos, pus, aire, etc.)
2. Permiten s·u identificación según las características de crecimiento, morfología celular,
propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas:c¡ue' demuestran en los diversos medios de
cultivo.
3. Conservación durante meses y años de las cepas identificadas (cepario)
4. Obtención de microorganismos patógenos o sus toxinas para la. elaboración de productos
biológicos (vacunas, antitoxinas, etc.)

CLASIFICACIÓN OE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La clasificación de los medios de cultivo generalmente se basa en tres de sus principales

.~.
aspectos:

~.
!.SEGÚN SU COMPOSICIÓN QUÍMICA: '" .../

l. Medios sintéticos o artificiales: de composición química definida. Se conoce exactamente la

concentración de cada' uno de los nutrientes que· contienen.· Son formulaciones complejas y se
utilizan para el estudio del metabolismo bacteriano o para el cultivo de microorganismos
autótrofos.

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2. Medios naturales de compos1c1on indefinida: son aquellos que se preparan en base a

sustancias naturales. En estos casos se conocen los ingredientes pero no la concentración o
composición definida de ellos. A este grupo de medios de cultivo pertenece la mayoría (agua
peptonada, caldo común, leche, extracto de suelo, miel diluida, etc.).

11. SEGÚN SU ESTADO FÍSICO:

1. Medios líquidos: caldo común, caldo glucosado, caldo TSB, caldo nutriente.

2. Medios sólidos: agar TSA, agar sangre, agar Mac Conkey, agar SS, etc. Los medios sólidos se
obtienen de medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante. El más utilizado es el agar-
agar al 1,5 y 2%.

3. Medios semisólidos: con una- concentración baja de agar (0,5 - 1,2%). Ejemplo: Medio MIO,
O/F, tioglicolato.

111. SEGÚN SU UTILIZACIÓN:

1. Medios de cultivo comúnes, básicos o corrientes sirven para el crecimiento de especies

bacterianas poco exigentes (ej. caldo común, agar común, agar nutriente).

2. Medios de cultivo especiales que se emplean para fines determinados y entre los cuales
tenemos:

a) Medios Mejorados o enriquecidos: para el cultivo de gérmenes muy exigentes (ej. agar
sangre, agar · peptona adicionado de 5% de sangre, caldo peptona adicionado de suero
sanguíneo, etc.)

b) Medios Electivos: que por su compos1c1on qu1m1ca son .capaces de satisfacer los
requerimientos nutricionales mínimos de una sola especie rnicrobianá o de un grupo de ellas
(ej: Agar Lowenstein~Jerísen para Mycobacterium sp. y Nocardiá ·sp., agar chocóláte para
(
'-- bacterias fastidiosas). · · ·

c). Medios Selectivos: son medios de cultivo que han sido modificados para incluir en ellos uno
o más . agentes
.
inhibidores,
.. '
restringiendo en esta ..•forma. el . CÍ-eciniiento de ciertos
.· ., . ..1 • . . .
microorganismos. La elección de un medio selectivo debe ser, po_r- lo tanto, apropiado para el
aislamiento de un organismo previamente determinado. Las sustancias inhibidoras utilizadas
para la preparación de los [Link] selectivos abarcan colorantes, sales biliares, antibióticos y
varios otros inhibidores (ej. agar SS, caldo Selenita, agar Mac Conkey, agar Thayer Martjh, agar
XLD, agar Skirrow).

d) Medios Indicadores o Diferenciales: son aquellos en que ciertas especies de organismos

producen características fáciles de reconocer (ej. agar SS, agar Mac Conkey, agar XLD, .agar
eosina azul de metileno, agar sangre, agar TCBS). El agar sangre es diferencial por la hemólisis.
í

(
Preparación de los Medios de Cultivo Deshidratados

í,_ Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitación y calentando
ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agar se suelen hervir durante 1 minuto
e para conseguir su disolución evitando sobrecalentamientos innecesarios. Posteriormente a la
disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casos existen componentes lábiles
que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratado y que será ·necesario su esterilización
por separado (por ejemplo por filtración) y una posterior i~corporación de forma aséptica para
. obtener el medio completo. El pH de los medios de cultivo se ajusta durante su fabricación a los·
valores descritos en cada uno de ellos. Sin embargo, la calidad del agua que se l,l'tiliza en su

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hidratación, la utilización de medios no recientes etc., pueden modificar este parámetro por lo que
es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH
después de la esterilización de forma aséptica y utilizando soluciones ácidas (ácido clorhídrico,
HCI) o básicas (hidróxido de sodio, NaOH) estériles. En los medios sólidos la medida se hace a 45-
502( (el agar todavía no ha gelificado) mientras que en los líquidos se hace a temperatura
ambiente. Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su
esterilización en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de presión (1212C) durante 15 •ó ·20
·min., salvo en el caso de medios cuyos componentes sufran· alteraciones tales que los hagan \ _ _.,'

inadecuados para el érecimiento: Este es el caso de los azúcares utilizados en los ensayos de
fermentación, que se suelen esterilizár a me1¡or presión [0.5 atm de presión (1152C por 10
minutos o 1212c por 3 minutos)] par-a evitar su "caramelización", una modificación [Link]
su oxidación y consecuente conversión en formas tóxicas para el metabolismo de las bacterias, o
en el caso de la urea, que conviene esterilizarla independientemente por filtración.·

Conservación de los medios preparados

Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos casos por
razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se gUarda como medio
preparado. El tiempo de vida del medio preparado dependerá de la propia naturaleza del medio,
de la hermeticidad de los ~ecipientes que lo contienen, de la temperatura de conservación y de las
condiciones medioambientales. Si la hermeticidad ·es buena y la temperatura baja, 2~82C, la vida
del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas. De todas formas la refrigeración favorece la
deshidratación y en algunos casos, como por ejemplo, los medios para anaerobios, la conservación
es mejor a temperatura ambiente que en el refrigerador. Se deben evitar las condensaciones ya
que el depósito de gotas de agua podrá _ser causa de una alteración casi inmediata del medio.
Tampoco deben emplearse medios preparados en los que se observe un efecto de deshidratación. .j

Conservación de los medios preparados, listos para su uso.

Lqs medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado. de conservación; que es de
~

varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte ?on las adecuadas. Se recomienda ./
i
su almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y protegidos de la -luz. Algunos
medios deben conservarse entre 2-82C, siendo este requisito especificado en la etiqueta del
producto. Los medios de cultivo con Agar n_o deben guardarse .por debajo de 0 2 C, ya que se
alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua puede provocar precipitados o hacer que
- cristalicen ciertas susta_ncias del rriedio_ d~ cultivo, así como originar grietas en las placas
preparadas. En los medios de cultivo que d~ben reftmdirse y que deben _con~ener aditivos lábiles,
se suministra el medio basal preparado y según la _necesidad se deben añadir los aditivos de forma
estéril.

Fundido de medios sólidos

Cuando se necesita fundir los medios sólidos, preparados y estériles en frascos y tubos, para
verterlos en placa, es aconsejable hacerlo en baño maría, en microondas o en autoclave a vapor
fluente. En ningún caso debe aplicarse calor directo. Una vez fundidos, deberán dejarse enfriar
hasta unos 502c (añadir los aditivos si fuera necesario) para distribuirlos o sembrarlos. Hay que
tener en cuenta que los medios refundidos tienen una cierta tendencia al oscurecimiento y
precipitación, que aumenta cuando se mantienen fundidos durante periodos de tiempo
prolongados y a temperaturas entre 45-65ºC y que ello puede suponer una pérdida de las
características nutritivas o selectivas del medio, por lo que es aconsejable, no fundirlos más de una
vez y no mantenerlos en el calor largos periodos de tiempo. En este sentido son recomendables
los métodos rápidos como el que se obtiene con el fundido de medios en el microondas, donde se
debe dosificar la intensidad de la radiación y durante tiempos lo más cortos posibles. Las fuertes
intensidades de radiación, pueden provocar refundidos parciales, ebulliciones súbitas con
eventuales derrames del medio pudiendo alterar las cualidades del mismo.

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COMPOSICIÓN Y FUNDAMENTO DE LOS MEDIOS SELECTIVOS DE MAYOR
('
'- - USO EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA.
e

Fundamento
(' En el medio de cultivo, las peptonas,_ aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es .el hidrato de carbono fermentable, y la. mezcla de sales biliares y el cristal
( .. violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la microbiota Gram
........,,
positiva. . .
(' Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), .la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales
biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

,·. Mac Conkey - Fórmula (en gramos por

1
,_
(. litro) Instrucciones
¡.-.. ~-..

Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0 ,Suspender 50 g del polvo por litro d_e
'•- Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 1.5 .mezclar hasta uniformar. Calentar
Cloruro de sodio 5.0 :,Uavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta
Agar. 13.5 'disolver. Esterilizar en autoclave a 121ºC
Rojo neutro 0.03 ·durante 15 minutos.
··..:~.._
Cristal violeta . 0.001. ·•
pH final: 7.1 ± 0.2
e El agar Mac Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo.. Se usa para la discriminación de
(
,,. - bacterias con capacidad de fermentar la lactosa. Presenta dentro de su composición:
• Peptona que es una fuf:?nte de nitrógeno y carbono para las bacterias Lactosa negativas.
1

•
Lactosa (1%) que es fuente de carbono para lás bacterias Lactosa positivas .
Sales biliares que le confiere el carácter de selectivo,,inhibiendo el crecimiento de cocos
·-·
Gram +.
•
Cloruro sódico para mantener la tonicidad del medio .
• Rojo neutro como indicador que va hacer que el medio vire de coloración: si las bacterias
son Lactosa positivas, producirán ácidos dl:!rivados de la fermentación que darán al medio
un aspecto rosáceo; si por el co,ntrario son Lactosa negativos, el medio se basificará por el
uso de la peptona y se tornará amarillq.
• Cristal violeta: interfiere junto con las sales biliares en la inhibición de bacterias Gram
positivas.

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad; está dada por la sales biliares y el
verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los
coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la
· lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tjosulfato de sodio .

. Los pocos microorganism"os fermentadores de lactosa capaces d~ de~arr-ollar, acidifican el medio

haciendo virar al rojo el· indicad~r de pH, obteniéndose coÍonias rosadas o rojas sobre un fondo
rojizo.
Sa/monélla, Shigel/q y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, Crecen bien en el
medi.o de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se
. evidencia como tolorüas con centro negro debido a
la. formación· de sulfuro de hierro. Para
aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Caldo Selenito.

SS - Fórmula (en gramos por litro) :¡Instrucciones

Pluripeptona •.
5.0 •·

Extracto de carne 5.0

c::uspender 60 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 8.5 :mezclar hasta homogeneizar. Calentar a
Citrato de sodio 8.5 ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ~

._ ,/ '
Tiosulfato de sodio 8.5 ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-
Citrato férrico 1.0 50ºC y distribuir' unos 20 mi por placa.
Agar 13.5 ;:,ecar la superficie del medio unos
minutos en la estufa.
Verde brillante 0.00033 i)
j- Rojo neutro · 0:025
pH final: 7.0 ± 0.2

\
"~/-

_,,........,.,\
El agar SS (Salmonella, Shigella) es un medio sólido, .diferencial y selectivo. Se usa para el
aislamiento de Salmonella y Shigella, sin embargo pueden· crecer otros bacilos Gram H como
enterobacterias y Pseudomonas. Presenta dentro de su composición:

• El verde brillante, las sales biliares y las. altas concentraciones de citrato y tiosulfato
inhiben gran parte de la microbiota acompañante (Proteus no es inhibido).
• Sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes.
• Rojo Neutro como indicador de pH con el cual las colonias fermentadoras de lactosa
producirán ácidos i¡ cambiará el color del med_io a rosa. Como ShigeUa y Salmonella no
utilizan este azúcar forman colonias transparentes. · ·
• El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias
súlfato-reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro'y se forma sulfuro de hierro
de color negro. Las colonias de Salmonel/a se observan transparentes con un precipitado
'negro en él centro. ·

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e Medi~-{~~~--9Ei9 ?ara el ~islamiento y cultivo ?e •Yfl:>:rjg_zfi[EÍ~lf?c.~at'tl!!Jf!!f!!!l!.f?P<J»:~B/1}:ff~11§,"9Y otras
especies def\í;'i~7'19i"p partir de heces, agua y alimentos contaminados. Tamb1en es conociclo como
e Agar Tiosúlf~toCitra to Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.
e
e .. i=-úñ<:tamento"J
~~~

En el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne y la tripteína aportan

e nutrientes para el desarrollo bacteriano. Es este, el· medio selectivo más adecuado para el
aislamiento de las especies de Vibrio, e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta
e inhibición se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH
fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las
e colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen ácido
e a partir de este azúcar. Esto es debido al viraje del color de los indícadores de pH azul de timol y
(_ azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio ácido. Es importante tener en cuenta, que
la proporción de sacarosa en el medio está equilibradá. de forma talque rio inhiba el crecimiento
e bacteriano por exceso de ácido.
e
e El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta
azufre y junto con el citrato férrico permiten la _detección de producción de ácido sulfhídrico.
e Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación,
pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.

¡
í'
\__ 1 TCBS - Fórmula (en gramos por litro}
j Instrucciones
]Extracto de levadura 5.0 ,.
,-
\___ ¡Peptona de carne 5.0 .---
e jTripteína 5.0
e Jcitrato de sodio 10.0
jTiosulfato de sodio 10.0 ::iuspender 89 g del polvo en un litro de
- 'agua destiláda: Calentar hasta ebullición y
jBilis de buey 8.0
e ¡sacarosa 20.0 11
hervir de 1 a 2 minutos. NO
UTOCLAVAR. Distribuir en placas de
e !Cloruro de sodio 10.0 Petri estériles.
( rtjCitrato
,_____ --férrico
- + --------~----
!Azul de bromotimol
~I - 1.0
o:o;¡cvv;
• 0.04
-- '

jAzul de timol 0.04 -- ---

!Agar
r-- -
i
------:,.;.;----.......:;,- 15.0 · · - · · ·
pH final: 8.6 ± 0:2
----:~ •..,,.;.;..;-..:-..:...:;;<;-,

(
'- . - . .
El agar TC~S: es el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especiés de Vibrio, e
inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Presenta dentro de su composición:
e ' ~ : .· . ' . .

e • Extracto de levadura, peptona dé carne y 'tripteína: que aporta~ nutrientes para el

desarrollo bácteriano.
• Altas concentraciones de Tiosulfato y citrato, y la presencia de bilis y un pH fuertemente
(
alcalino generan una fuerte inhibición de la microbiota acompañante. -
• Sacarosa. La degradación de este carbohidrato es variable entre las especies de Vibrio y las
colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que
producen ácido a partir de este azúcar. Esto es debido al viraje del color de los indicadores
de pH azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio ácido.
í • El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos.
• El tiosulfato de sodio aporta azufre y junto con el citrato férrico permiten la detección de
producción de ácido sulfhídrico.

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;.•

Fundamento

El Agar XLD fue desarrollado por Taylor para incrementar la eficiencia en el aislamiento e
identificación de patógenos entéricos, particularmente de Shigel/a. Los patógenos son
diferenciados no sólo de lo~ -no patógenos fermentadores de lactosa, sino también de varios no
patógenos no fermentadores de la lactosa o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el
crecimiento de gérmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente
tóxicos.
En este medio el -extracto de levadura provee la fuente de nitrógeno, carbono, vitaminas y
cofactóres. La xilosa, lactosa y sacarosa son los carbohidratos fermentables. El tiosulfato de sodio y ~\
._j
el citrato férrico son adicionados para ver la producción de H2S. El rojo de fenal actúa como
indicador. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es adicionado como agente
solidifica nte.
La degradación de la xilosa, lactosa y sac::arosa genera la producción de ácido cambiando el color
'
_j

del medio de rojo a amarillo. La producción de H 2S bajo condiciones alcalinas, da colonias con el
centro negro. Esta reacción es inhibida en condiciones ácidas. La descarboxilación de la lisina en
ausencia de fermentación de lactosa o sacarosa, ocasiona la reversión del medio a alcalino y el \
./
colór del medio regresa a rojo.
, ___/

XLD - Formula (en gramos por·litro) Instrucciones

¡Xilosa 3.5
1L-Lisina 5.0
1
¡Lactosa 7.5
!sacarosa 7.5 Suspender 55 g del polvo en un litro de
agua destilada. Calentar hasta ebullición y
ffiosulfato de sodio ,6.8
hervir 1 minuto; Nci AUTOCLAVAR. - ~

IDesoxicolato de Sodio 2.5 )

1
EVITAR EL SOBRECALENTAMIENTO'.
!Extracto de Levadura .3.0
_ Enfriara una temperatura entre 45-50ºC
!Cloruro de sodio 5.0 ·.
V vaciar en placas de Petri estériles.
¡Citrato férrico de amonio 0.8
lRojo de fenol
---·
0.08
jAgar 13.5
· pH final: 7.4 ± 0.2

El agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es un medio sóHdo, diferencial y selectivo. Se usa para el
aislamiento y diferenciación de bacterias enteropí3togénicas, especialmente Salmonella y Shigel/a.
Presenta dentro de su composición:

• Desoxicolato de sodio que actúa_ como inhibidor de. colifonnes (E-?cherichia, K/ebsiella,
Enterobacter, Citrobacter).No afecia e_l crecimiento de Salmonel/q ni Shigel/a.
• Xilosa: las bacterias _entéricas fermentan rápidamente este carbohidrato, excepto
Shigella, de manera que al _no producir_ ácido, la colonia permanece del mismo color del
medio (roja);
• Lisina: permite diferenciar especies que fermentan la xilosa (produciendo colonias
amarillas por la producción de ácido) y que logran además descarbóxilar la lisina, lo cual
eleva el pH del medio originando colonias rojas. Este· es el caso de Salmonella.
• Sacarosa y Lactosa: la fermentación de estos carbohidratos producen gran cantidad de
ácido, lo cual impide que los coliformes lisina-positivos reviertan el pH a un valor alcalino,
y los patógenos productores de ácido sulfhídrico (H 2S) no descarboxilan la lisina.
• Tiosulfato de sodio: es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico (H2S) de
las bacterias sulfato-reductoras. Este ácido reacciona ton la sal de hierro del medio
(citrato de amonio y hierro 111) y se forma [Link] hierro de color negro. Las colonias de
Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro.
• Rojo Fenal: es el indicador del medio.

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Í'- Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
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En este medio, Salmonella Typhi produce colonias anaranjadas, ligeramente opacas. Las demás
especies de Sa/monella producen colonias de color del medio (rojas) y a veces con el centro negro
(Salmonella Paratyphi A no produce H2 S). Shigel/a, Providencia, Pseudomonas, Plesiomonas y
(' algunas especies de Yersinia producen colonias del color del medio, transparentes {rojas). Las .
''-'
demás bacterias de la microbiota intestinal producen colonias amarillas.

e
í'
Tabla de indicadores de pH

Los indicadores de pH son sustancias que tienen la capacidad de modificar su color cuando cambia
el pH. En general son ácidos de bases débiles que al disociarse producen un ácido o base
conjugado que es de diferente color.
,,,,.-,
-~ lnd H • ind + H+ {ácido)
í· lnd OH • lnd + OH- {base)

El ácido y la base son de diferente color y dependiendo del lugar de la reacción.

Todos los indicadores tienen un intervalo de pH, en el cual se produce su viraje. Por esta razón,
·- son muy utilizados en algunos medios de cultivo y en la mayoría de las pruebas bioquímicas. A
continuación se muestran algunos indicadores de pH con su intervalo de viraje (cambio de color).
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Para la caracterización bioquímica de las especies se dispone de numerosas técnicas de

laboratorio. Se cultivan los microorganismos en presencia de sustancias nutritivas específicas y
después se examinan para determinar las transformaciones químicas que han tenido lugar.

Esta prueba sirve para determinar la presenFia de la enzimaCitocromo C oxidasa.

Los microorganismos aerobios obtienen su energía (en forma de ATP) por la respiración, proceso
por el cual, el oxígeno molecular es reducido a partir de un sustrato orgánico (procedente de la
nutrición), con la intervención del sistema de transporte de electrones (cadena respiratoria),
produciendo agua o peróxido de hidrógeno; según la especie microbiana y su sistema enzimático.

Sustrato Orgánico ~

l
/
Existen_ especies bacterianas que
. . NAO _ Flavoproteína poseen el "citocronio C" demtro de
·_.> CoenzímaQ ~ . .H,c..._N,..c",-
ra cadena respiratoria y la reacción
de la oxjdasa se debe a la
Flavoproteína

Cltoc!mob
¡ e· (Í
Q
H,C:.,N"cH,
presencia - de . un _ sistema
citocromo-oxidasa que activa la
oxidación del citocromo que es
reducido por el oxígeno molecular
Cítocromo c ~·f R. Oxldasa reducido -
quien · actúa por' tanto como
Incoloro aceptor ·final de electrones. en la
cadena transportadora de
Citocromo Oxidasa ·. electrones. Por lo general, el
complejo citocromo-oxidasa sólo
se encuentra en los organismos
aerobios; algunos ánaerobios
facultativos y, excepcionalmente,
algunos microaerófilos (Vibrio fetus
y especies de Campy/obacter),
R. Oxidasa oxidado • pero los anaerobios estrictos
Coloreado carecen de actividad oxidasá. ~
( \

Fundamento:

La prueba se basa en ~omprobar la ~xistehcia de proteínas citocromo c que forman parte de

algunas cadenas transportadoras de electrones propias del metabolismo respirador. La presencia
de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamina de
oxidarse al ceder electrones a.1 citocromo c,apareciendo una .coloración púrpura (forma oxidada).
Esta prueba permite diferenciar por ejemplo enterobacterias (que carece·n de· citocromo c) del
género Pseudomonas,_Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, e n ~ s (que p~een citocrOmo
c). El reactivo más usado es el reactivo de Kovacs oxidasa, que es una solución de tetrametil-p-
fenilendiamina al 1% en solución acuosa. ·

La técnica consiste en tomar con la punta de un asa plástica o

varilla de vidrio una cantidad de cultivo bacteriano de 24-48
horas y transferirlo a .un trozo de papel filtro Whatman N°l de
aprox. 2 x 2 cm previamente embebido con 2 gotas del reactivo
oxidasa. Las bacterias productoras de oxidasa, oxidan
rápidamente el reactivo y la colonia se vuelve de color rojo o
púrpura. La lectura debe realizarse dentro de 30 segundos.

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,C Manual de Microb;ologíitlíni~a y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
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Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.
Una variante a esta técnica es mezclar el tetrametil-p-fen ilendiamina con alfa naftol. En este caso,
cuando se aplica a una cepa bacteriana que posee la enzima citocromo oxidasa, se produce azul de
indofenol que es un compuesto coloreado azul dentro de 1 a 2 minutos. El alfa naftol no es
necesario para que ocurra la reacción ya que sólo actúa como un componente de acoplamiento
azoico -N=N-grupo azo. El alfa naftol o 1 naftol se debe preparar al 1% en alcohol etílico 96º.

e
e
+ ~.~ó:
,e·
. 47. /,?'
Oioxidado.
oitocromo e
a.-Naftol
Drmetil-p-
fenilendiamina

o
Azul de indoteno1 · (insoluble en agua)

En el caso del género Micrococcus (cocáceas Gram positivas) son oxidasa positivos ya que poseen
citocromos tipos c y d. No obstante esto, la determinación de oxidasa no se puede realizar
í"
~ utilizando el N,N,-dimetil-p-f enilendiamina 1% en agua, sino que se debe. utilizar al 6% en
e dimetilsulfóxido (DMSO).

e
Precauciones de la prueba de la Oxidasa:

• La prueba no . debe realizarse sobre cultivos en medios con glucosa, ya que su

fermentación inhibirá la actividad de la enzima.
• . La prueba se puede realizar directamente sobre las colonias bacterianas, sin embargo sólo
se puede hacer en medios como agar sangre, TSA, BHI, agar nutritivo, pero nunca a partir
de un medio selectivo b indicador como Mac Conkey, XLD o SS. Esto es también válido si la
prueba se va a realizar en papel filtro.
L • Se han observado falsas reacciones positivas al hacer la prueba a partir de colonias
( obtenidas en medios con demasiada sangre.
• El fierro contenido en el medio o bien, liberado por el asa puede catalizar la oxidación del
reactivo, dando falsos positivos.
• La reacción positiva debe leerse por un cambio de color de las colonias y no por el medio
e que las circunda.
• No utilizar reactivo de Kovacs para determinar indo!.
L
• Una vez que las éolonias se han ennegrecido éstas pierden su viabilidad.
• Se puéde utilizar diclorhidrato de' dimetfl.::p~fénilendiamíria en vez de diclorhidrato. de
tetrametil~p-fen ilendiamina al 1%, el cual es más estable pero menos sensible. Por·esta
e razón el segundo compUesto debe preparase. diariamente dando una solución incolora.
· Proteger de ia luz. ·
• Asa metálica (cromoníquel o nicrom) sólo se puede utilizar si es pri~era vez eri su uso, de
lo contrario el fierro que se puede liberar aún en cantidades traza puede oxidar por sí solo
e •
el reactivo fenilendiamina dando un resultado falso positivo.
Si se desea emplear asa para la determinac_ión, esta sólo puede ser de Platino pero no de
e cromoníquel. . ·
e • Si se emplea la mezcla de tetrametil-p-fen ilendiamina con alfa naftol como reactivo de
e oxidasa, cualquier reacción dudosa o débil después de los 2 minutos no deben
considerarse.
í

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Tecnología Médica
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Fundamento:

Se detecta fa acción de la triptofanasa (enzima) presente en algunas bacterias frente al triptófano

(un aminoácido de la peptona). El triptófano puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar
tres metabolitos indólicos principales: indo(, escatol (metil indo!) y ácido indol acético (IAA, indol
acetato).

Para su determinación se usan cultivos frescos en caldo común (no utilizar medios glucosados ya
que aparecerá como negativa), para lo cual se siembra una asada de la bacteria en estudio. La
[Link] de esta prueba se efectúa después de una incub~ción de 24-48 h á 37°C.

Procedimiento: la determinación de indol se realiza

:empleando el reactivo de Kovacs para indol (diferente del de
oxidasa) compuesto de alcohol amílico, ácido clorhídrico y
paradimetilaminobenzaldehido. El _aldehído del reactivo se /

combinacon elindol, [Link] color rojo intenso (Rosindol}. A ·- ./

cada tubo de cultivo se agregan más o menos 5 gotas del

reactivo.

.--------. ~laminobenzaldehido
0
TRIPTÓFANO-t,,.H3C-lcOOH+NH,+l 1NDOL 1 . '
ROSINDOL (ROJO)
'-.._./

. ,
Para la identificación de las enterobacterias es de importancia lá determinación del tipo de
fermentación, lo que se realiza aplicando las reacciones de Voges Proskauer y de Rojo Metilo.

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación- que se
originan por _la fermentación de la glucosa. Entre los que se conocen hay 2 de importancia en la
identificación de éstas bacterias: la fermentación ácido.;.;mixta y la fermentación · del 2,3
butanodiol.

• En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente ácido láctico, acético y

succínico, a_demás de etanol, H 2 y C02,
• En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de áddo (acetato y succinato) y los
principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y C02,

El rojo de metilo es un indicador de pH con un· intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se
utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. _

Reacción de/Rojo Metilo \

Procedimiento:

Inocular un tubo con 5 ml de caldo RM-VP con un cultivo puro de no más de 24 horas de la
bacteria en estudio. Incubar a 36ºC durante 24-48 horas. Transferir 2,5 ml del caldo incubado en

udp Escuela de
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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014

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r un tubo limpio y adicionar 5 gotas de indicador Rojo Metilo (preparado al 0,04% en etanol
absoluto). La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la
e producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador v el microorganismo
e fermentó la glucosa por la vía ácido _mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el
amarillo no es considerado como positivo.

(, __ Reacción del Rojo Metilo

Resultados:

(+) Escherichia, Sa/mcmella y Proteus

('
(-) Enterobacteraerogenes, Serratia marcescens

·~

Reacción de Voges Proskauer-

(
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descrita en
la prueba de rojo de metilo. El acetilmetilcarbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la
( producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno y alfa naftol la acetoína es
oxidada a diacetilo que reacciona con la creatina (componente de la peptona) formando un
compuesto de color rosado.
e
r Procedimiento:

Para esta prueba se inocula la bacteria en 5 mL del medio RM-VP e incuba por 24-48 h a 37ºC. Se
r transfiere 1 mL del caldo a un tubo limpio y la reacción se revela agregando 1 mL de alfa naftol
(preparado al 5% en etanol absoluto) y 1 mL de hidróxido de potasio (preparado al 40% en
solución acuosaí. · · ·
r
r\
Una vez agregados los reactivos reveladores se debe
::,. agitar el tubo para exponer el medio al oxígeno
r atmosférico y dejarlo reposar durante 1O minutos.
r :l': u·· El desarrollo de. un _color rojo-fucsia Indica la presencia
r , ·de dia_ce~ilo,_producto de oxidación de la aceto[na y por
r · lo tanfo una' prueba VP pósítiva. ·

r
Ecófi
r

.r"'

Los géneros Klebsie/Ja, Enterobacter y Serratia dan como producto final de la fermentación de la
' glucosa butilenglicol y acetoína (acetilmetilcarbinol) que- es un producto intermedio en la
. r· producción del butilenglicol y una pequeña cantidad de ácidos .
r·

r
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Medio RM-VP (Caldo RM~VP) J

Fundamento

En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo

bacteriano y la glucosa es e.I hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada
)
por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se . /

originarán productos finales ácidos {ácido láctico, ácido acético, ~cido fórmico), o productos finales
neutros {acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, puede ser reconocida
por la adición de un indicador como rojo de metilo, para,revelar la presencia de productos ácidos,
y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos
finales neutros.

,voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido
de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se
,r~ \
debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio
para dar un color rojo.

1·····
1
Fórmula (en gramos por lítro) 1nsfrucciones
!Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de .)

¡Glucosa 1 5.0 agua destilada. Calentar suavemente

agitando hasta disolver. Distribuir y
Fosfato di potásico 5.0 esterilizar en autoclave a 118-12l°C
durante 15 minutos.
1
"
pH final: 6.9 ± 0.2

./

___,,/
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente
de carbono y compuestos amoniácáles como única fuente de nitrógeno en su metabolismo,
· provocando una_ alcalinización del medio. Entre las enterobaé:terias éstas características se dan en .__)
[Link] siguientes géneros: · Enterobacter, Klebsiella, Serrátk1, Citrobacter y algunas especies de
Satm·onella. Sin embargo, Escherichia; Shigelfa, Salmohe/lá ·ryphi· y Salmonella Paratyphi son
incapaces de crecer con esos nutrientes.
'- ...../

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es Ia•·únka fuente de nitrógeno y el citrato de

sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son [Link] para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofai:tor enzimático. El
cloruro de sodio mantiene él balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que
vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio
como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a

través del ciclo·· del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen·• a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados-como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

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Tecnología Médica TM; Mg Cs. Envin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
 udp Escuela de
í--" Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
,-y
e
¡Medio Citrato: Fórmula (en gramos por
;

! litro) Instrucciones
lCitrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado
fcÍ7)ru ro d~ sodi; 5.0 por litro de agua destilada. Dejar reposar
!Fosfato dipotásico 1.0 5 minutos y mezclar calentando a
!Fosfato monoamónico 1.0 ,ebullición durante 1 o 2 minutos.
1
•Distribuir en tubos y esterilizar en
¡sulfato de magnesio 0.2
autoclave a 121°C durante 15-minutos.
!Azul de bromotimol
' [Link]: :
Enfriar en posición inclinada.
1
Agar 15.0, .. ,

pH final: 6.9 ± 0.2

Precaución: el inóculo para la siembra en este medio debe ser pequeño ya que si es muy grande
algunos compuestos orgánicos preformados dentro de la pared de las bacterias que están
,Ar i- · ·"""·- muriendo_pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno como para dar una reacción falsa positiva,

Para la prueba, se siembra la bacteria en

estudio en el agar con asa y se incuba 24 h a
3T'C. Se siembra· la inclinación sin picar el
fondo.

Lectura: en una reacción positiva, el medio de

cultivo que es originalmente verde vira a color
azul (hay crecimiento y viraje al azul en la
inclinación del tubo). En una reacción negativa,
. permanece verde y no hay crecimiento en la
inclinación del tubo.

El Concepto de IMVIC: Las bacterias pertenecientes a la familiá Enterobacteriaceae, pueden

identificarse a través de una serie de pruebas bioquímicas, que permiten determinar la presencia o
ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia
metabólica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificación, uno de los más
conocidos y utilizados corresponde al IMVIC que se desarrolló para clasificar especies de la familia
antes mencionada y correspondientes al grUpo de bacteria~ coliformes (bacterias aeróbicas o .·
anaeróbicas facultativas, Gram (.:}, bacilares, no esporógenas que producen ácido y gas [Link] la
fermentadó n de la lactosa). Bajo el esquema de clasificición IMVIC, Seagrupan Ías pruebas de
Indo! (1), Rojo Metilo (M), Voges Proskauer (VI) y Citrato (C): · · ·· · · · ·

Las especies tipo del grupo coliforme son Escherichia coli y Enterobacter aerogen_es. E. coli es un
habitante normal del intestino del hombre y animales; [Link] E. aerogenes se presenta con
mayor frecuencia en los vegetales y sus semillas, por ello no indica obligadamente contaminación
fecal, pero sí sospechas, ya que también se [Link] en [Link] d_el hombre yarÍimales. Ambas
_especies tienen caracterísÚcéÍs m~rfológicas y de cultivo muy semejantes, por .ello es necesario
recurrir a las pruebas bioquímicas antes mencionadas para ~u identificación (IMVIC).

Test de IMVIC para diferenciar entre Escherichia coli y Enterobacter aerogenes.

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Tecnología Médica
TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Fundamentó:

La reducción del nitrato {N0-3) aNitrito (N0-2) y eventualmente a gas Nitrógeno (N2) es un proceso
de respiración anaerobia (la bacteria obtiene oxígeno [Link]. nitrato) catalizado por una
enzima nitratasa o áitrafo reductasa, .en el cual el último aceptar de hidrógeno en la cadena
respiratoria es el nitrato.: Esto es característico de microorganismos anaerobios o anaerobios
facultativos. Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos.

',.,-/

Procedimiento:

Para investigar esta modalidad respiratoria de los microorganismos se utiliza un medio que
contiene: peptoná, éxtracto de carne, fosfato de sodio, nitrato de potasio, agar, glucosa y agua
destilada. Se siembra con asa y se incuba 24--48 h a 37ºC. Después del período de incubación se
agregan algunas gotas de las soluciones A y B más abajo indicadas.

\.._./
_Reacción positiva: color rojo del medio a los 30", indica que hay nitrito presente en el medio.
Reacción negativa: no hay aparición de color.
,, /

.__ __,,

Al estar negativa la pruéQa se debe agregar polvos de zinc para [Link] si los nitratos del medio
éstáÍl intactos ó han sido reducidos hasta Ni o ainonio. En_ este casosi apareée un color rojo
significa que el ziñc activó los nitratos intactos del m~dio,· réduciénd~los a nitritos, dándose la
prueba cómo négativ·a. Por el contrario, si no hay aparición de color la - prueba se considera _.
---.,
positiva ya que significa que losnitratos fueron reducidos a gas nitrógeno o amonio. 1
·'-./
,

. '- ./

Reactivo de nitrato: .'- ~/.

Reactivo A- alfa naftilainina

Reactivo B - ácido sulfanílico \.___ ,/

\ • ../1

\.__ _,...

,
Medio Nitrato: Fórmula (en gramos por
litro)_ Instrucciones
Extracto de Carne 3 ,. Mezclar los componentes calentando a .
Peptona 5. ebullición durante 1 o 2 minutos.
Nitrato de Potasio (K!'.J03) 1 Distrib_uir a razón de 3. ml en tubos y
Agar 2,5 esterilizar en autoclave a 121°C durante
Agua destilada 1000 mL 15 minutos. Enfriar.
pH final: 6.8 ± 0.2

udp Escuela de '.,J

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Reactivos para la Reducción de Nitratos a Nitritos

Reactivo A: - Alfa naftilamina :5g

- Acido Acético 30% (SN) : 1000 ml

Disolver el alfa naftilamina en una porción de ácido acético por medio de un suave calentamiento.
Una vez disuelto, completar a 1000 ml con el mismo ácido. Filtrar la solución en algodón
absorbente y guardar en frasco ambarado.

Reactivo B: -Acido sulfanílico : 8g

"-
~ Acido acético 30% (SN) : 1000 ml

Disolver el ácido sulfanílico en una porción de ácido acético y luego completar el volumen a 1000
ml con el mismo ácido. Filtrar la solución en algodón absorbente y guardar en frasco ambarado.

Fundamento

En el medio de cultivo, la triptéína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenal es el
indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa [Link] carbonato amónico y
dióxido de carbono como producto final. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el
rojo de fenal del amarillo al rojo. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies
de Proteus y se usa. sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan
negativo o positivo retardado. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima
ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos qúe hidrolizan
lentamente la urea, como especies de fnterobacter o Klebsiel/a;

H~ HO
• C02 + 2 NH3
C =O+ H20 __u_re_a_s_a__
1
•.... 2
1 - -_ _ _ •_ C0 3
{NH1) 2
HiN
urea carbonato amónico

Reacción positiva: Aparición de color rosado o rojo (el amoníaco. liberado alcaliniza el medio)

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya
que especies de Proteus vuelven alcalino el medio [Link]és de la inoculación y sus resultados
deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras. que Citrobacter freundii y Klebsiel/a
/'
pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 heras de incubación.
'~
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Medio Christensen (Urea Agar Base).

jAgar urea - Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

jTripteína 1.0 !Suspender 24 g de polvo en 950 rnl de
¡Glucosa 1.0 agua destilada. Dejar reposar 2 minutos ..
!Cloruro de sodio 5.0 Esterilizar en autoclave a 121ºC durante '
!Fosfato monopotásico 2.0 _15 minutos. Enfriar a so·c yagregar 50
ml de una solución de Cirea:ai 40%
Rojo de fenol 0.012
:previamente esterilizacia por filtración.
1 Fraccionar en tubos de;hemolisis y
]Agar 15.0 ~olidificar en pico de flauta con fondo
profundo.
:·.
pH final: 6.8 ± 0.2
._j
La siembra del medio debe realizarse en la inclinación. Se recomienda no picar el fondo del tubo
para controlar el color. :
\ _..,,,

(~

Permite separar 5. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que
genéricamente se denominan coagulasa negativos.

Fundamento: 5. aureus posee dos tipos de coagulasa:

a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "dumping factor" o Factor de afinidad con el

Fibrinógeno, es una prot~ína que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente
sobre el fibrinógeno provocando la formación' de coágUlos o grumos· cuando se mezcla
una suspensión bacteriana con plasma citratado. Es probable que esta proteína sea la
responsable, en parte, de la acción antifagocitaria- de .estos microorganismos. La
determinación se realiza en lámina.

b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF), . _/

formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno

\._ _,,,/
produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Test en lámina (para Clumping Factor)

Se emulsionan una o más colonias en una gota de suero fisiológico hasta formar una suspensión
lechosa s0bre un portaobjetos. ·Luego se agrega una g0ta de plasma citratado de . conejo y se
mezdan.

Interpretación de resultados: Debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test
positivo se .evidencia por la formación de grumós. Los test negativoS: deben ser confirmados por \,_.,/

test en tubo.

Test en tubo (para la coagulasa libre)

Se emulsionan varias colonias en ún tubo con 0,5 ml d:~ plasmé3 dtratado de conejo. Se incuba a
35g C y se examina la formación del coágulo a las 4 horas .. Si es negativo se reincuba todaJa noche
y: se procede a su lectura a las 18-24 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en
alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de 5. aureus lisen el coágulo iuego de 18
horas de incubación y de esta manera se produzcan un test falso negativo.

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Interpretación de resultados: Se observa la formación de un coágulo total o parcial si el test es

positivo.

A= Positivo

B = Negativo

'~
r·

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las
·· ·bacterias aerobias y anaerobias:-facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es
Streptococcus. Esta enzima cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno molecular.

Catalasa

El peróxido de hidrógeno se forma. comd producto terminal oxidativo de la degradación aeróbica

de los hidratos de carbono. Es extremadamente tóxico y consecuentemente su acumulación
dentro de la célula puede producir un daño severo o muerte cuando no existe un mecanismo
enzimático para su descomposición.

Una reacción positiva se evidencia por la formaci_ón ·de burbujas por el desprendimiento de
oxígeno molecular libre.

Procedimiento: Verter 1 mL de una solución al 3% de agua oxigenada sobre un cultivo de 24 h en

agar inclinado y dejar el tubo en posición inclinada. La reacción es positiva si hay una rápida
ebullición de gas.

La prueba se puede realizar también con un . cultivo en caldo de 24-48 h agregando

aproximadamente 1 mL de agua oxigenada al cultivo y observar el desprendimiento de gas.
\_

Otro. procedimiento. más sencillo de

efectuar la prueba es colocando una gota
de agua oxigenada sobre un portaobjeto y
hacer reaccionar una colonia tomada con
asa de cultivo. Se observará, en caso
positivo, la aparición· de burbujas por el
desprendimiento de oxígeno (la catalasa
está presente).

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Precauciones:

Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de
no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen
cata lasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

Hay que tener presente que la catalasa no es la única enzima que actúa sobre el peróxido. La DNA
peroxidasa {enzima no citocrómica) también provoca esta oxidación. Algunas cepas de Aerococcus
y Enterococcus• tienen esta enzima y darán por lo tanto, una reacción de cata lasa falsa. Es una
'/
reacción más débil, pero que puede conducir a error.
./

'La prueba en portaobjeto debe realizarse con asa de nicrom y no de platino, ya que éste puede dar
falsos positivos. Considerar que la prueba en portaobjeto genera aerosoles.

Los cultivos para realizar la prueba deben ser frescos {18 a 24 h) de lo contrario se pueden obtener
falsos negativos. Los cultivos viejos pierden la actividad de la en~ima.

Existen cepas atípicas de Staphy/ococcus y Micrococcus que son catalasa negativa que sólo se
aislan ocasionalmente del ser humano~

Fundamento:

Hay ciertas cepas bacterianas como. Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans,

Corynebacterium pseudotuberculosis, Enterococcus · faecalis, Staphylococcus aureus y
' ./
Mycobacterium sp. que producen colonias negras en un medio que contenga telurito como
. ./
resultado de la actividad de la enzima telurito reductasa que reduce el telurito de potasio presente ~:
en el medio a telurio que es de color negro. Por lo tanto esta prueba permite identificar y
diferenciar entre especies.

Enterococcus faecalis: positivo

Enterococcus faecium: negativo

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Tecnología Mé~ica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedrp Cortés A.
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( '

udp Escuela de
;e Tecnología Médica Manual de Micr~bi~Íogía;CÍíiíÍc~ y Óiagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Esta prueba determina la capacidad que tiene un microorganismo para atacar un carbohidrato
específico incorporado en un inedio de crecimiento básico con producción o no de gases, junto
con la producción de ácido sulfhídrico.

,·

·---·-

La creg:rca:dación;:dec:g:lurcd s'3Ya};á,ei<lo
~ ~ - ~ ~ : ; ; , . , . . . ; . o . . . - ~ ~ ~ ~ produce aawb10Tdir:!f.€0,lbl'Es:ó:l:e líen?elt~;a:s,e~[Link]lrttre:di:0:cde;;;c;crlthu><cE
~~ wú:11'':;,,-,,,N·-- -~r._.;;_.;.r dí+::~?½:'~s-t.;;· .. ,.."·- -ú,,:x;v,f<.·.•~~,~V:,;,~ ~
ya que por la baja concentración de este azúcar, la cantidad de ácido formado en la superficie
inclinada del agar es escaso y se evapora rápidamente.

Procedimiento:

Para esta prueba se siembra por estría en la superficie inclinada y por picadura central la base con
el microorganismo a ensayar, se incuba a 36ºC ± 1ºC por 24 - 48 horas.
'->.-.

'
Kligler - Fórmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Peptona de carne 13.0
jCloruro de sodio ,Suspender 54.8 g del polvo por litro
5.0
¡Lactosa ¡oe agua destilada. Mezclar bien y
10.0
jTripteina -~alentar con agitación frecuente, hervir 1
10.0
o 2 minutos hasta disolución total. Llenar
1
[Link] tercera parte de los tubos de
~i :r:~!ªd¡hierro y a~~~i~---·t-21t :
ensayo. Esterilizar a 121ºC por 15
¡íiosulfato de sodio . : 0.3 ·[Link] en
pico de flauta
~~~~defenol·-~ ·~--_________

l
4
o ~ profundo. ·- . .

pH final:7.3± 0.2 •.
..
..
' '

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udp Escuela de
Tecnología Médica
TM. Mg Cs. E,win Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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udp Escuela de
Tecnología Médíca
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Interpretación:

•• Cambio de color de rojo a amarillo en todo el medio indica fermentación de la glucosa y de

la lactosa {inclinación ácida/profundidad ácida: A/ A). ·
a
• Cambio de color de 'rojo ·amarillo única merite en la pa·rte inférior del agar pero no en la )
inclinación, indica fermentación de la glucosa pero ·no· dé la lactosa (inclinación
alcalina/profundidad ácida: K/A).
• Presencia de un color negro en el fondo y rojo en la superficie indica fermentación de la .j

glucosa, µero no de la lactosa; producción de sUlfuro de hidrógeno: (K/A/ H2S),

ii · · Ningún cambio en· el color ·del agar intlica· no-fermeritacióri de glucosa ni de la lactosa
(inclinación alcalina/profundidad alcalina: K/K).
· • Ruptura del agar o formación de espacios de aire indica formación de C0 2 (gas).
• Aparición de un precipitado negro en la línea de punción indica producción de sulfuro de
hidrógeno.

'. /

!-. .: .,

¡' ,7

N°Tubo 1 2 3 4* 5
Desaminación de
aminoácido (reacción + +
•·
+ + +
. /

.~
de alcalinización)
· Fermentación de la ..
Glucosa (reacción ádda - + + + +
menor)
Fermentación de la
Lactosa '(reacción ácida - - - + +
importante)
Producción de H2S - - + - +
'· ./

Morga ne/la
Providencia
Shigella
Escherichia ·, ./

,,
Salmonella
Citrobacter'. · Enterobacter
Edwarsiella \. _,,/

Pseudomonas Salmonella Klebsiella

Citrobacter Citrobacter
Ejemplos típicos (una bacteria Proteus Serratia
Escherichia freundii
no entérica) Edwardsiella Yersinia
Klebsiella
Morga ne/la Citrobacter
Enterobacter
Hafnia
Serratia . ./
Hafnia
Yersinia
El Tubo Ces el control no inoculado con la bacteria.

* = Tubo 4: Algunos fermentadores de la lactosa que son Rojo Metilo negativo pueden
mostrar una "reversión" hacia la reacción alcalina ya que algunos productos neutrales son
formados desde el ácido. Esto aparece como se muestra en el tubo 4A donde aparece un leve
enrojecimiento de la inclinación ya que la reacción de desaminación alcalina ya no alcanza a
ser sobre-neutralizada por el ácido de la fermentación.

udp Escuela de ,.,'

Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A

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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
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Esta prueba determina la capacidad que tiene un microorganismo para fermentar la glucosa,
·· lactosa y sacarosa. El agar trip·le azúcar. hierro es un medio nutriente y diferencial que permite
estudiar la capacidad de producción de ácido y gas por fermentación de los carbohidratos ya que
incorpora un indicador rojo de fenal y él sulfato de hierro para la detección del ácido sulfhídrico.
/ ,· Es un medio útil para la identificacíón de enterobacterias_.

Fundamento:

En el medio de cultivo, el extracto de carne y-la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados
para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato n·ecesario para la producción de ácido
sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3,+, los cuales se combinan con el ·
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de· color negro. El rojo de fenol es el indicador de
pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Por la fermentación de los azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. Eltiosúlfato de sodio se reduce á sulfuro
de hidrógeno el que reacciona luego con una ?al de hierro. proporcionando el típico sulfuro de •·
hierro de color negro.
Para esta prueba se prepara el agar TSI en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2
cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción [Link] expuesta en foda su superficie al
oxígeno es aerobia y la porción infe•rror "(base) está ·protegida del aire y es relativamente
anaeróbica. La porción inclinada del _tubo qúe está expu~:sta -al· oxígeno atmosférico tiende a
tornarse alcalina (roja por el rojo de fenal) por Ja utilización aerobia de las peptonas. En el fondo
del tubo, donde no hay oxígeno, la degradación proteica es míriimá y se pueden detectar
pequeñas [Link] ácido por la aparición de un c~lor amarillo. En
aúsencia de fermentación
de carbohidratos, no se formarán ácidos y por la producción de aminas. en el pico todo el tubo
quedara rojo. Esto se da en organismos no fermentaéforés.

El medio está diseñado de tal forma que la glucosa se encuentra en una porción 10 veces menor
que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero
no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación a partir.,de la
glucosa será baja porque la concentración de glucosa es baja. Al principio se producirá .viraje del
indicador al amarillo en el tubo, pero al continuar la incubación, la inclinación del tubo retomará al
rojo por la degradación aerobia de las peptonas antes descritas. Si el microorganismo fermenta la
lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares es de 10 veces mayor, se
producirá mayor cantidad de ácido que no puede ser revirado por la producción de aminas en la
superficie por metabolismo aerobio.

La producción de H2S se da solo en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo se lee
como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la_
producción de gas, como burbujas en el fondo deltubÓ. Esta prueba se siembra por el método por
picadura a partir de colonias aisladas del microorganismo a ensayar, se incuba a 36 •e± 1 •e por 24
-48 horas.
(
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Tecnología Médica
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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

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TSI - Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones
E><:tracto de carne 3.0
l:uspender 62,5 g del polvo por litro de
jPluripeptona · 20.0
agua destilada. Mezclar,.,
bien y calentar
.,
!Cloruro de sodio '·'
5.0
,

con agitación frecuente, hervir 1 o 2

Lactosa 10.0 minutos hasta disolución total. Llenar
]Sacarosa 10.0 hasta la tercera parte de los tubos de
jGlucosa 1.0 ensayo. Esterilizar a 121°C por 15
\Sulfato de hierro y amonio 0.2 minutos. Enfriar en pico de flauta
jfiosulfato de sodio 0.2 profundo.
]Rojo de fenol 0.025
¡Agar 13.0
1
pH final: 7.3 ± 0.2

La interpretación de la prueba del TSI se ha¿e de la si~uiente forma:

• Cambio de ¿olor en ~l. medio de rojo a amarilÍo [Link]- la fe~mentación de la glucosa,

lactosa y sacarosa (inclinación ácida/ profundidad ácida: A/A.
• Cambio de color en el tercio del medio (parte inferior}, indica fermentación de la glucosa,
pero node la !actos.a ni sacarosa (inclinación alcal!na/ profundidad ácida: K/A.
• Cambio de color en dos [Link] del agar (parte inferior y m:edio); indica. la fermentación-de
la glucosa y lactosa pero no de la sacarosa.
• Ningún cambio de color en el medio indica ausencia de la fermentación de los tres
azúcares (inclinación alcalina/ profundidad alcalina: K/K).
Ruptura del agar o formación de espacios de aire indica formación de CO2 (gas a partir·de
la fermentación de los carbohidratos}. ·. ¡;
l
.
• Aparición de un precipitado negro indica producción de sulfuro de hidrógeno o ácido
/

sulfhídrico (y se adiciona en el resultado/ H2S}. - / :

Las especificaciones de la tabla y figura de las reacciones para el medio KIA (Kligler) son las mismas
. ../ ..
•
que para el TSI.

Lectura e interpretación de las reacciones en términos de medio K (alcalino) de color rojo y Medio
A(ácido) de color amarillo.

K/A
Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la
·- /
tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará· una j:>eqoeña proporción · por vía
fermentativa.· Esto_ g~ner~rá. una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las
aminas derivadas de la descarboxilación oxidativa de las proteínas.
Como resultado, el medio mantendrá su color_ rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. ~.
,../.
Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la
glucosa por vía fer~entativa, gei1erando ácidos que no ~erán neutralizados, provocándose un
descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo.

A/A
Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán también el pH d.e la
superficie del medio: Las aminas n·o· son capaces de neutraU;ar la cantidad de ácidos producidos en
esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en e·I medio a mayor concentración que la
glucosa. El color del medio en la superficie cambiará a amarillo.

K/K
Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los
azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO 2, que se elimina y no modifica el
pH.

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·•-/ ·-·•
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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

\.,:.

·C
A/A (g)
Aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.
e
e
( .
K/A(H2S}
Aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras
anoxobióticas son capaces de emplear el tiosuifato sodio como aceptor final de electrones en la
(_: cadena transportadora. Este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro
r ..
Fe 2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.

(.
Fundamento:

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el

r' desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato·
r"
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasá y deaminasa. El citrato cie hierro
y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producciónde ácido sulfhídrico. El
púrpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a
5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por la descarboxiláción de la lisina se produce la amina(:adaverina, que alcaliniza el medio y esto

produce el viraje del indicador al colorvioleta. la descarboxilación de la lisina, tiene lugar. en
medio ácido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada:

Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasá, pero que son fermentadores de la
,glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de, cultivo. al amarillo; pero a las
24 h de .·
incubación se observa la inclinación de colorvioleta ·debido~al consumo de laspeptonas, y el fondo
amarillo. ·

La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la

formación de sulfuro [Link]. · ·· ···· ·

Las cepas de los géneros [Link], Providencia y algunas cepas de Morganel/a,de saminanla lisina,
r·
esto produce un ácido alfá':céto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del
oxígeno forma un color rojizo en la superficie inclinada del medio. ··

LIA - Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones
Peptona de gelatina 5.0 !Suspender 35 g del medio desh1dratado
Extracto de levadura 3.0 ,en un litro de agua destilada. Dejar
Glucosa --···
1.0 :embeber unos 15 minutos. Calentar
Lisina 10.0 cuidadosamente, agitando con frecuencia
Citrato de hierro y amonio 0.5 . IY hervir durante un minuto hasta la
disolución completa. Distribuir y
Tiosulfato de sodio . 0.04
esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
Púrpura de bromocresol 0.02 Enfriar en pico de flauta dejando un
Agar 15.0 !fondo vertical apto para la punción.
pH final: 6.7 ± 0.2

Siembra: por punción profunda con aguja de inoculación.

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Etapas de la descarboxilación de aminoácidos:

En una primera etapa las bacterias fermentan la glucosa del medio y éste se acidifica (y por lo
tanto vira al amarillo). En una s·egunda etapa, la descarboxilasa actúa sobre la lisina, formándose
una amina (compuesto alcalino denominado cadaverina). Esta sustancia revierte el pH del medio
desde el ácido (amarillo) al alcalino (violeta o púrpura).

Para esta prueba se siembra por picadura del agar {siembra en estría en la porción inclinada y se
lleva a incubar a 36ºC ± lºC por 48 horas. Cambio [Link] color más púrpura indica presencia de la
enzima: K/K. Cambio a un color amarillo, ausencia de la enzima y fermentación del carbohidrato:
K/A.

Los colores de las reacciones posibles después de 24-48 h son:

Alcalino/ Alcalino (púrpura/púrpura) = lisina descarboxilasa positiva
Alcalino/ Ácido (púrpura /amarillo)= lisina no metabolizada =test·negativo
Pigmento rojo/ Ácido (rojo/amarillo)= lisina deaminasa positivó• ·,
•. /
.

La producción de H2S es usualmente no tan fuerte en este medio como en el caso del TSI o KIA, por
lo tanto no es un medio confiable para esta prueba.

,)

•/

LDC = Lisina descarboxilasa

•. LDA = Lisina deaminasa

LDC (-), H2S(-) LDA (+), H2S{-) LDC {+), H2S{-) LDC {+), H2S{+)

Posibilidad de Reacción 1 2 3 4*
Desaminación de la
lisina (inclinación roja
oscura) - + - -
Descarboxilación de la
lisina (reacción
anaeróbica alcalina) - - + +
Fermentación de la
qlucosa (reacción ácida) + + + + ',.J

Ejemplos típicos .. Citrobacter Proteus E. co!i Salmonel!a

Providencia Enterobacter Edwardsiel!a
Momanel!a

* Se observa usualmente H2S positivo en Salmonel/a y Edwarsiella. ·.

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Fundamento :

El medio MIO, es un cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de

levadura, peptona y tripteína. Además, la. tripteína aporta grandes cantidades de triptófano,
sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. Contiene. además
glucosa al 0;1% que es el hidrato de carbono fermentable , la brnitina es el sustrato para la
detección de la enzima ornitina descarboxilasa; el púrpura-de bromocresol es el indicador de pH,
que en medi.o alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.

La motilidad se demuestra por un [Link] del medio o por crecimiento que difunde más
allá de la línea de inoculación.

La descarboxilación positiva de la ornitina está dada por un color púrpura del medio; Debido a la
fermentació n de la glucosa se reduce él pH produciendo una condición ácidjl y originando que el
indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo.· La preserida de acidez, otorga
condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa, la cualdescarb oxila la
ornitina presente y produce putrescina y C0 2• La putrescina alcaliniza el medio, con el consecuente
viraje del indicador hacia el color púrpura:

El indo!. es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima
triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac,
indica un resultado positivo. Esta prueba debe realizarse después de leer la motilidad y la
descarboxilación de la ornitina.

'
\

'
\ Nº Tubo (los tubos están de a pares con
reactivo de Kovac añadido al tubo de la 1 2 3
derecha de cada oar)
Desaminación de aminoácidos (reacción
aeróbica alcalina) + + +
Motilidad (nebulosa)
Descarboxilación de la ornitina (reacción
-· + +
anaeróbica alcalina) - + +
Producción de indo! (color rojo con reactivo
de Kovacs) + - +
Fermentación de Qlucosa (reacción ádda} + + +
Klebsiella Enterobacter Escherichia
Ejemplos típicos áxvtoca aeroaenes coli

Interpretació n de la prueba:

Crecimiento en todo el medio: Motilidad positiva

Sólo crecimiento donde fue la asada: Motilidad Negativa
Medio color amarillo: Ornitina negativo
Medio color azul variable: Ornitina positivo
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 \ .... .,,,.,.:

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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Anillo rojo al agregar reactivo de Kovacs: Indo! positivo

No se observa anillo rojo al agregar reactivo de Kovacs: Indo! negativo

RESUMEN DE LAS PRUEBAS DEL TSI (O KIA) / LIA / MIO

Estas pruebas están destinadas para la identificación de Enterobacterias. Las características de

· cada una de ellas se resumen en la siguiente tabla:

Kligler lron Agar (KIA) Motilidad lndol

.. '
& Triple Sugar lron Lysine Jron Agar {LIA) Ornitina (MIO)
(TSI) Agar Medium
Fuente de
..
aminoácidos que Peptona,
Peptona, Peptona,
pueden ser Proteosa peptona,
Extracto de levadura Extracto de levadura
desaminados Extracto de carne,
Lisina Ornitina
(reacción de Extracto de levadura
..
alcalinización)
Aminoácido añadido
para revelar su ,./

descarboxilación Ninguno Lisina Ornitina

(reacción de
alcalinización)
Azúcar (es) Lactosa (1%),
fermentables .Sacarosa {1% en el
Glucosa (0.1%) Glucosa (0:1%)
(reacción de TSI),
acidificación) Glucosa (0.1%)
Púrpura de Púrpura de
Rojo Fenol: bromocresol: bromocresol:
Indicador de pH ácido= am¡¡rillo ácido= ámarillo, ácido= amarillo,
alcalino = rojo alcalino= púrpura alcalino= púrpura
(morado) (morado)
Fuente desde donde
el H2S puede ser Tiosulfato de sodio Tiosulfáto·de sodio Ninguno ~.
'. ' ./
producido
Indicador de · Citrato de amonio . Citrato [Link]
Ninguno
producción de H2S férrico férrico

. . ' . .

Las proteínas exógenas son excesivamente grandes para entrar en la célula bacteriana, por tanto
pár'a poder ser utilizadasdeben hidrolizarse por enzimas extracelulares de tipoproteolítico. Estas
enzimas son secretadas poíciertas bacterias lo cual es utiliz~do para identificarlas.

El catabolismo de las proteínas por enzimas proteolíticas es un proceso en dos etapas:

,j
•· ·POlipéptidos
Proteína + agua ---~p,__r_o_t_e_in_a_s_a_____
:.-

• Aminoácidos
Polipéptidos + agua ____,P,__r_o_t_e_in_a_s_a____:·._

Para investigar la capacidad proteolítica de un microorganismo sé utilha la hidrólisis de la g~i~tina ..

Entre sus aplicaciones, cabe· destacar la diferenciación de: ··

Listeria monocytogenes H y especies de Corynebacterium (en su mayoría+)

Pseudomonas aeruginosa (+ más rápida) y especies de Serratia (+).

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.~.
 - - ~ - - - --------L.-~.•-'- --------··-~·- ··---

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Existen varias técnicas para esta prueba, teniendo en cuenta que la gelatina es una proteína que a
temperatura ambiente (20-25º() es sólida (gel) y por encima de 28ºC se licua.

Técnica de siembra en placa

Medio Gelatina

Agar Base sangre : 20g

Gelatina : 20g
Agua destilada : 500 ml
' . .
Preparar 1 litro de agar base sangre. Disolver 40 g de gelatina en una pequeña cantidad de agua
hirviendo (tomarla del agua utilizada para la preparación del agar nutritivo). Mezclar ambas
soluciones. Llevar a pH 7.2. Esterilizar durante 20 minutos a 120ºC.
\ ___ ,

Cloruro mercúrico ácido

Cloruro mercúrico (HgCh) : 15,0g

\,._ __ Ácido clorhídrico concentrado : 20,0 ml
Agua destilada : 100 ml

PROCEDIMIENTO:
lriocule con asa haciendo una estría en la superficie del medio. Incube a 37°C por 2 a.7 días.

RESULTADOS:
Cubra la placa con el reactivo precipitante de proteínas (Cloruro mercúrico ácido). Un _prncipitado.
\
~
blanco indica presencia de gelatina no liidrolizada; la ausencia del precipitado· en la región de
crecimiento [Link] indica hidrólisis de la_ gelatina.. ·
'.
,_
'

Crecimiento en Medio Frazier

antes de· añadir el reactivo de
Cloruro mercúrico ácido.

Resultado negativo. Resultado Positivo.

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Fundamento:

En el medio de cultivo,· la'tripteína es la fuente de nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes

necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. ·El ácido desoxirribonucleico {ADN), se
en'cuentra en· grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa
-. (DNAsa), la cual lo hidroliza; El cloruro de sodió mantiene el balance osmótico Yel agár es el
· agente solídificante:Este'médio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima
desoxirribonudeasa (DNAsa) de ·aquellas que no lá poseen. ·

jAgar DNA - Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones -

jTripteína 20.0 Suspender 42 gramos de polvo en 1 litro
\Ácido desoxirribonucleico 2.0 de agua destilada. Llevar a ebullición para
[Link] de [Link] 5.0 disolución completa. Autoclavar a 121 Q(
durante 15 minutos. ·Distribuir en placas
1Agar.
15.0 de
1 Petri estériles.
1 pH final: 7.3 ± 0.2

La actividad de la enzima termoestable DNAsa se ha demostrado 'fundamentalmente eri los

géneros Staphylococcus, Serratia y Moraxella y consiste en la propiedad de degradar el DNA a
fracciones de menor peso molecul_ar'. Weckman y Catlin demostraron 1~ _estrecha correlación enfre
· la ptbducción d·e DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa.
. , . . .
· Método: se utiliza el medio comercial para DNAsa. Se realiza una estría con la bacteria y se incuba
24 h a 37°C. Se revela con la adición de HCI 1 N, con lo cual el DNA hidrolizado presenta
transparencia, mientras que el DNA polimerii:ado, precipita ·v torna opacidad al medio de cultivo.
En vez de HCI 1 N se puede incorporar alniedio indicadores como azul de toluidina o verde ·de '-,·/

metilo {viran a rosado cuando eltéstes positivo).

Interpretación: ·es positiva cuando aparece un halo transparente alrededor del crecimiento
.· bacteriano. En ausenda de halo sé interpreta cómo negativa. Es muy útil para diferenciar entre ~- j

es'pecies de Neisseriá (-) y Moraxella catarrhalis (+).

Positivo:$. qureus, Serratia marcescens y fv1oraxelfa catarrhalis

Negativo: S. epidermidis, Neisseria:

'- .. /

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Tecnología Médica 48 , · _·,,
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\.../

e
(
/-',
Fundamento:
(
\___..

El medio basal 0/F., fue desarrollado por Hugh y Leifson, para evidenciar la importancia del
significado taxonómico del metabolismo oxidativo-fermentativo de_los hidratos de carbono por las
L
í -. bacterias Gram negativas. Cuando una bacteria es inoculada en 2 tubos del medio 0/F.
\
conteniendo el mismo hidrato de carbono, y uno de los 2 tubos es sellado con vaselina o parafina
antes de la incubación, se puede diferenciar bien el metabolismo oxidativo o fermentativo, así
,' ' como la no utilización de un hidrato de carbono por la bacteria en estudio. El medio es semisólido.
\'---

En el medio de cultivo, la adición de una alta concentración de un determinado hidrato de

e carbono, hace que los-microorganismos utilicen para su desarrollo dicha sustancia, evitando que
e bacterias aeróbicas utilicen la tripteína presente con la consecuente producción de reacción
alcalina, la que se neutraliza por la ligera acidez producida por un microorganismo oxidativo.
e
e El fosfato dipotásico ·agrega capacjdad_ reguladora_, el cloruro de sOdio mantiene el bálance
e osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo en medio ácido.
El contenido de agar, da la propiedad de ser un medio semisólido, y permite determinar la
(
\___..
movilidad y la distribución de los productos ácidos en el medio de cultivo. La glUcosa es el hidrato·
de carbono mas frecuente que se agrega al medio bas_al 0/F., pero también pueden agregarse
( otros azúcares, como lactosa, sacarosa, maltosa, manito! o xilosa, entre otros.

Por oxidación o fermentac.ión de un determinado hidrato de carbono, se acidifica el medio y el

indicador de pH vira del color verde al amarillo.
,·
\'-
! Medio O/F - Fórmula (en gramos por
:1 .-
1 litro} i¡ instrucciones
¡fripteína ¡ 2.0 Suspender 9.8 g del polvo por litro de
!Cloruro de sodio 5.0 agua destilada. Mezclar. Calentar con
(
r-- agitación frecuente y hervir l minuto.
¡Fosfato di potásico 0.3
¡Agar 2.50 ·Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. A
100 mL de_ base estéril, agregar 10 mL de
.. -la solución estéril del hidrato de carbono
Azul de bromotimol 0.03 [al 10% (alternativamente agregar el
:hidrato de carbono antes de esterilizar y
e ¡autoclavar a 118ºC durante 10 minutos).
e ¡' pH final: 7.1 ± 0.1

Siembra: inocular, por cada_ hidrato de carbono que se use y para cada bacteria en estudio, 2
tubos conteniendo el medio .0/F: yel mismo hidrato de carbono: A partir de uri cultivo puro de 18-
24 horas del microorganismo en estudio, preparar un inóculo poco denso y sembrar utilizando
aguja de inoculación. Picar hasta aproximadamente 1 cm del fondo. Agregar a un solo tubo 1 _ó 2
( .
mL de vaselina o párafin~ fundida estéril, para excluir el oxígeno: Incubar a 36 ± lºC por 24-48 h en
\_ aerobiosis. · -
'
,,_

Las bacterias utilizan los hidratos de carb~no por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u
oxidativo. Algunas bacterias pueden·metabolizar un hidrato de carbono (como se demuestra en la
producción de ácido) solo en condiciones aerobias, mientras que otras producen ácido tanto
aerobio como anaerobio.

La fermentación es un proceso anaerobio que requiere la fosforilación inicial de la glucosa antes

de la degradación a una mezcla de ácidos relativamente fuertes, mientras que la oxidación en
ausencia de compuestos inorgánicos como el nitrato y el sulfato, es un proceso aerobio estricto

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V - TM. Pedro Cortés A.

' '

---, ----- --••-s-------••------,...---•-------•• - - - - - - - - - - - - - - - - - -

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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Ediciéin N°7 - 2014

' /

que involucra la oxidación directa de una molécula no fosforilada de glucosa (inicialmente). La

fermentación produce mayor acidez que la oxidación. La principal diferencia entre el metabolismo
fermentativo y metabolismo [Link] de un hidrato de carbono es el requerimiento de oxigeno .,.__.,./

atmosférico y la fosforilación inicial.

Cuando se habla de esta prueba sin especificar nada, hay que suponer que el test se ha hecho con
glucosa, así, cuando se dice que un microorganismo es oxidante o fermentador se sobreentiende
que lo es con respecto al metabolismo de la glucosa.

La prueba se realiza en dos tubos con medio semisólido y rectos, que inicialmente son de color ~.·
_J
verde (el indicador utilizado es azul de bromotimol). Se inoculan por picadura en el centro del tubo
y uno de ellos se recubre con parafina líquida estéril (que impide el contacto del medio con el
oxígeno atmosférico y da por lo tanto el ambiente anaerobio).

Base= Medio base OF sin el azúcar (glucosa).

Es el control. No debe haber cambio de
coloración.

Dex/pos = Ácido de Glucosa(+) en los tubos

con y sin aceite mineral. Por lo tanto es un
metabolismo fermentativo, O/F +/+.
Ej: Escherichia coli.

. /

Base = Medio base OF sin el azúcar (glucosa).

Es el control. No debe haber cambio de
coloración.

Dex/[Link] = Ácido de Glucosa(+) sólo en 91

tubo sin aceite mineral (condición aerobia de
incubación). Por lo tanto la bacteria en
cuestión es un No Fermentador (metabolismo
Oxidativo), O/F +/-.
Ej: Pseudomonas aeruginosá.

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 _,L._---------~----

udp Escuela de -_,- ., -. ..:.-""· '.. :•.''~ ·'- . : ~

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- La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los

estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es,
químicamente, un derivado de la cumarina {6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su
estructura pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están constituidos por dos residuos
unidos por un puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de [Link] residuos es glucosa y el otro
- la 7-hidroxicumarina {que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona). -

GUcosa +escF::+
Escú!rna
Complejo negro

Fundamento:

Las bacteria_s_capaces de des?rroJlar en_ bilis {4%} y también hidrolizar esculina, producen glucosa y
,,- esculetina a partir de la esculina y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por
formación de un complejo marrón oscuro o negro.

!
)BILIS ESCULINA - Fórmula (en gramos por litro)
¡ Instrucciones
j Extracto de carne 3.0
j Peptona de carne 5.0 Suspender 64,5 gen un litro de agua
! Bilis de buey destilada. Dejar reposar 5 minutos.
40.0
( Calentar a ebullición hasta su completa
Esculina 1.0
(
disolución: Distribuir en tubos o frascos y
Citrato férrico 0.5 esterilizar 15 minutos a 121 ºC.
Agar 15.0
( pH final: 6.6 ± 0.2

Procedimiento
Se siembra por estría la bacteria en estudio en placas o _tubos en pico de flauta del medio bilis-
esculína. Se incuba a 36 ± lºC ~urante 24 a 48 horas.

('
Interpretación
La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. _ _
• La reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento en más de la mitad del plano
inclinado dentro del período de incubación o un halo marrón oscuro o negro alrededor de
las colonias en placa. ·
í -
''--- • La reacción negativa se obtiene si menos de la mitad del plano inclinado se observa
/"'•
1
ennegrecido o todo el medio permanece sin coloración: dentro del período de incubación.
\_

('
'---

(
\_

e
(' Positivo: Enterococcus faeca/is y
~

,- - Streptococcus grupo D.
1

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TM. Mg Cs. Eiwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

,-
 - - -- ~... ·-~-- - t

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Fundamento:

Se. trata de. un medio altamente selectivo debido a s.u alta concentración salina (7,5%). Los
Staphylotoccus coagulasa positiva hidrolizan el manito! acidificando el medio; las colonias
aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Staphylococcus saprophyticus puede ser
positivo a esta prueb¡:i.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono,

nitrógeno, vitaminas y minerales, el manito! es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de
sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la
microbiota acompañante, y el rojo fenol es el [Link] de pH.

Las .bacterias que crecen. en un medio c:on alta concentración .de sal y fermentan el manito!,
producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al
amarillo.

Los Staphylococcus crecen ~n altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.

Staphylococcus aureus fermenta el manito! y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de
una zona del mismo color.

Los Staphylococcusque no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de

una zona del mismo color o púrpura.
_.,, . . . . . . . -:v·-· n¼ ~ - _ , , · . . . , · ~ -• .,,· ;;~

MANITOL SAL - Fórmula (en gr~mos por 1

litro) · Instrucciones
Extracto de carne
-· ~
l 1.0 _Suspender 111 g de polvo por litro de
Pluripeptona 1 10:0 agua destilada. Reposar 5 minutos y
:
d-Manitol 1 10.0 mezclar calentando a ebullición durante 1
Cloruro de sodio
...H_..._,__
-
l 75.o ·o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en
·-· . ·-¡-"'·--· -·---- .
Agar ¡ 15.o ·autoclave a 118-121ºC durante 15
Rojo de fenol 1. 0.025 minutos.
j pH final: 7.4 ± 0.2
1

Siembra: sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.

Incubación: durante 18-24 horas a 35-37 ºC; en aerobiosis.

El medio Manito! Sal es un medio de cultivó selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y
diferenciación de Staphylococcus. Es recomendado para el aislamiento de Staphylococcus
patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de
importancia sanitaria.

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se
dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies
pueden no desarrollar.

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. ·-- -----L.-_,_..___~-~-----~ -

udp Escuela de
r· ,_ Tecnología Médica Manual de Microoidogía Clíríiéa y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
~-
-"
\,___,,-

19,PYR
e
Fundamento:

La prueba consiste en determinar la presencia de la enzima 1-pirrolidonil arilamidasa a través del

uso de discos que contienen el sustrato pirrolidonil-b eta-naftilam ida. Las bacterias que contienen
dicha enzima, pueden hidroliiar el sustrato presente en-los discos en forma rápida, con liberación
e del grupo pirrólico, el cual, reacciona con el reactivo revela'dor: N-N dimetilamino cinamaldehído.

Esta es una prueba presuntiva específica tanto para Streptococcus ~ hemolíticos del grupo A, como
e para los Enterococcus spp; y permite diferenciar Streptococcus del grupo A de otras especies de
( ',

'·'--'
Streptococcus. Es altamente sensible y reemplaza a la bacitracina y a la prueba de tolerancia a la
sal {crecimiento en NaCI al 6.5%).

A menudo se usa esta prueba junto con la prueba de leucina~aminopeptidasa {LAP). Debe tenerse
en cuenta que algunas especies de Staphylococcus (S. /ugdunensis, S. scheleiferi, S. haemolyticus y
S. intermedius) son generalmente PYR positiva, por lo que se puede utilizar para diferenciar
Staphylococcus.

Procedimiento:

Siembra: a partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en 50 µL de solución fisiológica
estéril en un tubo estéril, y agregar un disco de PYR.

Incubación: durante 30 minutos a 35-37°C, en aerobiosis. Cuando se utiliza para diferenciar

Staphylococcus, la incubación se debe realizar, según algunos investigadores, durante 2 horas a
35-37 ºC, en aerobiosis.

('
\_

- Agrega una gota de reactivo revelador.

- Dejar a te_mperatura ambiente, hasta 5 minutos.

Resultados
e
·- Positivo: observación de color rosa-rojo en el disco.
Negativo:·e1 disco permanece incoloro o de color amarillo
(' '

\_
Resultados
í'
\_ Positivo: observación de color rosa-rojo en el disco.
Negativo: la suspensión y/o el disco permanecen ii1co1oros o de color amarillo.

_ Microorganismos Hemólisis , PYRasa

Disposición
Streptococcus grupo A B + Pares o cadenas
Streptococcus grupo B B,y,a - Pares o cadenas
''-
Streptococcus grupo C B - Pares o cadenas
Streptococcus grupo G B - Pares o cadenas

-,
S. grupo viridans a,y - Pares o cadenas
j Enterococcus spp. a, B, y + Pares o cadenas
''-
jstaphylococcus lugdunensis y +. Racimos
¡ Gemella spp.
i a,y + Pares, tétradas, cadenas, acúmulos
Aerococcus viridans a,y .+ Pares, tétradas, acúmulos
Arcanobacterium
haemolyticu m B + Bacilos

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:•,,.t .... ,·' ..,-·'

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PRUEBAS COMPLEMENTARIAS UTILIZADAS PARA IDENTIFICAR

ESPECIES DE Streptococcus y Enterococcus:
- /.

Fundamento: los Enterococcus resisten altas concentraciones de NaCI (6,5%) y por lo tanto,
crecen en abundancia en estos medios. Streptococcus agá!actiae· (del grupo B) también puede
[Link] esta concentración de sal. Los Streptococcus del grupo D no son capaces de crecer en este
medio, por lo tanto esta prueba es útil para diferenciarlos dé Enterococcus, ya que ambos son bilis
esculina positivos. ·

Técnica: inocular un caldó nutritivOcon 6,5% NaCI. Incubar a 35ºC por 24-48V 72 h.

Lectura: Tolerancia al NaCI: solamente si se observa crecimiento (turbidez) en el medio.

Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina {5 µg). Es útil para

diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus alfa
hemolíticos (resistentes). ·
' ',/

Técnica: sembrar masiva merite Una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de
agar sangre y colocar en la superficie de la placa los discos de optoquina (5 µg). Incubar a 35 ± 2ºC
dura_nte 24 ho_ras en jarra de microaerofilia.
, /
~.-
Lectura e interpretación de los resultados:

En caso de que el microorganismo sea sensible a

la optoquina, se observa un halo de inhibición
alrededor del disco, El. tamaño del halo depende
del diámetro del disco comercial y del fabricante.
Para un producto Difco, el disco es de 6 mm, y se
considera Sensible con un halo de ~14 mm.
Cuando se obtienen halos entre 6 y 14 mm se
debe realizar como prueba confirmatoria la
solubilidad en bilis; de esta manera se descartan
las especies alfa hemolíticas que presentan zonas
intermedias de inhibición.

Fundamento: Las sales de bilis específicamente el desoxicolato y el taurocolato de sodio tienen la

capacidad de lisar Streptococcus pneumoniae, cuando se adicionan a una suspensión de un cultivo
fresco de esta bacteria de 18- 24 horas en agar sangre de cordero al 5%. Esta prueba se utiliza para
diferenciar entre S. pneumoniae que es soluble en bilis de otras especies de Streptococcus alfa
hemolíticos, "insolubles" en bilis.

S. pneumoniae produce enzimas autolíticas que son las responsables de la característica

umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La adición de la solución de sales de bilis a la
suspensión de la bacteria, acelera el proceso de lisis, proceso asociado con la disminución de la
tensión superficial entre el medio y la membrana celular bacteriana. La prueba de solubilidad en
bilis se puede realizar a partir de cultivos en caldo o en agar sangre ovina al 5%. Dado que la
solución de desoxicolato de sodio puede precipitarse a pH de 6,5 o menor, cuando se realiza la

udp Escuela de
Tecnología Médica ,_.,/
TM. Mg Cs. E,win Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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Tecnología Médica , 54 · .. · . : ·.
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 ·• 2014

r· prueba de solubilidad en bilis a partir de cultivos en caldo, el medio debe alcalinizarse para evitar
una reacción falsa negativa.

Prueba directa en tubo

Requerimientos:
í'
• Cepas control positivo: 5. pneumoniae ATCC 49619.
• Cepas control negativo: 5treptococcus_ grupo .viridans.
(.
• Solución de desoxicolato de sodio al 10%
• Solución salina estéril (NaCI 0,85%)
• McFarland N° 1 (2x10 8 UFC/ml)

Nota: Si la colonia elegida para la suspensión en solución salina es granular,. realice un subcultivo
(' en caldo de Todd Hewitt e incúbelo toda la noche, esto ayudará a la mejor realización e
interpretación de la prueba. Cuando el crecirriiento es pobre, adicione una pequeña cantidad de
r·
suero bovino o equino al caldo de Todd Hewitt para enriquecerlo.
í'

í'
Procedimiento
('

• A partir de un subcultivo puro, prepare una suspensión densa del microorganismo en solución
r· salina estéril, con una turbidez igual al N° 1 de la escala de Me Farland. .
• Para cada bacteria tome dos tubos de 12x75 mm, marque un tubo como tubo prueba (P), y el
otro como tubo control (C).
r· • Coloque en cada tubo 0,5 ml de la suspensión salina de la bactria; al tubo prueba (P) adicio~e
0,5 mL de desoxicolato de sodio al 10%v al tub9 control (C) adkione 0,5 ml de solución salina
estéril (0,85%). · . .
• Mezcle suavemente los tubos e incube a 37°C en el baño María, o a 35ºC en la incúbadcira por un
( período de 2 h.
í • Examine la lisis del cultivo por aclaramiento del mismo después de 1, 2 y.3 h·de incubación. La
claridad o transparencia ocurrirá en el tubo con él contr-;I. positivo y la solución de biÍis
· (desoxicolato de sodio al 10%). El control negativo deberá permanecer turbio. .
• Lea el tubo control (bacteria más la solución salina) el cual debe estar turbio, comparándola con
el tubo de prueba. Un resultado de solubilidad parcial es interpretado como positivo. ··

._
('
Control de calidad

Siempre incluya un control positivo y negativo.

· · Control positivo 5. pneumoniae ATCC 49619
('
Control negativo 5treptococcus grupo viridans.

r·
Preparación Desoxicolato de sodio al 10%
(

Reactivos:
Desoxicolato de sodio : 10 g
Agua destilada o des ionizada : 100 ml

Mezcle y agite hasta disolver. Esterilice por filtración. Dispense 10 ml (cantidad aproximada) en
í
tubos estériles. La duración a temperatura ambiente son 6 meses.

r·

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

Í'

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014

'/ .
Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina {0,04 U). Es útil
para diferenciar Streptococcus pyogenes {grupo A de Lancefield), sensible a la bacitracina, de otras
~-
'· ./

especies de Streptococcus beta hemolíticos{grupos B, e, D, F, G) tjue son resistentes.

Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar o una suspensión de
la bacteria en caldo, en Una placa de agar sangre y colocar sobre la placa los discos de bacitracina
{0;04 U). Incubar_ a 37Q durante 24 horas. · --~

Lectura e interpretación de los resultados:

· La aparición de cualquier halo de inhibición del

crecimiento alrededor del disco se considera una
prueba positiva (no importa el diámetro del halo).

Esta ..técnica tiene 5% de falsos negativos y entre

10 y 20% de falsos positivos ya que hay otros
estreptococos (grupos C y G), que también son
susceptibles.

[Link]: los_ Streptococcus _ del grupo B (5. agalactiae) producen una sustancia denominada
,"CAMP factor", que realza o magnifica la beta-lisina o esfingomielinasa C de los Staphylococcus,
apareciendo una zona de lisis mayor en el punto de contacto de los microorganismos. El C_AMP
factor es un antígeno proteico termolábiL

Técnic;a: en una placa de agar sangre de cordero trazar una sola estría de Streptococcus en sentido
perpendicular a una estría de de una cepa de Staphylococcus aureus productora de beta-lisina
(ATCC 25923), sin que ambas estrías se pongan en contacto (aproximadamente 1 cm entre
ambas). Incubar en aerobiosis o en microaerofilia {10% C0 2 ) por 5-6 ha 37ºC o hasta 48 h.

Lectura: CAMP · positivo: una zona de

mayor lisis, con forma de punta de flecha
en el punto de contacto de los dos
organismos.

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Tecnología _Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro. Cortés A.

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udp Escuela de
Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

En términos generales, las Drogas o Agen~es antimicrobianos se defineri como compuestos

químicos que matan o inhiben el crecimiento de microorganismos, pudiendo ser naturales o
sintéticos. Si son de origen natural se les denomina Antibióticos y si son de origen sintético se les
denomina Quimioterápicos.

Específicamente, los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados
por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros
microorganismos.

CARACTERÍSTICAS GENERALES

1. Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).

2. Son efectivos a bajas concentraciones. .
3. Poseen toxicidad selectiva:' actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador.
4. Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas.
5. Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro.
6. Solubles en agua.
7. Poseen estabilidad química.
8. Son productos del metabolismo secundario.

Es importante tener en cuenta la posibilidad de apancIon de resistencia a determinados

antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección.

Al aislar un microorganismo desde una muestra clínica en los medios selectivos y diferenciales, el
paso que sigue es la identificación de éste por medio de baterías bioquímicas. Paralelo a este
procedimiento se debe efectuar un antibiograma,-donde se determinará la susceptibilidad a los
agentes antimicrobianos del microorganismo aislado e identificado.

La determinación de la susceptibjlidad de los microorganismos a los agentes antimicroblanos es

de gran importancia para el uso racional de ellos y estudios epidemiológicos.

Sin embargo, los resultados de tales determinaciones no presentan valores absolutos, debido a
que están influenciados por una serie de variables tales co·mo:
Densidad del inóculo
Constitución química del medio y pH
Requerimientos de 02 del microorganismo
Tiempo de "incubación
Pureza de la cepa
Grosor del agar
Conservación de antimicrobianos

a) Medio de cultivo: se utiliza agar o caldo Müeller-Hinton, el cual está libre de cationes
inhibidores y contiene agar purificado.

b) Profundidad del agar: el grosor del agar debe ser de 4 mm, ya que hay variaciones de tamaño
del halo de inhibición que dependen del grosor de la capa de agar en que se realiza la prueba y
también el antibiótico. El volumen de agar se calcula en relación con el diámetro de la placa Petri
según la siguiente fórmula: h =altura v =Volumen r = radio

V ff = 3,14
h= = cm

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Tecnología Médica
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---··---·1--·-- -·----------·-----------~----- --~-

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

, ___,/
Po_r Jo tanto, el volumen de agar a agregar a una placa será:.
-- ,J

V= h X nx r2 h = altura (cm) V= Volumen (cm 3 = ml) r = radio (cm) ·-../

gr= 3,14

-----/
e) Requerimiento de 02: los microorganismos frecuentemente aislados en microbiología médica
son aerobios, por lo tanto los test de susceptibilidad se han estandarizado bajo esta condición.
. /

d)i Tiempo de incubación: los antibiogramas deben incubarse a 35-36ºC por 18 h. Incubaciones
prolongadas pueden inactivar ciertos antibióticos.

· Existen tres pruebas básicas para determinar la susceptibilic!ad antimicrobiana:

1.-Méfodo de difusión en agar(elque realizará Ud .. en el°labórator'ió)

·2.- Método de dilución en caldo '.,/

3.- Método de dilución en agar

'- .. /

Método de difusión en agar o método de Kirby-Bauer:

El principio de las pruebas de difusión por disco ha sido ·utilizado por más de 70 años ·en_ los
laboratorios de ·microbiología: Alexander Fleming utilizó una 'variante de esta técnica cuando
. trabajaba -éon la penitilina en los años· cincUenta. En ese tiempo, ¡,·abía tant~s procedimientos
·diferentes en usó como microbiólogos. Los doctores Báuer, Kirby, Sherris y Turck probaron
minuciosamente todas las variables involucradas en el proceso; tales· como los medios de cül_tivo,
'la temperatura y el espesor del agar. En 1966, ellos publicaron su estudio cimero describiendo la
prueba que se usa en la actualidad.

El' Instituto para la Estandarización· de Labor¡¡torios Clínicos (CLSI) adoptó· los pasos básicos del
procedimiento descritos· en el estudio de Bauer como el método de referencia para difusión pÓr
· .-.. disco. Estos. pasos deben seguirse en forma minuciosa para obtener resultados precisos .

.Una vez que se han aislado colonias de un organismo que ha sido identificado comO patógeno
potencial, es necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de susceptibilidad:

1. Seleccionar las colonias

2. Preparar una suspensión del inóculo
3. Estandarizar la suspensión del inóculo
4. Inocular la placa
5. Colocar discos de anti microbianos
6. Incubar la placa ,,....___
7. Medir las zonas de inhibición \ ___,./

8. Interpretar los resultados

·...._ .,./
Existen dos métodos para la preparación de inóculo: suspens1on directa de _ colonias y fase
logarítmica de crecimiento. Sólo el método de suspensión directa de colonias proveerá resultados
precisos para ciertos organismos. En ambos métodos, la turbidez de la suspensión debe ser
estandarizada (para que sea igual) al estándar 0,5 de Me Farland (lo que corresponde a
aproximadamente 1,5 X 108 UFC/mL). Las suspensiones así ajustadas deben utilizarse como
inóculo dentro de los 15 minutos siguientes.
Nota: Los estándares de Me Farland están hechos ya sea de sulfato de bario o partículas de látex.
Si usa sulfato de bario, agite antes de usar, si usa látex, invierta para mezclar.

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Para el método de suspensión directa de colonias, las colonias no deben

sobrepasar las 18-24 horas de aislamiento. Estandarice el inóculo al mismo
tiempo que prepara la suspensión. Suspenda las colonias en solución salrria o
caldo (ej. Müeller-Hinton o soya tríptica). Luego, ajuste el inóculo a una
turbidez equivalente al estándar 0,5 de Me Farland. Puede comparar la
turbidez de las suspensiones poniendo los tubos frente a un papel blanco o
/' ' una tarjeta de archivo con líneas negras.

Use suspensión directa de colonias Pª!~ los siguient~s organismos:

• Todos los estafilococos
• Bacterias fastidiosas que tienen crecimiento impredecible en caldo: ej., estreptococos

Preparación de placa y discos: Retire el contenedor de discos del congelador o refrigerador. Antes
de abrir el contenedor, permita que los discos se equilibren a la temperatura ambiente durante
una a dos horas para minimizar la condensación y reducir la posibilidad de que la humedad afecte
la concentración de los agentes antimiciobianos.
Permita que la placa de Agar MüeUer-Hinton (MHA) _,ame la temperatura ambiente para que
cualquier exceso de humedad se absorba de~tro del medio. Este proceso se puede acelerar
•• 1 • •

poniendo las placas entreabiertas en el incubador de 37ºC por 10-15 minutos. Asegúrese que la
placa de MHA tenga la profundidad adecuada de 4 mm.

Inoculación de placa: Agite la suspensión del organismo para asegurarse que-está bien mezclada.
Luego, sumerja un hisopo de algodón estéril en la-s_uspensión. Remueva el exceso de líquiao del
hisopo presionándolo cqntra la pared del tubo.
Empézando en la parte superiqr [Link] placa ·MHA jnocul_e la superficie con la tórula. Cubra toda la
placa frotando de ida y vuelti:! de un borde al otro: Rote la placa aproximadamente 60º y repita el
procedimiento de frotado. Rote otra vez la placa 60º y frote _toda la placa por tercera vei. Esto
garantizará que el inóculo sea distri_buido homogéneamente. · ·
Sugerencia técnica: Incube la placa dentro de los 15 minutos siguientes después de haber
[Link] el inóculo. - . -

Aplicación de sensidiscos:_ C_oloque los discqs con los agentes antimicrobianos dentro
de los 15_ minutos siguientes_ a la inoculación de la_ placa MHA. Los [Link] ser
colocados uno a uno ó con un dispensador de discos multi-canal o con pinzas ..
Típicamente, se pueden aplicar hasta 12 discos en una placa de 150 mm de diámetro o
hasta 5 disco? en una pla~a de 100 mm. Presiqne_ cada disco firmemente para asegurar
el contacto completo co_n la _superficie de ·agar. No se olvide de este paso o los discos
pueden terminar en la tapa de la placa después de ·1a incubación.

Puntos que hay que recordar sobre los discos de antimicrobianos:

• No use discos después de su fecha de caducidad.
• No almacene discos en un congelador No Frost.
• Use productos aprobados por la FDA.
• Use dis_cos con el contenido especificado en los est'ándares de la CÍ.SI.
• No reubique un disco u_na vez que éste ha tocado la superficie del agar

Incubación de placas:
• Invierta las placas e incúbelas_.
• Para las bacterias nó fastidiosas, incube (en aire ambiente) a 35ºC por 16-18 horas.

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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Cómo medir las zonas de inhibición:

,./
Después de retirar la placa de la incubadora:
\ .. __/

• Examine detenidamente -la plac_a para verificar que el crecimiento sea uniforme y confluente de
tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento bacteriano.
../
Para medir las zonas de inhibición desde la parte posterior d_e la placa usando luz reflejada:
• Sostenga la placa unos pocos centímetros sobre una süperficie de color oscuro que no refleje la , __,,,/

luz.. ·
• Mida redondeando al milímetro más ·cercano cori una regia o un :calibrador.
• La luz reflejada es usada para Enterobacteriaceae, como Escherichia coli, otros bacilos Gram
negativos, Staphylococcus y Enterococcus (excepto para oxác:ilina ,;-vancomicina).
• La luz reflejada también es usada cuando se miden zonas de inhibición en agar Müeller-Hinton
sangre.

Sugerencia técnica: Cuando analice Streptococcus en agar Müeller-Hinton con 5% de sangre de

cordero, retire la tapa y mida las zonas desde la parte superior de ia placa. •.j

--·-'

En el caso que no se ~bserve Ún ·halo nítido o aparezcan: colonias en el interior del halo de
inhibición, se d_ebe medir como aparece en las fotografías a continuacion.
·\. _,./

,J

En este método el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa, y es sometido a la

acción de distintos antibióticos, loS'Cuales difunden en el agar a partir de discos pequeños de papel
'filtro impregnados con los antibióticos: Este test sirve para determinar cualitativamente ·si una
bacteria es susceptible o res·istente a la acción del antimici-obiano. ' 'J

"- _,,/

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_

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,_,., Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
:o,
Siembra de Antibiogramas:

La siguiente tabla muestra los medios, la emulsión y fa concentración de Mac Farland, en que se
realizan los distintos antibiogramas de acuerdo al tipo de microorganismo:

Microorganismo Medio para Emulsión Mac Farland

','-'
antibiograma
Enterobacterias y No Agar Mueller Hinton Caldo peptonado Comparar con
,,,.- -~ fastidiosos 0,5
Streptococcus Agar Mueller: Hinton. + Caldo Toad Hewith Comparar con
Sangre Cordero 0,5
Haemophilus Agar HTM Caldo Mueller Comparar con.
Hinton 3,0
Neisseria Agar Chocolate Caldo Mueller Comparar con
Hinton 3,0

Realizar la siembra de la emulsión por difusión, es decir, se transfiere el inóculo de muestra con
una tórula y se esparce en todas las direcciones sobre la superficie 'del agar en una placa Petri de
14 mm (ó 9 mm).

Bibliografía:

Clínica! and Laboratory Standards lnstitute (CLSI): "Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; Twentieth lriformational Supplement", MlO0-S21, Enero 2011.

La CIM es la min1ma concentración del agente. anti microbiano que inhibe la multiplicación y
producción de un crecimiento visible de una cepa bacteriana dada en el sistema de prueba.
Determinamos la concentración en el laboratorió Ú1c~harido una cantidad conocida de bacterias
con diluciones definidas del agente antimicrobiano. Utilizando los criterios de interpretación del
CLSI los resultados son interpretados como susceptible, intermedio O resistente.
Las prueb·as de la CIM pueden ser realizadas usando como medios de cultivo en caldo o agar, pero
la microdilución en caldo es el método más utilizado-en los laboratorios clínicos.

PRUEBA-E O EPSILOMÉTRICA O E-TEST:

La prueba E o método PDM de epsilómetro ha sido usado [Link] para analizar anaerobios y
otros organismos aeróbicos. El término epsilómetro [Link] a una tira fina, de 5 x 50 mm, inerte
y no porosa con un gradiente continuo exponencial de agente antimicrobiano inmovilizado en un
lado y una escala de interpretación impresa en el otro lado. El gradiente de agente antimicrobiano
cubre un amplio rango de concentración, que corresponde·aproximadamente diluciones dobles. La
pendiente de los cambios y los rangos de concentración están óptimamente diseñados para
corresponder a rangos y límites de CIM clínicamente relevantes que son seleccionados para
categorizar grupos de susceptibilidad.

Se inocula una placa de agar, que contenga un medio de prueba apto, con un organismo de
prueba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se aplican las tiras de prueba en un
patrón óptimo de tal manera que la máxima concentración en cada tira esté más cerca al borde
exterior de la ·placa de Petri. La placa es inmediatamente incubada aeróbica mente o
anaeróbicamente por el periodo de tiempo estipulado.·

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Cuando es aplicado a una placa de agar inoculada, el gradiente antimicrobiano de .la tira es
liberado inmediatamente en el agar, creando un gradiente continuo y exponencial de
concentraciones de agente antimiCÍ-obiano debajo del éje lineal dei material de soporte. Después ·~- _/

de la incubación, se observa una elipsede inhibición de crecimiento. La intersección entre el borde

de la zona de inhibición y la tira de soporte se produce en la concentración del antimicrobiano que
ya no es capaz de inhibir el crecimiento. El punto de intersección da la "con'centración inhibitoria"
(CI) en µg/mL- una medida directa de la susceptibilidad· del microorganismo al agente
antimicrobiano probado. Las CIMs se leen directamente sobre la escala en la tira de soporte.

.../

' '.__/'

•. /

[Link] de
crecimiento
Representación bacteriano -..._,/

esquemática del
método del E-test. La
1----- Epsilome!ro
POM
flecha:indica la zona
··:Zl'J'J-
donde se lee la ' 1"2·
:1:: -"Elipse de
'-._/

· C:oncentración · - f.~ • inhiblción"

o 46 •
- ;Q..
-· Inhibitoria Mínima - ;¡~ -
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• 1.0 •
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INHIBITORIA (Cl}
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ESTUDIO DE MORFOLOGÍA DE COLONÍAS BACTERIANAS

Ele'\.'llCiÓn

Puntiforme Entero.

•·•
·Plana lisa o rugosa
Circular
Ondulado EI~vada Mate o- brillante

Rlzoldé
Seca t.> eremosa

Irregular

Fllarnetttosa • Invasiva o
superficial

Una etapa importante y básica en el estudio de las. características morfológicas de una

bacteria, es la observación directa de su morfología macroscópica y microscópica.

Observación macroscópica de bacterias:

Las bacterias se pueden analizar en base a su morfología macroscópica y esta descripción

abarca los siguientes aspectos:

Una característica especial de algunos tipos bacterianos y que nos ayuda a describirlas en
forma más completa es la Hemólisis, que es la· capacidad que tienen algunas bacterias de
hemolisar los glóbulos rojos presentes en las placas de agar sangre, esto es muy usado con fines
diagnósticos. Según el tipo de hemólisis las colonias se clasifican en: gamma hemolíticas (no hay
hemólisis), beta hemolíticas (donde hay destrucción de la totalidad de glóbulos rojos), alfa
hemolíticas (donde la hemólisis es poca y se observa un precipitado verde denominado
meta hemoglobina).

Observación microscópica de bacterias:

La observación microscópica permite conocer algunas características de las bacterias como

ser: forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de cápsula, esporas, flagelos, movilidad,
etc. Constituye una etapa fundamental del estudio de las bacterias y del diagnóstico
bacteriológico.

Observación con bacterias vivas:

Al fresco
con fondo oscuro

Observación con bacterias muertas:

tinción simple
tinciones diferenciales
tinciones especiales

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Tinción Gram:

1. Haga unfrotis y fíjelo al calor de la llama del mechero (calor suave).

2. Cubra la superficie del frotis con cristal violeta, durante un minuto,
3. Lave el frotis con agua corriente dejándola escurrir. Elimine el resto de agua del
portaobjetos.
4. Cubra la superficie del frotis con lugol, durante un minuto.
S. Lave con agua corriente dejándola escurrir. Elimine el resto de agua del portaobjetos.
6. Cubra la superficie del frotis con alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos.
7. Lave con agua corriente dejándola escurrir. Elimine el resto de agua del portaobjetos.
:·[Link] la superficie del frotis con safranina, durante 30 segundos. ,.../
9. Lave con agua corriente dejándola escurrir.
10. Saque el exceso de agua con papel absorbente (sin frotar el vidrio) y séquelo al aire.
11. Observe al microscopio con objetivo lOOX y aceite de inmersión.

Informe de un frotis teñido con Gram: describir los morfotipos encontrados, es decir la morfología,
agrupación y característica tintorial.

Ejemplos:
• Cocos Gram positivos en racimos
• Cotos Gram positlvos en cadena
• Cocos Gr_am positivos lanceol_ados
• Bacilos Gram positivos en empalizada
• Bacilos _Gram negativos pleom6rficos agrupados irregularmente.
• Diplococos. Gram negativos·
• Diplobacilos Gram negativos

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Tecnología Médica 64 t, .
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Las cocáceas Gram ppsitivas· de importancia médica y de acuerdo a la clasificación

establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la Bacteriología Sistemática (año
( . 2009), fueron reclasificadas de tal manera que algunos géneros de la familia Micrococacceae
pasaron a constituir nuevas familias .. Según la .última edición del Manual, pertenecen a
Micrococacceae géneros tales como Micrococcus, Arthrobacter, Citricoccus, Kocuria, Rothia,
( .
Stomatococcus y otros). Planococcusy Kurthia corresponden ahora a la familia Planococcaceae y
se propuso la nueva familia "Staphy/ococcaceae" para el género Staphylococcus. Para efectos de
esta guía se considerará este nuevo reordenamiento.

Otras cocáceas Gram positivas como Streptococcus se mantienen en su familia

Streptococcaceae, y para Enterococcus se propuso lafamilia "Enterococcaceae".
- ··- .. · _,

La familia Micrococcaceae y "Staphylococcaceae" están formadas por cocos Gram

positivos de 0,5-2,5 µm de diámetro, de agrupación irregular,-en tanto que Planococcaceae se
agrupa en forma regular en paquetes (Planococcus). Son [Link] positivo, oxidasa variable. Son no
exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales, desarrollando con facilidad en medios de
cultivo habituales. Son parásitos facultativos o saprobios. Algunas especies son patógenas. Son
Inmóviles con excepción de Planococcus. Los géneros de Streptococcaceae v/lEnterococcaceaellse
agrupan irregularmente o de a pares y cadenas. No producen catalasa ni oxidasa. Los géneros de
._ Streptococcaceae son exigentes en [Link] de cultivo, desarrollan pobremente en medios
corrientes y la sangre o suero favorecen su crecimiento. Los géneros' de "Enterococcaceae" en
cambio, no requieren de medios enriquecidos para su desarrollo. · · ,

Algunas especies como Micrococcus luteus o Kocuria rosea, que raramente producen
infecciones en humanos, tienen características fenotípicas muy similares desde el punto de vista
morfológico y bioquímico a Staphy/ococcus, por lo que conviene saber diferenciar entre estas
especies.

( .
De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la
(
Bacteriología Sistemática (y actualizado con anexo especial Nº 5 de 2004), este orden comprende
í. 12 familias, pero sólo 3 d_e ellas tienen importancia para el ser humano: Bacilla_ceae,
"listeriaceae" y "Staphylococcaceae". Este orden forma parte de de la Clase "Bacil/i", Phylum
( Firmicutes.
,,. .
1
\

FAMILIA "STAPHYLOCOCCACEAE"
í
\_

Esta familia propuesta está compuesta de 4 géneros, de los cuales sólo Staphy/ococcus
tiene importancia para el ser humano.
(
('
GÉNERO STAPHYLOCOCCUS:
r\ __
( El género Staphylococcus ha sido encuadrado recientemente en el Volumen 111 de la
,·. segunda edición del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, en la sección de "Bacterias Gram
\.._ positivas con bajo porcentaje de contenido en G+C". Corresponden a cocos Gram positivos de 0,5 -
1,5 µm de diámetro, agrupados irregularmente o en racimos, más raramente en pares o tétradas.
Son inmóviles, anaerobios facultativos (excepto Staphylococcus saccharo/yticcus, que es

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Tecnología Médica
' TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

(
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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
~-·
.)
anaerobio estricto). Son bacterjas catalasa positivas, inmóviles, resistentes a bacitracina, oxidasa
negativa ya que poseen citocro_mos tipos a y b {excepto los miembros del grupo Staphylococcus
sciuri, que además poseen dos citocromos tipo c y por lo tanto dan l_a reacción positiva). Son
Voges-Proskauer positivo. y .resist,ente a polimixina · B. Utilizan la glucosa· en aerobiosis y
·· anaerobiosis, · slendo· está última una de las características más usadas para diferenciarlos del ~
· ../
género Micrococcus, el cual solamente oxida la glucosa. Son bacterias halótolerantes, propiedad
que se aprovecha para su aislamiento c~n altas concentraciones de cloruro de sodio {6,15%).

El género Staphylococcus _está constituido actualmente por 48 especies, siendo _las de

mayor importancia para el hombre S. aureus, S. epidermidis, s. saprophyticus y s. /ugdunensis. Se
considera que las especies S. lugqun~nsis, S. capiti, S. w_arneri, s..
schleiferi, S. haemolyticµs y S.
homini representan alrededor del 35% de los estafilococos coagulasa negativo aislados de
muestras clínicas. \
_/

Staphylococcus aureús:_
)
Al Gram se evidencia como una cocácea Gram positiva de 0,8 a lµm dispuesta en racimos,
aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos. Es inmóvil y no forma
esporas. Es anaerobio facultativo y crece bien en agar sangre a 372c. Es habitual enco~tr~r una
colonia mediana, a veces ~-hemolítica, de bordes definidos, blanca o en ocasiones dorada, _)
conociéndose también como el Staphylococcus dorado._ Ocasionalmente puede presentar cápsula
· o · capa mucosa {Slime layer). Se_ identifica con. las pruebas de la . coagulasa, manito! y
termonucleasa; para las cuales es positivo.

Ent~e los medios específicos para la recuperación de S. aureus está el medio Chapman,
que, posee manito! y ·una alta concentración de NaCI {10%) lél cual resiste bien ya que es
.· hálqtolerante. E_I NaCI impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manito! al ser
· metabolizado por el S. aureui proporciona un pH ácido al medio que provoca el cambio de color
.del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo
):osado. El medío de Baird-Parker permite el crecimiento de Staphylococcus y otras bacterias Gram
positivas, presentándose las colonias de S. aureus negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un j·.

halo brillante de 2 a 5 mm de diámetro.

~

S. aureus es un patógeno primario reconocido para el ser humano y es uno de los . _)

patógenos bacterianos que con mayor frecuencia causa infecciones intrahospitalarias. Es parte de
la microbiota normal del hombre, siendo el sitio deportación principalJas fosas nasales, por lo que
debe ser considerado como· un patógeno oportunista .. ·. La portación es un factor de riesgo
.. /

importante para la infección por esta bacteria. Puede causar una amplia variedad de infecciones:
lesiones superficiales {ántrax), infecciones sistémicas con riesgo de vida {endocarditis,
,osteomielitis, neumonía, abscesos cerebrales, meningitis y bacteriemia), y enfermedades
producidas por toxinas (intoxicación. alimentaria, síndrome de la piel escaldada o síndrome de
sh_ock tóxico). Esta es la especie más frecuentemente aislada en pro_cesos supurativos en el ser .........,
)

humano. Se le considera el colonizador inicial en pacientes con Fibrosis Quística.

Desde el punto de vista de susceptibilidad, 5; aureus presenta una creciente resistencia a

.los anti microbianos. El S. aureus resistente_ a meticilina hospitalario tiene factores de riesgo
con.oé:idos para su adquisición, que incluyen la hospitalización o cirugías recientes, diálisis, y
dispositivos vasculares. Sin. embargo, se han documentado casos de cepas resistentes a meticilina
en personas de_la comunidad saludables sin los factores de riesgo nom9rados. Puede discriminarse
las cepas de S. aureus según su resistencia a fármacos como SAMR (Resistente a Meticilina), VISA
(Resistencia intermedia a vancomicina) y VRSA {Resistente a \/ancomicina), Esta resistencia obliga a
monitorear la susceptibilidad a la meticiliha utilizando sensicliscos de oxacilina (sólo en S. aureus)
6 cefoxitin, y determinando Concentración _Inhibitoria Mínima de_ vancomicina frente a las cepas.
La· resistencia a meticili1:1_a está. mediada por un gen [Link] mecA_ que .se encuentra
incorporado en un elemento de inserción denominado SC_Cmec (Staphylococcal Cassette
Chromosome mee). En la actualidad se han identificado siete tipos de [Link] (1 al VII), de los
cuales el SCCmec tipo 1, IV, V, VI, y VII codifican sólo resistencia al grupo de betalactámicos,
mientras que los SCCmec tipo II y III generan resistencia a múltiples grupos de antibióticos. Se han
~
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Tecnología Médica
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Tecnología Médica 66 - ,' _-
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

descrito dos tipos de cepas de SAMR, una de la Comunidad y otra lntrahospitalaria. The Centers
for Disease Control and Prevention (CDC} define como cepas SAMR (o MRSA) de la Comunidad a
e aquellas cepas aisladas de pacientes no hospitalizados o dentro de las primeras 48 horas de
hospitalización, sin antecedentes de infección o colonización con SAMR, sin hospitalización en el .
( . año anterior al aislamiento, hi empleo de dispositivos protésicos permanentes. Genéticamente los
'-,
SAMR de la Comunidad poseen el SCCmec de los tipos tipo IV,'V y VII a diferencia de los SAMR
lntrahospitalarios, que poseen los tipos 1, 11, 111 y VI. Esto explica que las cepas de SAMR de la ·
· Comunidad presenten generalmente resistencia sólo a meticilina, en tanto que las cepas
lntrahospitalarias tienden a ·ser rriultirresistentes. Además, los SAMR de la Comunidad se
caracterizan por producir una exoproteína denominada Leucocidina de Panton-valentine. la cual
se ha asociado en forma primaria a enfermedades de tejidos blandos, piel, huesos y neumonía
necrotizante severa, donde la mortalidad puede alcanzar alrededor del 75%. Este factor de
virulencia no sólo está relacionado con la elevada patogenicidad de-las cepas que las producen,
sino también se está utilizando como marcador molecular para su identificación. Se ha descrito
además que las cepas productoras de. Leucocidina tienen mayor rapidez de duplicación y elevada
capacidad de diseminación.

En el caso de la resistencia a vancomicina, es mediado por el gen vanA que, según se ha

establecido, fue trasferido a través· de un plasmidio desde· Enterococcus, hecho observado por
primera vez en 2002.

Staphylocoi:cus epidermidis:

Es un Staphylococcus éoagulasa negativO, que pertenece al grupo que no [Link] la

manita y es nóvobiocina sensible:Sus características de cultivo son similares a las de S. a"'üreus. Su
colonia es blanca y raramente pigmentada.

Esta especie es sáprobia, comportándose ocasionalmente como oportunista en especial en

pacientes con procesos crónicos o con factores predisponentes. -Produce "Slifrie !ayer" {biofilm); el
cual ayuda en su adhesión y formación ·de microcolónias én las superficies de implementos
médicos como prótesis, catéteres y otras. Se estima que produce entre el 43-80% de los cuadros
por estafilococos coagulasa negativo. Es uno de los principales microorganismos tausañtes."de
endoftalmitis. Se le aisla de infección urinaria, infecciones cardíacas, endocarditis, otitis media,
etc.

Staphy/ococcus saprophytitus:

Es otro Staphylococcus coagulasa negativo de gran importancia. Es manito! variable y no

reduce los nitratos a nitritos; Es resistente a la novobiociná (disco de 5 µg}: En agar produce
colonias blancas y raramente amarillentas o anaranjadas. Su hábitat es la- piel y superficie de
animales.

Es un importante agente causal de infecciones agudas del tracto urinario en mujeres

ambulatorias en edad sexual activa y está considerado como el segundo agente más frecuente de
cistitis después de Escherichia coli en esta población. ·

Staphylococcus /ugdunensis:

Es una especie de Staphylococcus coagulasa negativó. Su nicho ecológico más habitual es

la piel, sobre todo la de la región perineal, en contrasté con S. epidermidis. No obstante, mientras
qué algunos autores lo consideran un comensal habitual de las superficies cutáneas, otros sólo lo
han encontrado en ella ocasionalmente.

Es responsable de. un amplio· espectro de infecciones, siendo las ocasionadas con mayor
frecuencia las de la piel y los tejidos blandos, tales como la celulitis y los abscesos subcutáneos, a
diferencia de lo que ocurre con otrós Staphylococcus coagulasa negativos. Pero también se han
comunicado casos de_ endocarditis, en· algunos pacientes después ·de una vasectomía reciente
(probablemente debido a la colonización de la régión perineal), infecciones relacionadas con
catéteres, bacteriemias, etc.

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Tecnología Médica
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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Últimamente ha tomado_ mayor importancia como agente infeccioso, estableciéndose

incluso la presencia de cepas resistentes a meticilina (CIM >16 µg/mL) en Brasil, en las cuales se
detectó el gen mecA incluido en el elemento de inserción SCCmec tipo V. Esto apoya la necesidad
de determinar la susceptibilidad del agente a oxacmna utilizando sensidiscos de cefoxitin.

A las 18-24 h de incubació.n en agar sangre, S. lugdunensis suele manifestarse como un

Ct(ltivo generalmente heterogéneo, de diversos tamaños de colonias, y diferente expresión de la 13-
hemólisis; la prolongación del tiempo de incubación hasta 48-72 'l1 permite poder observar unas
colonias mucho más homogéneas y que presentando a· su vez un aspecto más típico; estas
colonias son blanco-amarillentas, cremosas y con un pequeño halo de P-hemólisis (a diferencia de
la 13-hemólisis más ancha de 5. aureus).

Aproximadamente el 50% de las cepas es dumping factor positivo, coagulasa negativo. En

la identificación de S~ 1ugdunensis existen dos pruebas bioquímicas que resultan fundamentales
para diferenciarlo del resto de Staphy/ococcus coagulasá negativos:

• Producción de ornitiná decarboxilasa (ODC), principal característica bioquímica siempre presente

en este 5taphylococcus; sin embargo, hay que tener en cuenta que otros estafilococos coagulasa
negativos también pueden ser ODC positivos, por ejemplo algunas pocas cepas de 5. epidermidis y,
todavía más raramente, algunas de Staphy/ococcus haemolyticus y Staphylococcus warneri.

• .Prueba de la pirrolidonil-arilamidasa (PYR), positiva en S. /ugdunensis pero negativa en S.

epldermidis y s. warneri (dqs de las especies que pueden decarboxilar la omitina); S.·
. haemolytícus es PYR positivo y, muy excepcionalmente, ODC positivo, pero si se añade parai;nayor
_seguridad l_a prueba de la:acidificación de la manosa se llegaría a una diferenciación definitiva. Las
.. ,cepas de... S./ugdunensis
., . . .'. .-
µtilizan.
.•'
este azúcar.
.
' .
mientras
. que las .de S. haemolyticus
. . no,
. y además esta
. µIUma espe:cie carece:siempre de factor de afinidad con el fibrinógeno (dumping factor).

,_,Grupo Staphy/ococcus sciuri:

Este grupo es ampliamente distribuido en . la naturaleza, y pueden ser aislados de una

variedad de animales .de granja, mascotas y animales .[Link], así como también de diversos
. prnductc;,s alimenticios de orig~n animal. El grupo está. compuesto por ,Staphylococcus. sciuri
subsp. carnaticus, Staphylococcus sciuri subsp. rodentium, ~taphylococcus sciuri subsp. sciuri,
Staphylococcus /entus, y Staphylococcus vitulinus. Aunque' .están típicamente .é!sociados con
animales, los miembros del grupo 5. sciuri pueden colonizar humanos y se estima que pueden
[Link] el 0,79 a 0,43% del total de 5taphylococcus coagulasa negativos aislados de muestras
clínicas. Se les ha asociado con infecciones graves tales como endocarditis, peritonitis, shock
séptico, infección del tracto urinario, endoftalmitis, enfermedad· infiamatória pélvica y más
frecuentemente, en infecciones de [Link]én se ha descrito en catéter venoso .central. Es
capaz de producir biofilmy mostrar una fuerte actividad proteo lítica y DNAsa. Produce hemolisina,
·c1umping factor y [Link]. Se caracterizan por ser todos coagulasa riegativos, oxidasa positivos
y resistentes a· novobioéina (5 ·µg). Staphy/ococcus sciuri subsp. sciuri, Staphylocoé:cus leritus, y
.Staphylococcus séiur(subsp .. rodentium pueden hidrolizar esculina en . tanto que Staphylococcus
· ·vitulinus no. · · ·

Las fuentes de ias especies del grupo S. sciuri para ~eres ..humanos son animales, alimentos
de origen animal, y el ambiente tales como suelo, arena 'y agua, así como también el ambiente
hospitalario.

Se ha detectado en todas estas subespecies la presencia de un gen mecA homólogo al

descrito en S. aureus, y un 46% de ellas son portadoras del gen mecA que codifica resistencia a ~

'/
Meticilina, tal como lo hace en la especie S. aureus.

' ..,/

. /

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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014

QBR~N-AtTINQMY~~TAb~~
SUBORDEN MICROCOCCINEAE

De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda ·edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (y actualizado con anexo especial Nº 5 de 2004), este suborden
comprende 14 familias, pero sólci 1 de ellas tienen importancia para el ser humano:
Micrococcaceae. Este [Link]. forma parte · del Orden Actinomycetales, . de la Clase
Actinobacteria, Phylum Actinobacteria.
/.

FAMILIA MICROCOCC'ACEAE
Esta familia está compuesta de 9 géneros, varios de ellos tienen importancia para el ser
humano: Micrococcus, Arthrobacter, Rothia, Stomatococcus'y Kocuria.

GÉNERO MICROCOCCUS:

· El género Micrococcus agrupa a cocáceas Gram positivas de 0,5 ·a 2 µm de diámetro, de

agrupación irregular. Son inmóviles, aerobios, catalasa positivos y oxidasa positivos ya que poseen
·citocromos tipos c y d. No obstante esto, la determinación de oxidasa no se puede realizar
tradicionalmente como se hace .para· Staphylococcus utilizando el N,N,-dimetil-p-fenilendiamina
1% en agua, sino que se debe utilizar al 6% en dimetilsulfóxido. Con esta modificación se puede
diferenciar entre ambos géneros bacterianos.

Las especies de Micrococcus utilizan la glucosa y otros carbohidratos sólo aeróbica mente,
lo que los diferencia de las especies del género Staphylococcus. Son sensibles a la bacitradna
(sensidisco de 0,04 U), lo cual también lo diferencia de Staphy/ococcus que es resistente. La
mayoría de las cepas producen pigmento. Crecen bien en medios corrientes o con más de 5% de
NaCI y su temperatura óptima fluctúa entre 25-37ºC. Su hábitat es la piel del hombre y otros
mamíferos, el suelo, agua y alimentos. No son patógenos, pudiéndose aislarse raramente como
patógenos oportunistas especialmente en inmunosuprimidos.

GÉNERO STOMATOCOCCUS (ROTHIA):

ActUalmente este género no tiene espe~ie descrita ya que la única que se con~cía era
Stomatococcus muci/aginosus pero fue reclasificado como Rothia muci/liginosa. Dada su eventual
significancia para el hombre se considerará como parte de Stomatococcus ya que en los textos de
estudio continúa [Link] parte de dicho género. Stomatococcus mucilaginosus (Rothia
mucil/iginosa) está formado por cocáceas Gram positivas de 0,9 a 1,3 µm de diámetro, de
agrupación irregular, inmóviles, capsuladas, y es anaerobia facultativa. Produce ácido pero no gas
de la glucosa, es cata lasa positiva o débil. Desarrolla bien a 30-37ºC. Sus colonias son mucoides,
transparentes, adherentes al agar. Forman parte de la Microbiota de la boca. Se ha descrito en
abscesos locáles en ratones y e·n el ser humano, produciendo endocarditis y bacteremia.

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• _!

Pruebas [Link] ~sadas en la identificación de Staphylococcus:

• Prueba de la Catalasa:

Fundamento: la catalasa es una enzima del citocromo que descompone el peroxido de hidrogeno ·.. , /

(H202) en agua y oxígeno con ei'consiguiente desprendimiento de burbujas. La mayor parte _de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa a excepción de
Streptococcus y Enterococcus. La prueba de la catalasa se usa con mucha [Link] para
diferenciar miembros de la famjlia "Staphylococcaceae" de miembros de la familia
Streptococcaceae.

Procedimiento: Con una pipeta Pasteur o palillo de madera, transferir párte del centro de una
colonia a la superficie de una colonia. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno a_l 3% y observar
. formación de burbujas. · · j

. Resultado: la aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia indica reacción positiva. La

, __/
observación de unas pocas burbujas después de 20 a 30 segundos no se considera reacción
positiva.

Precauciones:

• Existen bacterias que poseen una enzima distinta a la catalasa, la DNA peroxidasa, en_zima •,/

no. citocrómica, presente en Aerococcus y Enterococcus que puede descomponer el

peróxid9 y pueden dar ·por lo tanto uná reacción cata lasa falsa que aún siendo débil puede
llevar a error. · · · ··· · · - ··· · · · , __ ,,/

• Si se t1tilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la
precaución de noretirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del
[Link] é:atalasa y su presencia dará un falso resúltado positivo.
• La prueba en portaobjeto debe realizarse con asa· de nicrom y no de platino, ya que éste
puede dar falsos positivos. Considerar que la prueba en portaobjeto genera aerosoles.
• Los cultivos para realizar la prueba deben ser frescos (18 a 24 h) de lo contrario se pueden
obtener falsos negativos. Los cultivos viejos pierden la actividad de la enzima.
• Existen cepas atípicas de Staphylococcus y Micrococcus que son cata lasa negativa y que sólo
se aíslan ocasionalmente del ser humano.

• Prueba de la Coagulasa:

Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que
genéricamente se denominan coagulasa negativos.

Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa:

a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "dumping factor" .o Factor de afinidad. con el

\., .. /
Fibrinógeno, es una proteína que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente
sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla
una suspensión bacteriana con plasma citrata_do. Es probable que esta proteína sea la
responsable, en parte, de la acción antifagocitaria de estos microorganismos. La
determinación~~- realiza en lámina.

b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF),
formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno
""
,,/
produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

~.
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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 ° 2014

e Test en lámina (para Clumping Factor)

Con lápiz de cera dibujar 2 círculos en un portaobjeto y "colocar 2 gotas de suero fisiológico,
emulsionar suavemente con la colonia a identificar. Colocar una gota de plasma citratado de
conejo a 1 círculo y mezclar con palillo, en el otro círculo colocar una gota de agua o suero
fisiológico como control. Rotar el portaobjeto buscando aglutinación.

( . Interpretación de resultados: Debe realizarse· dentro de los primeros diez segundos. Un test
positivo se evidencia por la formación de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por
test en tubo.

(.
·\....._, Test en tubo (para la coagulasa libre)

Se emulsionan varias c~l-onias eri un tubo con 0,5 mL de plasma citratado de conejo. Se incuba a
35º C y se examina la formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche
y se procede a su lectura a las 18-24 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en
( alguna oportunidad puede suceder que las fibririolisinas de [Link] lisen el coágulo luego de 18
horas de incubación y de esta manera se produzcan un test falso negativo.

,_ • Prueba de la Novobiocina:

··- Los estafilococos coagulasa negativos, se pueden dividir en sensiblesyresistentes a la· Novobiocina
{disco de 5 µg). Entre las especies resistentes a la novobiocina, Staphylococcus saprophyticus es el
\_
único que suele recuperarse en el hombre como agente de infecciones del tracto urinario.

Procedimiento: preparar una suspensión del microotganismo en caldo o en salino 0,85% similar a
0,5 Mac Farland. Con uná tórulá, distÍ'ibÚir parte d~ Ía suspensfón sobre la mitad de una placa de
agar Müeller Hinton. Colocar· un disco de nÓvobiocina (en forma aséptica) en el centro del área
sembrada. Incubar en aerobiosis a 3SºC durante 18 a 24 h.

ResultadO:

-S. saprophyticus: Es resistente a la novobiocina y presentará ausencia de

halo de inhibición ·o bien halos de hasta 16 mm.

- Otros Staphylococcus: Son sensibles a la novobiocina y presentarán halos de

/ inhibición de 16 mm o mayores.

( • Prueba de la Bacitracina:

El disco de bacitracina es un método que permite diferenciar Staphylococcus de Micrococcus. Los

Staphylococcus coagulasa negativos son resistentes al compuesto, mientras que los Micrococcus y
Stomatococcus son sensibles.

Procedimiento: preparar una suspensión de la cepa en estudio en salino 0,85%, ésta suspensión
r
debe tener una turbidez semejante al estándar 0,5 Me Farland. Con una tórula, distribuir parte de
í la suspensión sobre la mitad de la placa de agar Müeller Hinton. Colocar en forma aséptica un
··-
disco de bacitracina (0,04 U) en el centro del área sembrada. Presionar suavemente el disco sobre
la placa e incubar en aerobiosis a 35ºC durante 18-24 hrs. al cabo de ese tiempo se mide el halo de
inhibición alrededor del disco.

(
'--

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. /

Resultado:

1) Halo de i_nhibición <!:10 mm (cepa sensible) Micrococcus.

2) Halo de inhibición< 10 mm (resistente) Staphylococcus coagulasa negativa.

Nota: existen varios métodos para diferenciar Staphylococcus coagulasa negativa de Micrococcus
(susceptibilidad a lisostafina, furazolidona etc.) sin embargo el costo y las reacciones falsas
positivas, hacen má_s recomendable la susceptibilidad a bacitracina.

• Prueba de la Fermentación de Glucosa Anaerobia:

Esta es otra prueba que nos p~rmite diferenciar el género Micrococcus de Staphylococcus. Los
Micrococcus sólo utilizan la glucosa con producción de ácido en condiciones de aerobios is en tanto
que los Staphylococcus como son anaerobios facultativos utilizan la glucosa en aerobiosis y
anaerobiosis.

Procedimiento: se utiliza un medio estándar para fermentación basado en triptosa (1%), extracto
de levadura (0,1%), glucosa (1%} púrpura de bromocresol como indicador (0,004%) y agar-agar
(0,22%). El medio antes de ser usado debe regenerarse por ebullición 5 a 10 minutos en baño
termorregulado. Luego_ se enfría rápidamente y se siembran en picadura 2 tubos con la cepa en
estudio; uno de los tubos se sella con vaselina para dejarlo en condiciones de anaerobiosis.
Incubar ambos por 24 ha 372c.

Resultado:

• Si el medio permanece de color púrpura (violeta) la reacción es negativa, lo cual

significa que no hubci p'roducción de ácido. .
• Si el medio se torna de color ámarillo la reacción és positiva, es decir la glucosa fue
metabolizada hasta ácido en condiciones de anaerobiosis.

• Presencia de Desoxirribonucleasa (DNAsa):

Objetivo: permite diferenciar s. aureus y s. sciuri de otras especies dentro del Género
Staphylococcus que no poseen DNAsa.
"·~;
· ·Fundamento: se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de romper
· los·· enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene '-. ,/

verde de metilo o azul de toluidina, los cuales se combinan con DNA altamente polimerizado.
Cuando la combinación no ocurre, por acción _de la enzima DNAsa, se produce una decoloración
'- _/
del medio en torno a la colonia en estudio. La prueba puede realizarse también sin colorantes, en
tal caso la reacción se revela agregando HCI 1 N en la superficie del agar donde se encuentra la '-._.,J

colonia bacteriana. ·

· Procedimiento: Se siembra una colonia de Staphylococcús en forma de moneda en una placa d_e
medio sólido que contiene DNA y verde de metilo. Se incuba 18 horas a 352.

Interpretación de resultados: La formación de un halo transparente alreqedor de la siembra indica

presencia de DNAsa. Si se revela con HCI lN, una reacción positiva se verá por la formación de un
halo transparente en torno a la colonia entre 5 a 10 minutos.

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Esquema de identificación de Staphylococcus y Micrococcus

Cocáceas Gram"·•...· _ _ ' '

Ca~alasa
positivas

Esquema de identificación de Cocáceas Gram positivas

. COCOS GRAM POSITIVOS (*)

CATALASÁ

+
/ .~

Familia Staphy/ococcáceae (**) Familia Streptococcaceae

/. Familia Micrococcaceae Familia Enterococcaceae (**)
1
GLUCOSA ANAEROBIA
/ ~
+
Staphy/ococcus Micrococcus
Kocuria (*)
1·
/ NOVOBIOCINA ~

SENSIBLE RESISTENTE

""
1
. / COAGULASA . 1S. saprophyticus
.S. xylosus
+/. . S. cohnii ,ssp cohnii.
js. aureus S. e iderrnidis S. cohnii ssp urealyticus
S. Ju dunensis
S. haemolyticus
S. hominis
S. warneri
S. simulans ·
S. sch/eiferi
S. capitis ssp capitis
S. capitis ssp ureolyticus
(
(*) = Nomenclatura de acuerdo a la 2ª edic. del Manual de Bergey de la Bacteriolog la Sistemática, 2001, Vol. 1.
(**) = Familia propuesta pero aún no validada ·

,r·

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Color de las colonias Amarillo-blanco .. Blanco Blanco
/ . Hemólisis en agar sangre + +
1
'- Crecimiento anaerobio +· + +/-
Coagulasa (**} +
Fermentación de la glucosa + + +
r· Fermentación del manitol + (d)
Novobiocina Sensible Sensible Resistente(*)
DNAsa +·
+ = 90% o más de cepas positivas.
d = 11 a 89%.de las cepas son positivas,
(*) =S 16 mm. .
(**)=S. aureus, S. Jugdunensis, S. schleiferi dan Clumping Factor positivo.

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 \ ./ .

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,J

Características de Staphylococcus y otros géneros relacionados

\ _ .../
Resistencia a
Género %G+C Metabolismo Movilidad Catalasa Oxidasa Lisostafina Furazolidona Bacitracina
Anaeroo10
Staphylococcus 30-35 facultativo - + - - - R
Aerooro
Micrococcus 66-75 estricto -* + + + + -
Aerooro
Planococcus 39-52 estricto + + NO + - ·NO
Anaeroo,o
Stomatococcus
/
56-60 facultativo - ± - + - -
Anaeroo10
Aerococcus 35-40 facultativo - - - + - -
Anaeroo10
Streptococcus 34-46 facultativo - - - + - V
Anaeroo10
Enterococcus 34-42 facultativo - - - + - R
Peptococcus y Anaerobio
Peptostreptococcus 33-37 estricto ·- - - NO NO NO

Símbolos:+= 90% o más de las especies dan reacción positiva; - = 90% o más de las especies dan una reacción negativa;
± = 90% o más de las especies dan una reacción débil; ND = no determinado.·*.= Micrococcus agilis (Arthrobacter agilis)
es móvil. R = Resistente

Características útiles para la diferenciación de Staphylococcus aislados del ser humano

, · . AODO AEROBIO DE: '

' _/

. __ /

+: 90% o más de positivas; - : 90% o más negativas; d: 11.89% son positivas; v: Inestabilidad de la cepa; ():reacción tardía;
*=especies que dan Clumping Factor positivo. ** : :,; 16 mm Resistente. *** :Staphylococcus sciuri ssp lentus es xilosa +.

,._/

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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( . Especies de Staphylococcus coagulasa positiva

\_ ¿

Colonias Maltosa Clumping

MICROORGANISMO Coagulasa Hemólisis Acetoina
pigmentadas o D-Manitol factor

S. aureus + + + + + +
·•.
(.
. S. intermedius* + S10% d ·•,· ....
(d) d -
S. hyicus subsp.
hyicus* d S10% - - - -

d: 11-89% de las cepas positivas. (d): reacciones tardías.*: patógenos para animales

(.

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ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1: '"-. /

- OBJETIVOS:

1) Identificar el género Staphylococcus y sus principales especies.

2) Diferenciar las principales especies de Staphylococcus mediante análisis microbiológico.
3) Determinar la susceptibilidad a los diferentes antimicrobianos a las cepas aisladas.
4) Establecer la importancia de las diversas especies del género Staphylococcus.

ACTIVIDAD:

Se entregarán cepas bacterianas del género Staphy/ococcus pará realizar el estudio morfológico,
propiedades bioquímicas y test de susceptibilidad para cada una de las cepas.
-.
1. Sembrar cada cepa en: placa de agar sangre, agar .OF (glucosa) con vaselina y agar OF
sin vaselina, agar sal-manito!.
2. Realizar observación macroscópica y microscópica de las colonias obtenidas. Registre
sus resultados.
3. Describa las colonias en las placas de agar sangre según:
A) Forma
B) Borde
C) Elevación
D) Superficie
E) Color

4. Realizar las pruebas de Identificación: catalasa, coagulasa rápida y lenta, pruebas con
disco de bacitracina, novobiocina para las distintas cepas en estudio. Registre sus
resultados.
5. Realizar en placas de aga~ Müeller-Hinton estudio cie susceptibilidad o antibiograma
para las cepas en estudio, utilizando el método de Kirby-Bauer.
6. Realizar estudio de portación nasal y d~ lecho úngueal de Staphylococcus aureus. Para
esto deberá:

• Tomar muestras con tórulas estériles.

• Realizar Gram directo de muestra.
• Sembrar en medios indicados por el docente. -~
, _,;
_

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De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática, (año 2009), este orden propuesto comprende 6 familias, de las cuales
tienen importancia para el ser humano: Lactobacil/aceae, "Aerocc,ccaceae", "Enterococcaceae",
"Leuconostocaceae" y Streptococcaceae. . Este orden forma parte de la clase "Bacilli", Phylum
í Firmicutes.

· De acuerdo al Manual de Bergey, la familia Streptococcaceae posee, además del género

Streptococcus, otros dos géneros sin, importancia médica. La familia "Enterococcaceae" posee
además del género Enterococcus otros 2. géneros que carecen de irpportancia médica.
; .
'
No obstante, puede ser importante la diferenciación prácti~a de los siete géneros que en
otro tiempo se englobaron dentro de esta familia, a saber: Aerococcus, Enterococcus, Gemella,
Lactococcus, Leuconostoq, Pediococcus y Streptococcus. Estos géne,ros pertenecen a otras familias:
Aerococcus a "Aerococcciceae", Gemelfa a una familia incierta del orden Bacilla/es, clase "Bacilli",
Lactococcus a Streptococcaceae, Leuconostoc a "Leuconostocaceae", Pediococcus a
Lactobacil/aceae.

Existen otros géneros relacio_nados que· pueden ser encontrados en infecciones en el

hombre tales como Peptococcus· (de PeptocOccaceae) y Peptostreptococcus (de
"Peptoestreptococcaceae"), ambos pertenecientes actualmente al Phylum Firmicutes, clase
"Clbstridia", orden C/ostridiáles.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE

Esta familia está compuesta de 3 géneros, de los cuales sólo Streptococcus tiene
importancia para el ser humano.

GÉNERO STREPTOCOCCUS:
,.
El género Streptococcus comprende un grupo filogenética y fenotípicamente
heterogéneo. Mientras algu'nas especies pueden ser patógenas, otras s~n comensales avirulentas
( que forman parte de la microbiota normal del tracto respiratorio y genital, colonizando además
piel y membranas mucosas.

Las especies de Streptococcus son bacterias anáerobias facultativas esféricas u ovales que
( miden aproximadamente 2 µm de diámetro: A través de la tinción de Gram se pueden observar
cd'mo focos·Gram pOsitivos que se encuentran frecuentemente formarido parejas o cadenas:

. Entre otras características importantes destaca que son inmoviles: .cafalasa y oxidasa
negativos, carecen de flagelos y no forman esporas, además de que todas las especies son
anaerobias facultativas. Son sensibles a la variación de pH y su temperatura óptima de crecimiento
·-- es de 37°C. ~recen pobremente o no crecen en medios corrientes, por lo cual se debe adicionar
suero o sangre al medio. Presentan colonias pequeñas de 0,5 a 1 mm de diámetro, convexas, de
bordes enteros. Desarrollan mejor en rrHcroaerofilia·..
~ . .. : ·---~ ., . -- ..
;_ ...:_ - .. -

La dasificación tradicional e~ J1
laboratorio clínico de Streptococcus se basa en la
hemólisis"de. ia\:epa/en el grup~ serológico y en las características coloniales.

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Tecnología Médic~
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·Glasifícació~rF![Link]¡;Bfo@b: ~e basa en el tipo de hemólisis que Streptococcus producen en

agar con sangre de cordero:

• ffl_~PI!tff~ se puede observar la presencia de un tl;l]]$J:t~P:~J?:N~r(f~[Link]~~or , __ ,/

ia~gf~'.'&,d[i!).9ja donde los glóbulos rojos han sido completamente lisado~ Este
patrón es designado hemólisis de tipo Beta y es de considerable importancia ya
que la · presentan ~~p.tf19!!@_¿ljjk}gg~r,~s y muchos otros Streptococcus
patógenos humanos como ~H!Jl!J!FVfERs[gg9J!pfff.1CiJ.

: '..'é -;.: : producen-~m~~fP.i~;r§WI o hemólisis Alfa observándose como un

alrededor de la colonia; pertenecen a este grupo ~~t~l!lf?.~@
L~-- así como otros Streptococcus que habitan el tracto respiratorio
superior y gastrointestinal del hombre.
. . , . . ' ' .... ,.. .. .

• ~cre'.ffifiltñoos: las. especies . ~Jil!ce;ry..BTI:figffigfisis, aunque el, término

Streptococcus no hemolítico es preferible. Se denomina hemólisis Gamma. ./

~~ci:Oro~(c'ig!€a: se basa. en el~Jp :~;ij;$gi presente en la pared celular

. del mkroorganisme>, denominado_· .or la investigadora Rebeca Lancefield.
Estos antígenos permiten la ~~~~t~~t'§~~~'5,>'s::i
fgl y otros grupos aislados con m-enor=frecUéiícia, comoios y ,!;l;fr1f1Asll&s&~0l~3T~ Los
microorganismos que pertenecen al grupo A tienen el mismo tipo de carbohidrato C, los del grupo
B poseen el mismo carbohidrato C y así sucesivamente. El:grupo -s;~;r9iI:rgi;c:c5;t~ incluye. sólo la
especie~lrl@l§&l?:Xffgl!!./;JJS y por lo tanto, el término S$fi~&t,f?ff!EEM~i?J&R~~~fl?,f8-Yé1!fas se
. [Link] al mismo microorganigno y en general est_os nombres se usan _en forma indistinta. Lo ,-~.

mi~mo ocurre con el grupo B el _cual cpntiene sól,o la especje ,$. agalactiae. Los otros grupos
serológicos incluyen un número [Link] especies.

Debido. a los .estudios filpgenéticos realizados en este género, los Streptococcus han
experimentado varios cambios taxonómicos en las dos últimas décadas, de tal manera que los
Enterococcus que antes pertenecían a los Streptococcus del grupo D, son ahora considerados un
género distinto, y los Streptococcus del grupo Cy G aislados de humanos están clasificados en una
misma subespecie: Streptococcus dysga/actiae subsp. equisimilis.

Son cocáceas esféricas de 0,5 a 1,0 µm queforman cadenas cortas en las muestras clínicas
. y cadenas más largas cuando. crecen en. medio de cultivo. Se desarrollan óptimamente en agar ~-
sangre de cordern, ~i:C'J;;~~3'iO;hr:1:r~y!5j[Link]!:l~ip:7~{1;~~~9:IT~~r:@e[tr~n~~~~:de!gji~osa.
Después de 24 horas de inculiicio'ñseo6'serván~ col_ohias blancas con _una zona de ¡f}}IJ~Iff2.~'i!?)ª su
alrededor. Las cepas encapsuladas pueden presentar una apariencia mucoide en los medios recién
. preparados pero pueden ser rugosas en medios deshidratados. Las colonias no encapsuladas en
cambio son pequeñas y brillantes.

Es la única espede que sintetiza 1~ t1!:~l]1?7[if[M!l~d:i!;ª1r)7Rqp~~) salv~~gu~-~-~tr~~,- ''--,/

ra_ramente aislados en clínica como S. iniae y S. porcinus de manera que la P.J1(!tli31J~i;!~[Link].J
(p}rrolidonil-beta-naftilamida) es de gran ventaja por su rapidez de ejecución y lectura y porque ha
demostrado tener ~~~7(Je;süst~fe!il3.:ffi'c!:¡@~l;@~~1Pe:cífigg}I]) [Link] es_tudio de cepas chilenas.
Este método también es ¡~ffiyO?,~;if']EñfffeioéOµUs~ sp. Otra prueba degran utilidad es la
@~ltl!iI@~a:~s?rnIT!l]:st~EJ;~;ª;o¡g~~9~fil!.::~L9J~~ff5&~~\1i~71>~T~l~1]!]Ii$.'~.§]ifitili~-
Colonizan normalmente la ;pr:c(faf;fng~ de los niños sanos y ·de los adultos jóvenes·. Se
estima que la portación en individ~os._s,áñ~s puede alcanzar entre 15 a'1 20%. La faringitis
producida por esta especie es una enfermedad fundamentalmente de niños entre 5 y 15 años,
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(,
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aunque los lactantes y los adultos también son susceptibles. El patógeno se extiende de p~~
fpe-:r:,somr:::a,:;t@rés cl'e'Jg'ofita~de'.:C~l{lg1fiª:JJEI hacinamiento aumenta la diseminación de la bacteria,
e ~
,;:,-....,.:.:.:,;.,,·/. ;. : ' : · , ~ · · ' ~ ~ . , ¡ . , , ;..,:..:....:,,:...--......-·,~~,-:..:.,.,~,-,.=-

fundamentalmente en los meses de invierno. Las irf~c)o"ñesJcfe:ilJe>sJfe.i1cios0:orai:rdp:s como .

~

. '><-:..:_,._.___,.--:~~--~~. .]><... ~-..:L;'~,'!.).~.:-,!.'::-.;.;.c- -~, º" ,,

1/
Hypoderma, erisipela, celulitis y fascitis se producen por una colonización inicial de la piel con la
bacteria, después de la cual los microorganismos se introducen en· los tejidos superficiales o
/'
profundos.

Los cuadros clínicos que produce se dividen en Enfermedades Supurativas como

infecciones de la vía respiratoria superior, de la piel y de los tejidos blandos: faringitis, celulitis,
erisipela, fiebre puerperal, impétigo, heridas infectadas, fascitis necrotizante, síndrome de shock
tóxico estreptocócico. Las mánifestaciones tóxicas son entre otras la escarlatina. Las
Enfermedades No Supurativas o post estreptocócicas son secuelas de infecciones estreptocócicas
y se consideran enfermedades autoinmunes. Ejemplo de ellas, son la glomerulonefritis aguda y
-fiebre reumática que constituyen complicaciones [Link] de las infecciones cutáneas y
(
faríngeas.

La e'E!!~7!fWl0:@!!0It:~~4];!::'iª::-etlW:ª~íf"~E!?JEt
teJi:>;f~[@sin embargo la $'I,~fitg~~J1o alguno ae los- nuevos ,~~gg(fch:1EW
Hí1l~'éfJJY de l[&f~rel!St~ rnim-fte.n~~ ~~~~pJm;~~ ~~P~]T§l!j" fl Existe un aumento
-;¡-a'l=mante de la resistenéia-i"est'as drogas antimicr~bianas debido ~I aumento en muchos países
( del uso de eritromicina y nuevos macrólidos destinados para el tratamiento empírico de las
infecciones respiratorias como la otitis media, la faringoamigdalitis, la sinusitis y la neumonía.
-Además, como una ~mfflg[«f ~l!}]:~q; ,~11'.t!1~ E~~~;~~~ éllm~sil
it~2~B~g:WW~Xf~ .. ·

~Jitg!g~fi:~€g;~~t~~~},ff~f~~~~:!tEt9CBf~Y~:~g:~lfR~l-
( Se le conoce también como estreptococof @;Tfierr,f51l ~qg[~g-y corresponde a una
cocácea Gram positiva, ~a.ti5f~~~;2,5,,![ñ~--S; anaerobia facultativa; ~ue se presenta
e· formando cadenas de longitud variable. Puede crecer en medios simples, aunque los medios
suplementados con sangre o suero favorecen su crecimiento. A las 18-24 h de incubación en agar
/ sangre, las colonias son de aproximadamente 2 mm de diámetro, lisas·y rodeadas por un halo de
\
8-hemólisis, aunque existen algunas cepas no hemolíticas.

Además del OO]í~~JT~~gp1!~1:S"~:mso común del grupo~B.¿_TQ~~~a!,'d, preserita antígenos

( fPH11~~1]'.~~J Y a~~--W:~ ~s, que han permitido su clasificación en nueve
serotipos (la, lb y 11-VIII). Los serotipos la y 111 son actualmente los predominantes en Chile,
mientras que el serotipo V ha emergido en Estados Unidos, Europa y Asia desde el año 1990,
provocando infecciones invasivas en neonatos y adultos.
(

Las pruebas bioquímicas más. utilizadas son el m1I~a, la ~~®l~~~~\e y la

resistencia a discos de ~g!U~~qi~~ aunque ninguna de ellas es específica. En medios de cultivo
especiales, esta especie produce un - ® ' S f i l t ~ , que es característico, y que
permite su identificación directa, sin necesidad de otras pruebas. Las cepas no hemolíticas no
producen pigmento. Para su aislamiento se puede utilizar un medio selectivo como el Todd Hewitt
· adicionado de 15 µg/mL de ácido nalidíxico y 8 µg/mL de sulfato de gentamicina. La detección de
antígenos se puede realizar directamente de LCR, orina o suero en el diagnóstico precoz de• la
sepsis neonatal pero posee poca especificidad, lo que no permite su empleo como única prueba
para el diagnóstico etiológico de este cuadro clínico.

Esta especie forma parte de la i1:!:@ti@J[i,b.fª[Link]~ffi~tfil~~¡g::g,1g_?J§~.!':@.J!1!'f~lu:1~1 desde donde

l~B:J~J~~~Jl~~ y, a veces, el tracto urinario: La colonización del tracto· genital puede ser
mfeYmitente y es un hecho importante en las gestantes, por la posibilidad de transmisión de la
. bacteria al recién nacido. La portación puede alcanzar entre 5 y 35 %, dependiendo de la población
en estudio, de los medios y técnicas de cultivo y de. las áreas anatómicas de las que se toma la
muestra. En Chile, se ha estimado que alrededor del 5 al 20% de las gestantes de tercer trimestre
son portadoras vaginales o perianales de la bacteria.

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La colonización por esta especie en los recién nacidos se produce_ durante el parto, partir a
del. canal. del parto .colonizado o en el útero, por vía ascendente, siendo la tasa de transmisión
· v~rtical del 50%:- Hay varios factores obstétricos que se asocian con un mayorriesgo de infección
del recién nacido, siendo fundamentalmente la prematuridad (<37 semanas), la rotura prolongada
.de las membranas {>12 horas), la existencia de fiebre intráparto (>38 2q, haber tenido un hijo
antl:!rio·r con infección por esta bacteria y la presencia de bacteriuria durante el embarazo causada
por este microorganismo.

. .[Link]~nte, _S. agalactiae es la principal causa de sepsis neonatal. qu~ suele

manifestarse, en las primeras horas de vida, bajo la forma de neumoníá, sépsis o-meningitis·, con
\
una mortalidad próxima al 10% {0,2-0,5 casos por mil nacidos vivós). En las mujeres [Link] y
puérperas puede producir corioamnionitis, endometritis postparto, infección de la herida
quirúrgica tras cesárea e infección del tracto urinario. Se le encuentra también afectando animales
en los cuales puede producir mastitis bovi_na.

la periidlirii,CG'es el antibiótico de elección para ·el tratamiento de las infecciones por este
microorganismo. Se emplea habitualmente en combinación con un aminoglicósido como la
--..,
gentamicina en el tratamfento dada la sinergia que estos. antibióticos presentan in vitro. Basado
en alg1,Jnos estudios [Link] han. d,emostrado un aumento de Ja resiste~cia de esa especie a la
y
[Link] yia clindamicina (16 15% respectivámente), se, recomienda reaffzar siempre un
antibiograma incluyendo estos antibióticos ya que son de uso alternativo en la quimioprofilaxis
intraparto de pacientes alérgicas a penicilina.

Stteptococcuspneú,moniae:

' __ )
También conocido como "Neumococo" corresponde a una cocácea Gram positiva que
aparece como diplococos en forma redondeada o lanceolada y raramente formando cadenas;
forma colonias pequeñas con alfa hemólisis. A medida que el cultivo se va envejeciendo, la colonia
comienza a mostrar una depresión central producto de un fenómeno de autolisis dando el aspecto
. de un~ colonia umbilicada., Sin ernbargo, cuando se le aisla desde productos patológicos en su
forma capsulada, la colonia se observa mucosa, grande e irregular, con alfahemólisis. Con el .
subcultivo. dicha cápsula se pierde y la colonia recupera sus c_aracterísticas tradicionales. Su
· estructura antigénica contiene Polisacáridó capsular que de acuerdo a su naturaleza se han
descrito 90 serotipos diferentes, la Proteína My el Carbohidrato C.

, . Forma parte de la micro_bipta: del tracto respiratorio superior en un. 20-70% de la

población, dependiendo de lá ksfación ·de:1 año y d.e la población estudiada. Es responsable de
infecciones menores (canaljculares) como otitis media agudá (OMA} y sinusitis, o invasoras como
neumonía, meningitis, sepsis, fiebre sin foco, más raramente artritis, peritonitis y celulitis. La
mayoría de las publicaciones coinciden en que 30 a 40% de las OMA, 40% de las sinusitis agudas y
50% de las neumonías bacterianas adquiridas en la comunidad, son causadas por S. pneumoniae.
Sé le considera una causa infrecuente de sepsis neonatal (1 a 11%), pero posee una alta tasa de
morbimortalidad tanto para el niño como para la madre y las manifestaciones clínicas son
similares a las de la sepsis causada por Streptococcus agala<;tiae. pero _S. pneumoniae se comporta
de manera más agresiva resultando e11 importante mortalidad (50%).

Tradicionalmente, esta bacteria se ha identificado en_ b_ase a su susceptibilidad a

optoqUina. Sin embargo, la emergencia de cepas resistentes a optoqµina ("atípicas") hace difícil el
diagnóstico sin utilizar varias pruebas diagnósticas, incluyendo las de biología molecular. También
se han detectado cepas . insolubles en bilis (prueba a la c1,1al __ se _le describe. como soluble},
· posiblemente asociado a variaciones en la metodología utilizada: Sin .embargo, independi~nte de
la técnica. usada, esta prueba se describe. como el método. fenotípico de mayor susceptibilidad (>
. 98%) y especificidad (100%). Aún más, otras pruebas fen_otípicas tales como los _kits comerciales
API 20 Strep y Rapid ID 32 Strep® (bioMérieux), generalmente no diferencian S. pneumoniae de
otros estreptococos del grupo viridans sin el apoyo de las pruebas de optoquina y/o de solúbilidad

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,./
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Tecnología Médica 80 .. · : · _··
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

en bilis. Lo anterior refuerza la necesidad de utilizar una combinación de métodos en el

diagnóstico de este tipo de aislamientos, ya que las técnicas existentes por sí solas no permiten un
diagnóstico certero. Es fundamental que los laboratorios clínicos implementen de rutina_ la prueba
de solubilidad biliár para la correcta identificación de S. pneumoniae frente a cepas de
Stréptococcus a hemolíticos resistentes o con susceptibilidad disminuida a optoquina.

Para el diagnóstico se utiliza elexamen directo (tinción de Gram), cultivo, aislamiento si es

necesario, identificación y pruebas de susceptibilidad a drogas antimicrobianas. La identificación
presuntiva se realiza a través de la prueba de susceptibilidad a la optoquina o pruebas
bioquímicas. La confirmación se realiza a través de la Reacción de Neufeld (Quellung · o
Hinchamiento capsular) utilizando un antisuero polivalente que reacciona con todos los serotipos
y luego la serotipificación con el antisuero específico para cada serotipo. Actualmente en Chile
esta confirmación se hace en el ISP. En ocasiones en que los cultivos sean negativos se puede
realizar la demostración del antígeno capsular en líquidos orgánicos como LCR, líquido pleural,
etc., a través de contrainmunoelectroforesis o aglutinación en látex. Se ha descrito pruebas de
biología molecular como la PCR para detectar génes de virulencia de S. pneumoniae como la
autolisina (gen lytA) y pneumolisina (gen ply) y para el antígeno de superficie neumocócico A
'"'·- (psaA). Sin embargo, se ha demostrado la presencia de estos genes en otros miembros del grupo
viridans, lo que los inhabilita como herramientas únicas para el diagnóstico de certeza.

Hasta hace unos años, esta especie era muy sensible a la penicilina razón por la cual era el
·- tratamiento de elección. En 1965 aparece la primerá cepa resistente a la penicilina y desde
entonces se ha ido incrementando la emergencia de ·estas cepas en algunos países. Españ'a por
ejemplo presenta entre el 30% y más del 60% de resistencia, siendo la mayoría de las cepas
multirresistentes. Dado estos hallazgos, se recomienda controlar la susceptibilidad a las drogas
antimicrobianas, especialmente a la Penicilina utilizando sensidisco de oxacilina. Como drogas
alternativas se cuenta con cefotaxima, ceftriaxona, vancomicina, fluoroquinolonas, macrólidos y
clindamicina.

OTROS Streptococcus 13 HEMOLÍTICOS.

Las cepas de Streptococcus ~ hemolíticas que poseen los antígenos A, C o G pero que
forman una colonia pequeña (< 0.5 mm en diámetro) son consideradas cepas del grupo anginosus
(previamente denominados Streptococcus milleri), en el cual también se agrupan cepas que no
son ~ hemolíticas. También se consideran dentro de este grupo todos los Streptococcus ~
hemolíticos del grupo F. Los Streptococcus serotipo A del grupo anginosus son PYR negativos. Los
Streptococcus grupos C y G producen cuadros· infecciosos similares a los producidos por S.
pyogenes, incluyendo faringitis, epiglotitis, sinusitis, meningitis, pericarditis y endocarditis, artritis
e incluso pueden provocar shock de manera similar al causado· por cepas toxigénicas de S.
pyogenes, de aquí que el aislamiento de estos grupos debe ser informado por el laboratorio.

Streptococcus GRUPO VIRIDANS

Todas .las cepas de Streptococcus que no pUeden ser clasificadas c~mo S. pyogenes, S.
agalactiae, S. dysgalactiae, S. pneumoniae, ·o S. bovis son clasificadas como Streptococcus del
grupo viridans, razón por la cual este grupo está compuesto por especies que son muy diferentes
/
en morfología, en reacciones hemolíticas y en participación en procesos infecciosos. En este grupo
es posible encontrar diversos subgrUpos de Streptococcus siendó el grupo anginosus uno de ellos.
(.

Los Streptococcus humanos que pertenecen a Streptococcus dysgalactiae subspecie

(
equisimi/is (SDSE) se les ha conocido bajo el nombre de ·streptocóccus ~-hemolíticos grupos C y G.
Luego de ser considerados..no patógenos ·por muchos años, SDSE es reconocido actualmente como
un importante patógeno ·bacteriano. Los tipos de cuadros clínicos en los cuales ha estado

udp Escuela de
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 e

udp Escú~la de '

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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
D
implicado este agente es similar a los causados por Streptococc~s pyogenes, incluyendo las
secuelas post estreptocócicas. Se ha establecido que muchos de los factores de virulencia
presentes en S. pyogenes también están presentes en cepas de SDSE, probablemente por
transferencia horizontal de genes a trávés de elementos genéticos móviles. Existen estudios
epidemiológicos que muestran .un creciente número de infeq::iones invasiva por SDSE, más
frecuentemente en pacientes inmunocomprometidos por lo cual esta especie está adquiriendo f

mayor importancia clínica. SDSE puede colonizar eri el ser humano el tracto respiratorio superior, '- /

tracto gastrointesÜnal, tracto genital femenino, y a menudo [Link] presente en lesiones de la

piel. Los sitios de colonización e infecciones focales actúan· como reservorio principal para la
transmisión de este agente. Las infecciones por SDSE sori trarismitídas persona a persona y no se
ha descrito reservorio animal para esta ~ubéspecie.

La taxonomía actual para. Streptococcus dysgalactiae describe la existencia. de dos

subespecies:

Streptococcus dysgalactiae subspecie equisimilis (SDSE) caracterizado por ser Streptococcus ~

hemolíticos formadores de colonias grandes pertenecientes a los grupos C y L y Streptococcus del
'-- j

grupo G humanos .

.Streptococcus dysga/actiae subspecie dysgalactiae (SDSD) caracterizado por ser Streptococcus

alfa o no hemolíticqs formadores de colonias grandes pertenecientes al grupo C. Normalmente
son [Link] animal. ·

.Las especies del grupo viridans son parte de la rnicrobiota dé la cavidad oral, del tracto
gastrointestinal y del tracto genital femenino y pueden ser ~ncontradbs en la sangre en forma
. transitoria. Poseen rol patogénico importante en la endocarditis bacteriana y actualmente _tienen
,j
además importancia como causantes de infecciones en pa_cientes neutropénicos. Son agentes
causales de caries dentales.

Streptococcus GRUPO ANGINOSUS

Este grupo se le· considera· parte de Streptococcus grupo viridans y se caracterizan por
presentar~ ó a hemólisis o ser no hemolíticos. A este grupo se·le ha denominado Streptococcus
grupo mi/leri o Streptococcus milleri. En la [Link] se reconocen tres especies en .el grupo
anginosus: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus y Streptococcus interinedius.
Estas especies forman colonias pequeñas y pueden tener antígenos de Lancefield grupos A, C, G o
F .o pueden ser no agrupables. El antígeno Lancefield del grupo F es encontrado con mayor
frecuencia en estas especies.

Teniendo este grupo características muy diferentes a los otros Streptococcus del grupo
viridans está bien establecido el rol patogénico que poseen en infecciones severas: abscesos
cerebrales, hepáticos y pulmonares, así como también en bacteriemias y endocarditis bacterianas.
En general, dentro de este grupo, la especie S. anginosus ha sido asociada con bacteriemias y las
otras dos especies, s. constellatus y S. intermedius han · sido asociadas a la producción de
abscesos. Diversas publicaciones señalan·que se les aísla con mayor frecuencia en infecciones
. supurativas que otros Streptococéus del grupo viridans. · ,

Para la identificación de las especies de este grupo; frente a una colonia ~ hemolítica que
presenta el antígeno F, se debe informar como Streptococcus grupo anginosus. Sin embargo,
considerar que sólo un reducido porcentaje de cepas dentro de este grupo son ~ hemolíticas y que
de éstos, menos de la mitad presentan el antígeno F. Adicionalmente, se ha descrito que las cepas
de este grupo presentan olor a caramelo en cultivo puro. Aunque la presencia del antígeno F y el
olor a caramelo son características importantes y de gran ayuda en la identificación cuando están
presentes, sólo permiten identificar una fracción de las .cepas dentro de este grupo.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Er>Nin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A

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Manual de Micróbfología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

\__,,
Esquema de identificación propuesto para Streptococcus ~ hemolíticos de los grupos A, C, G o F.
PYR: Pirrolidonil aminopeptidasa. VP: Voges-Proskauer.

f3 Hemólisis

Antígeno A Antígeno C o G Antígeno F

PYR+ /3- D-. S. grupo anginosus

Bacitracina S

-
( ) (+)

[Link] S. grupo áriginosus S. dysgalactiae

(
"·-

Confirmación con VP (+) Confirmación con VP (-)

e
(' Tamaño
'-..,, Grupo de Test de
de Especie PYR VP Bgluc
Lancefield CAMP
Colonias
A Grande S. pyogenes + - - ND
A Pequeña S. grupo anginosus - + - ND
B Grande 5. agalactiae - V + ND
l.__
e Grande 5. dysgalactiae - - - +.
e Pequeña 5. grupo anginosus - + - -
e F Pequeña 5. grupo anginosus - + - ND
G Grande 5. dysga/actiae - - - +
G Pequeña 5. grupo anginosus - + - -
No
agrupable
Pequeña 5. grupo anginosus - + - ND

Tamaño de colonias: Grande:> de 0,5 mm de diámetro después de 24 h de incubación.

VP: Voges Proskauer.
ND: Información No disponible
PYR: pirrolidonil aminopeptidasa
Bgluc: f3 D-glucoronidasa
L V: variable

Respecto a la susceptibilidad antimicrobiana, los Streptococcus del grupo viridans en

general presentan resistencia a penicilina y a otros agentes, en cambio las cepas de Streptococcus
gru~o anginosus se mantienen susceptibles. No obstante, en este grupo se ha determinado la
(_ presencia de resistencia a penicilina, a macrólidos y a clindamicina; Una consideración importante
es que el estudio de susceptibilidad a penicilina debe. hacerse por un método de CIM, ya que el
método de difusión con discos no es válido para los Streptococcus del grupo viridans. El estudio de
susceptibilidad a macrólidos y clindamicina puede hacerse utilizándose sensidiscos, y como estas
cepas presentan los mismos mecanismos de resistencia a macrólidos que S. pyogenes, es
/ '
importante evaluar si la cepa presenta resistencia inducible a clindaniicina empleando el método
L D-Test.
\.._

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

StreptocOccus bovis
'-..___.,)

Corresponde a un estreptococo del Grupo D de Lancefield y forma parte de la microbiota ,j

intestinal humana. Se caracteriza por crecer en medios corrientes, es sensible a Penicilina, no
produce hemólisis o es a hemolítico, no crece en caldo sal 6,5% (diferencia con Enterococcus), y es
bilis-esculiná, manitol y Voges :. Proskauer positivo. Las infecciones clínicas más importantes
causadas por este microorganismo son bacteriemia y endocarditis, éstando la primera asociada
con cáncer de colon y excepcionalmente se han descrito casos de meningitis y sepsis neonatales.
· Habitualmente las infeccio'nes se presentan en individuos inmunosuprimidos y/o eón lesiones en el
, tracto digestivo como pólipos o' neoplasias. Esta especie fue separada· en biotipo 1 (S. bóvis) y ,_/

' biotipo 11 (S. bovis variante) basándose en diferencias bioquímicas. Siri embargo, desde 2003 en
base a estudios de DNA, se reclasificó el grupo del S. bovis; pasando a·denominarse Streptococcus
gal/olyticus al S. bovis biotipo l. ...._.,/

..
Los Streptococcus más
Grupo viridans Grupo anginosus
importantes .,

Streptocqccus pyogenes Streptococcus mitis. S'treptoc;occus intermedius

Strepto~occus
,. ... ·-aga/actiae
. .
. Streptococcus mutans_ Streptococcus constelatus .
'
'
S,treptococcus bovis 'streptococcus ora/is Streptococcus anginosus
Streptococcus pneumoniae Streptococcus sanguis
Streptococcus Grupo viridans Streptococcus salivarius
Grupo anginosus '-.. .../

FAMILIA ''AEROCOCCACEAE11 '- __,/

Esta familia está compuesta de 7 géneros, de los cuales sólo Abiotrophia tiene importancia
para el ser humano.

GÉNEROS ABIOTROPHIA Y GRANULICATELLA:

El género Abiotrophia y Granu/icatella comprenden cocáceas Gra_m positivas, a veces

ovoideas, cocobacilares. Requieren Piridoxal (0,001%) o L-cisteína (0,01%) en agar sangre_ para
poder crecer, razón por la cual se les ~onocf> anteriormente como Streptococcus nutricionalmente
variables (NVS). No forman esporas, son inmóviles, aerobios facultativos, catalasa y oxidasa
negativos. No crecen a temperatura de lOºC ni a 45ºC y tampoco en presencia d~ NaCI 6,5%.
Presentan generalmente alfa hemólisis en agar sangre de cordero. Resistentes a optoquina y
[Link] susceptibles ..

Fueron descritas por primera vez en 1961 cuando se les detectó como Streptococcus no
hemoiíticos que crecían alrededor de otras bacterias (en "satelitismo) en muestras de pacientes
con endocarditis bacteriana y otitis media aguda. Estas bacterias son capaces de crecer bien en
hemocultivos y en agar chocolate debido a que los eritrocitos lisados proveen piridoxal para
permitir su desarrollo. En agar san·gre, donde los eritrocitos no':están lisados no son capaces de
crecer. Los NVS han recibido diversos nombres, sin embargo a través de estudios moleculares se
ha establecido actualmente que se dividen en dos géneros denominados Abiotrophia y
Granulicatella. Ambos géneros forman parte de la microbiota oral y gastrointestinal.

Para su aislamiento se puede utilizar agar chocolate o bien agar sangre con una estría de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (que es una cepa hemolítica). También se puede utilizar agar
brucella con 5% sangre de caballo y caldo tioglicolato. No se desarrolla en agar soya tripticasa con

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
{"",
Í' 5% sangre de cordero. El cultivo se realiza en aerobiosis o en microaerofilia. Para una
(' identificación de certeza se recomienda utilizar sistemas de pruebas bioquímicas comerciales
como Rapid ID 32 Strep o Api 20 Strep (BioMérieux).
( .
'-"
í.
De acuerdo al Manual de Bergey (2009), Abiotrophia presenta sólo una especie:
Abiotrophia defectiva. Produce ácido de la sacarosa. No hidroliza hipuráto y es arginina
dehidrolasa negativo.

Í' Las especies más frecuentes dentro del. género Granulicatella, son Granulicatella
í' adiacens y Granulicatella elegans.

í
Ambos géneros · producen_ de forma oportunista (especialmente en pacientes
í inmunodeprimidos) sepsis, abscesos pancreáticos, infecciones al sistema nervioso central y
í' endocarditis. La infección puede ser de . origen intrahospitalario en patientes con estadías
prolongadas, tratamientos antimicrobianos, procedimientos invasores y presencia. de cuerpos
(
extraños.
('

í' Respecto a la susceptibilidad a drogas antimicrobianas, ambos géneros han demostrado

susceptibilidad disminuida a penicilina, lo cual conduce a una- mayor dificultad en el tratamiento
de pacientes con endocarditis. Existe además una publicación donde se describió resistenda a
í' fluroquinolonas en una cepa aislada de un pacente inmunosuprimido. La susceptibilidad in vitro de
í estos géneros sólo se· debe realizar mediante CIM (microdilución en caldo), recomendándose
evaluar Penicilina, cefepime, cefotaxima, ceftriaxona, carbapenems, vancómicina, eritromicina,
í'
ciprc:ifloxacino, cloranfenicol y Clindamicina. Para estos ensayos es importante agregar piridoxal o
cisteína a los medios que se utilicen. ·
r·
.'

Características Abiotrophia Enterococcus Streptococcus Granulicatélla

/'

'
(
Satelitismo +· - - +
(
Susceptibilidad a
í Vancomicina (30 s s s s
µg)
..
('
Leucina
arilamidasa
+ + + +

( PYR + + - (1) +
('
Crecim en 6,5% ·
NaCI
- + - (2) -
r Crecim. a lOºC - + - -
Crecim. a 45ºC - + V -
..

r·
(1) = S. pyogenes es +
(2) = algunos Streptococcús beta hemolíticos pueden crecer
í
r

r·

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. EIWin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014
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'

FAMILIA ENTEROCOCCACEAE
¡\

Esta familia está compuesta de 3 géneros, de los cuales sólo Enterococcus tiene
importancia para el ser humano. ..~

GÉNERO ENTEROCOCCUS:

Este género perteneée a la familia propuesta 11 Enterococcaceae11 y está conformado por

cocos Gram positivos, que se encuentran aislados, en pares o cadenas cortas, pero pueden
mostrarse cocobacilares en medios sólidos, siendo sus especies Enterococcus faecalis y
En,terococcus faecium las más importantes para el ser humano en relación a la frecuencia de
aislamiento (80-90% y de 10-15%, respectivamente), ya que constituyen el segundo agente de
infección intrahospitalaria, causando principalmente infección urinaria, infección de heridas y de la
sangre.

Enterococcus sp. forma parte de la microbiota intestinal humana y también de otros

mamíferos, aves e insectos. No son exigentes en su crecimiento en cultivos por lo cual pueden vivir
en medios poco enriquecidos como agua y suelo. Pertenecen al grupo serológico D de Lancefield,
son halófilos (crecen a una concentración de 6,5% de NaCI) y pueden desarrollar en medios con
bilis e hidrolizan la esculina. Pueden ser a, ~ o y hemolíticos. Son catalasa negativos; sin embargo
por poseer una DNA-peroxidasa (enzima no citocrómica) esta puede actuar sobre el agua
oxigenada y dar una reacción falsa positiva. Son resistentes a las drogas antimicrobianas,
especialmente a la Penicilina. Pueden crecer en un amplio rango de temperatura (10- 45ºC) ..

Se ha podido determinar que en los hospitales sobreviven en las-manos de los portadores,

pacientes y superficies inanimadas durante más de 24 horas. Sµ E![Link] resistencia a diferentes
[Link]óticos les .permite sobrevivir y prolifera~ en pacientes que reciben terapia antimicrobiana.
Este género produce infecciones extrahospitalarias, principalmente infecciones urinarias, sin
\
embargo producen también infecciones intrahospitalarias con bastante frecuencia. En 1986 se . /

descubrieron las primeras cepas de Enterococcus Resistentes a Vancomicina (ERV) en Inglaterra,

posteriormente en ese mismo país se incrementaron en un 50% por año las infecciones por este
agente en algunos hospitales. Igual efecto se estableció en Estados Unidos donde se ha
comunicado un aumento de las IIH causadas por este microorganismo desde 0.4% a 25% en UTI
entre .1989 y 1997.

En Chile, el añ.o 2000 se inicia la vigilancia microbiológica de la colonización intestinal por

ERV en pacientes de alto riesgo en las UTI, que llevan hospitalizados más de 5 días. Se considera la
aparición de ERY ya sea colonizante o infectante como una emergencia epidemiológica, por lo cual
se toman de inmediato medidas de aislamiento al paciente portador y a la sala donde se detecta el
· primer caso de ERV. De igual manera se debe estudiar a los demás pacientes que estaban en la
misma sala del paciente que demostró ser portador o estar infectado por ERV a través de ,~
___,/

muestreos utilizando hisopado rectal.

Entre los factores de riesgo más importantes para la· adquisición de una infección
intrahospitalaria por Enterococcus está la colonización gastrointestinal, enfermedad de base
grave, estadía prolongada en el hospital, Insuficiencia renal, neutropenia, presencia de sonda
vesical, catéteres vasculares, permanencia en una UTI, terapia previa con antimicr_obianos como
Yancomicina, Cefalosporinas de 3º generación, Aminoglucósidos, [Link] y pacientes
expuestos a ERV.

Se considera como reservorios de ERV a los animales (pollo, cerdo, vacuno) y Pacientes
hospitalizados portadores y se describen varios fenotipos de r~siste~ciá a glicopéptidos:
"'·
• Fenotipo VAN A: tiene Resistencia a Vancomicina y a teicoplanina.
• Fenotipo VAN B: tiene Resistencia a Vancomicina y susceptibilidad a teicoplanina.
• Fenotipo VAN C: intrínseco de especies animales, Resistencia a. Vancomicina y
susceptibilidad a teicoplanina.

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udp Escuela de
Tecnología Médica Manual de Mi~r~bÍÓlogí~ Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Pruebas convencionales para la identificación de Streptococcus y

Enterococcus:
• Hemólisis:

El agar sangre es un medio enriquecido utilizado para la siembra de la mayoría de las muestras
clínicas, permite el crecimiento de bacterias poco exigentes como exigentes. Este medio permite,
además detectar la producción de hemolisinas, enzimas ba~erianas que provocan la lisis de
eritrocitos. Existen 3 tipos de hemólisis de acuerdo a. la Clasificación de Brown, según el
comportamiento del Streptococcus frente a glóbulos rojos de cordero: alfa (hemólisis parcial},
beta (hemólisis total) y gamma (no hemólisis), que son especialmente útiles en el diagnóstico del
género Streptococcus. De esta forma se tiene: . .

Streptococcus B hemolíticos: son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos,
observándose como un halo transparente alrededor de las colonias.
Streptococc:us a hemolíticos: son aquellos que p·roducen hemólisis parcial, la cual se observa como
un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias.
Streptococcus Gamma hemolíticos: son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.

Relación entre la hemólisis, la especie y el grupo serológico de Lancefield:

Antígeno Espe_cies . Hemólisis

Grupo A S. pyogenes lthemolítico siempre
Grupo B _ S. agalactiae B hemolítico, generalmente
Grupo D [Link] No hemolítico, generalmente
Grupo D S. bovis No hemolítico, generalmente
No agrupable S. pneumoniae alfa hemolítico, siempre
No agrupable. Estreptococos grupo viridans ••. alfa hemolítico generalmente.
Agrupable o No Estreptococos grupo milleri alfa, B o no hemolítico

• Prueba del PYR:

Prueba para la identificación rápida · presuntiva de Streptococcus ~ hemolítico grupo A (S.

pyogenes) y de los Enterococcus. Ambos poseen la capacidad de hidrolizar el sustrato PYR
(pirridonil ~-naftilamida), debido a que poseen la enzima 1-piroglutamil aminopeptidasa (PYRasa).
Actualmente existen varios formatos para realizar esta prueba, los más avanzados se basan en un
ahorro de tiempo (10 a 15 minutos);'en las cuales el reactivo PYR se impregna en discos o tiras de
papel de filtro que se siembran con el material a estudiar, la hidrólisis del PYR libera ~-naftilamida,
que se detecta por el agregado del reactivo· N- dimetilaminocinnam aldehido. Este reactivo de
detección se une a la naftilamida para formar una base de schiff roja.

Procedimiento:
·-
Siembra: a partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en 50 µL de solución
salina estéril (0,85%), y agregar un disco de PYR ..

Incubación: durante 30 minutos a 35-37ºC, en aerobiosis. Cuando se utiliza para

diferenciar especies de Staphylococcus, la incubación se debe realizar según algunos
investigadores durante 2 horas a 35-372( en aerobiosis.

Nota: Antes de realizar la ·prueba del PYR es n~c~sario ~omprobar que el microorganismo en
estudio sea un Streptococcus, ya que otros microorganismos no estreptococos pueden dar positivo
al PYR.

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TM. Mg Cs. E,win L:andskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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udp Escuela de
Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnó[Link]ógico. Edición Nº7 - 2014

• Prueba de susceptibilidad a Bacitracina y SXT:

La susceptibilidad á bajas concentraciones del antibiótico bacitracina y a la combinación

sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) proporciona un método sencillo y económico para la
identificación presuntiva de los estreptococos ~ hemolíticos del grupo A y B. Los estreptococos, del
grupo A son sensibles a concentraciones relativamente bajas de bacitracina y resistentes a SXT.
Lo.s estreptococos del grupo B son resistentes a ambos antibióticos. Streptococcus pyogenes es
sensible Bacitracina (discos de 0,04U), sin embargo hay que considerar que también existe un 5%
de cepas de Streptococcus agalactiae que son sensibles a la Bacitracina.

. ___ /
Procedimiento:
_j

- Tomar 3 ó 4 colonias aisladas de estreptococos ~-hemolíticos y estriar el inóculo hasta el centro

de la mitad de una placa de agar sangre ó con una tórula diseminar el inóculo por toda la mitad de
la placa. .
- Colocar un disco de bacitracina (0,04U) y un disco SXT (1,25µg/23,75µg) sobre el área sembrada.
- Incubar la placa a 352c.

•j

Interpretación:

- Sensible __.. Tanto para SXT como para Bacitracina la aparición de cualquier diámetro
de halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco se considera .. /
prueba positiva.

- Resistente __.. Desarrollo hasta el borde del disco

s R Presumiblemente grupo A
,''""
'• /
R R' Presumiblemente grupo B

S/R s Ni grupo A ni grupo B

Nota: deben probarse solamente los estreptococos ~ hemolíticos, ya que muchos estreptococos alfa hemolíticos
(incluidos S. pneumoniae) son sensibles a bajas concentraciones de bacitracina.
S= susceptible; R= Resistente

• Prueba de CAMP (Christie; Atkins MUnch~Petersen). -~-

La prúeha de CAMP se utiliz~ pará la identificación presuntiva de S. agalactiae (grupo B de
Lance~ield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se prodúé:e al interactuar el factor
CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) producido por cepas de S. agalactiae con la beta
lisina de Staphylococcus aureus aparecie~do ~ná zona de lisis mayor de los eritrpcitos de un agar
sangre, en el punto d'e contacto de ambas bacterias. Ambos ·son productos extracelulares··que
difunden en ~I medio de cultivo para producir dicho efecto en fo~ma :de flecha cuando se utilizan
placas de agar sangre preparadas con glóbulos rojos de corder~. Una vez inoculados, lo~ ~edios
de cultivo deben ser incubados a 35-37ºC por 18-24_ horas.

Algunos [Link] recomiendan no incubar las placas de a·gar sangre para la prueba .de
CAMP en una atmósfera enriquecid_a con CO2 debido a uri probable efecto _inhibitorio .sobre, el
sinergismo.

. • ... ~ . ¡

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 udp Escuela de
r ·, Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Ed_ición Nº7 - 2014
"--'· ,.-
--r';
\.j

e Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo B-hemolítico en forma

perpendicular a una estría de un Staphy/ococcus aureus productor de 8-lisina en agar sangre,
procurando dejar un espacio de aproximadamente 1 cm entre ambas. Se incuba 18-24 horas a
37QC.

Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de
potenciación de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las dos
/·-
estrías.

• Prueba de la susceptibilidad a Optoquina:

Se realiza con un disco de 6 mm, con 5 µg de optoquina y tiene por objeto diferenciar las
cepas de S. pneumoniae de las de Streptococcus viridans. El clorhidrato·• de etilhidrocupreína
(optoquina), un derivado de la quinina; inhiben en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus
pneumoniae a muy bajas concentraciones (5 µg/mL o menos). Asimismo la optoquina puede
inhibir otros estreptococos del grupo viridans, pero sólo a concentraciones mucho más altas. La
prueba tiene una sensibilidad de más del 95%, es barata y fácil de realizar. Hay que tener presente
que del 3 al 5% de los S. pneumoniae son resistentes a la acción de la optoquina, debiendo tener
en cuenta este dato para evitar falsas identificaciones.

Procedimiento:

- Con un asa seleccionar 3 ó 4 col~nias bien aisladas del microorganismo a probar y estriarlas en
mitad de la placa ó estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con
una suspensión Me Farland 0,5. .
- Colocar un disco de optoquina en el centro del área estriada e incubar a 35ºC durante 18-24 h
en jarra con vela (o en estufa con 5-7% de C02),
Lea, registre e interprete los resultados.

Interpretación de los resultados:

Halo de inhibición de 14 mm o mayor . ~ Identificación presuntiva dé Streptococcus

pneumoniae (usando discos de 6 mm de diámetro). Halo de. inhibición menor, se debe realizar
Prueba de solubilidad en bilis.

• Solubilidad en Bilis (desoxicolato al 10%).

Normalmente se realiza cuando los resultados de la prueba de susceptibilidad a optoquina

no son concluyentes. Puede desarrollarse usando el "método en tubo" o el "método en placa". Las
sales de bilis específicamente el desoxicolato y el taurocolato de sodio tienen la capacidad de lisar
Streptococcus pneumoniae, cuando se adicionan a. una suspensión de un cultivo fresco de esta
bacteria de 18- 24 horas crecidas en agar sangre de [Link]· al 5%. Esta prueba se utiliza para
diferenciar entre 5. pneumoniae que es soluble eri bilis de otras especies dé Streptococcus alfa
hemolíticos, "insolubles" en bilis:: 5. pneuinoniae produce enzimas autolíticas que son las
responsables de la c_aracterística umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La adición de la
solución de sales de bilis a· 1á suspensión de la· bacteria, acelera el proceso de lisis, proceso
asociado con la disminución de la tensión superficial entre el medio y la membrana celular
bacteriana. La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar a partir de cultivos en caldo o en
agar sangre ovina al 5%. Dado que la solución de desoxicolato de sodio puede precipitarse a pH de
6,5 o menor, cuando se realiza la prueba de solul:iilidad en bilis ·a partir de cultivos en caldo, el
medio debe alcalinizarse para evitar una reacción falsa negativa.

udp Escuela de
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Tecnología Médica , · ,, ',
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Procedimiento en Placa:

- Usar un cultivo preparado fresco del microorganismo sospechoso.

- Elegir colonias bien aisladas y sobre ellas directamente, se coloca 1 gota de desoxicolato al 10%,
sin mover la placa, [Link] 15 minutos a temperatura ambiente.
- Cuando el reactivo goteado sobre la colonia esté seco, lea, registre e interprete los resultados.

Interpretación de los Resultados:

- Las colonias de S. pneumoniae son solubles en bilis y pueden desaparecer o aparecer como
colonias aplastadas.
- Las colonias de estreptococo resistentes a la bilis no se verán afectadas.

Reactivos: Desoxicolato de sodio al 10%.

Preparación:
Desoxicolato de sodio: 10 g
Agua destilada o desionizada: 100 mL

Mezcle y agite hasta disolver. Esterjlice por filtra~ión. Dispense 10 mL (cantidad aproximada} en
tubos estériles. La duración a temperatura ambiente son 6 meses.

• Prueba de tolerancia a la sal:

La capacidad de [Link] en presencia de cantidades variables de cloruro de sodio es

una propiedad que -1:ia sido utilizado para caracterizar varias bacterias. Sin embargo, es de
particular utilidad para la identificación presuntiva del género Enterococcus, que posee la
capacidad específica de desarrollarse en presencia de NaCI al 6,5%, ·incorporado a medios líquidos
o sólidos. Esta prueba junto con la de agar bilis-esculina se utiliza para distinguir especies de
Enterococcus de los Streptococcus grupo D (S. bovis y s. equinus} que no crecen en un medio con
en esa concentración de sal. El caldo infusión cerebro-corazón es un caldo nutritivo de uso general
que se utiliza para el cultivo de muchas bacterias. Normalmente contiene 0,5% de NaCI. Si se
aumenta la concentración de NaCI al 6,5% el medio se hace semiselectivo para el desarrollo de
Enterococcus.

Procedimiento:

- Inocular 2 ó 3 colonias en el caldo.

- Incubar toda la noche a 35ºC con aire ambiental.

Interpretación de los Resultados:

Reacción positiva: presencia de desarrollo bacteriano en el medio (turbidez}.

Si el microorganismo es bilis-esculina positivo y se desarrolla en caldo 6,5% NaCI, pertenece a una

especie de Enterococcus. Si es bilis-esculina positiva pero no se desarrolla en el caldo NaCI 6,5% es
un Streptococcus del grupo D.

Nota: Si el medio se inocula con una cantidad excesiva de bacterias, el inóculo puede ser
interpretado como desarrollo, lo que da resultados falsos positivos.

·- udp Escuela de
Tecnología Médica
TM Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM Pedro Cortés A.
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_Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

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• Prueba de bilis-esculina.

Esta prueba permite separar los estreptococos del grupoD de los demás grupos de estreptococos.
Se basa en la capacidad de los estreptococos grupo .D. de crecer en un medio de cultivo que
[Link] 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato
ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro.

• Técnicas de ~glutinación.

Los Streptococcus del grupo anginosus pueden aglutinar con varios grupos:
' . ' ' . - . ·- ·, ... . .

S. anginosus: A, C, G, F
s. constellatus: A, C, F
S. intermedius: F

Frente a un Streptococcus B-hemolíticos de colonia pequeña con olor a caramelo,

comenzar aglutinando con grupo F.

-Aglutinación positiva: Se informa como Streptococcus grupo anginosus

-Aglutinación negativa: Se informa como Streptococcus grupo viridans
· - Si aglutina con grupo G: Se informa Streptococcus anginosus
- Si aglutina con grupo A o C: Se informa Streptococcus grupo anginosus

---..,:·

•. _/

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Características preliminares para diferenciar los géneros Streptococcus y Enterococcus

Característica Streptococcus Enterococcus

Producción de leucina aminopeptidasa (LAP) + +
Producción de pirrolidonil-arila midasa (PYR) - +
Hidrólisis de esculina V +
Crecimiento en CTS conteniendo 6.5% NaCI V +
Crecimiento a 10ºC - +
Crecimiento a 45ºC - +

+ = ~ 90% de las cepas dan un resultado positivo; - = ~ 90% de las cepas dan un resultado negativo; V = 11-89% de las
cepas dan un resultado positivo. CTS = Caldo Soya Tripticasa.

Características diferenciales de Streptococcus y Enterococcus

Hidrólisis Susceptibilidad Otras Pruebas
Identificación Solubilidad
Hip Ese PYR Bac* Opt SXT CAMP NaCI· Hem**
Biliar
[Link] - - + .s R R - - 13 -
S. agalactíae + - - R R R + + 13 -
Otros S. r..-hem:
Grupos C,F,G. - - - R R s - - 13 -
S. bovís - + - R R s - - ó -
Grupo viridans - - - R R s - - aóó -
Grupo milleri - + - R R R - - a -
S. pneumoníae - - - V s s - - a +
Enterococcus - + + R R R - + y -

* = Prueba válida sólo frente a estreptococos ~ hemolíticos.

** = En agar sangre de cordero.
Hip = Hipurato de sodio.
NaCI = Caldo NaCI 6,5%
+ = ~ 90% de las cepas dan un resultado positivo; - = ~ 90% de las cepas dan un resultado negativo; V = 11-89% de las
= =
cepas dan un resultado positivo. S Susceptib_le. R Resistente.

,·
\
Pruebas bioquímicas diferenciales entre especies del género Enterococcus

Especie Arabinosa Telurito* Movilidad Pigmento

[Link] - + - -
('.

[Link] + - - -
r
E. casselif/avus + ± + +
L E. ga/linarum + - + -
e '
í
\__. * = Telurito de potasio 0,04% en agarTSA (agar Soya Tripticasa)
( .

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Tipo de metabolismo de cocáceas Gram positivas, catalasa negativas ,.__ /

Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos

' .·
Streptococcus Gemella Peptococcus
Entetococcus ' Allóiococcus Peptostreptococcus
Aerococcus Vagococcus Ruminococcus
lactococcus Tetragenococcus Coprococcus
leuconostoc Globictel/a Sarcina
Pediococcus .Helcococcus

Ejemplos de especies asignados a los diferentes grupos del género Streptococcus basados en el
.análisis de ARNr 165

Grupo Designación Especies Grupo de Lancefield

[Link] A
S. agalactiae - B
S. equi c.
1 Grupo piogénico S. dysga/actiae e
Varias especies G
S. canis L,M
S. porcinus E, P, U, V.
11 Grupo S. bovis S. bovis, S. equinus : D,.D

111 Grupo S. mitis S. .mitis, [Link], S. ora/is No aplicable

' . . . . ..-..
•, ,
'
IV Grupo S. mutans S. mutans, S. sobrinus No aplicable
V Grupo S. salivarius [Link] No aplicable
~
Grupo S. anginosus (ex. S. anginosus, S. constellatus '- ./
VI No aplicable
milleri). S. intermedius

S. acidominimus No aplicable_
VII Otras especies
S. suis R, RS,S,T

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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1 Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7- 2014
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ACTIVIDAD PRÁCTICA N2 2:
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OBJETIVOS:

1) Reconocer las características morfológicas y fisiológicas principales de los géneros

Streptococcus y Enterococcus.
2) Identificar las diferentes especies de cada uno de los géneros y su importancia en clínica.
3) Adquirir habilidades y destrezas en la identificación de las diferentes especies.
4) Determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de las cepas de susceptibilidad variable y·
su importancia en el control dé las infecciones producidas por estos géneros.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS:

Se entregarán cepas de Streptococcus y Enterococcus:

(

/-." 1. Cultivar y aislar en placas de agar sangre de cordero las cepas entregadas.
\__
2. Realizar estudio de morfología macroscópica y microscópica. Especial énfasis en las
distintas hemólisis.
Describa las colonias en las placas de agar sangre según:
a. Forma
b. Borde
c. Elevación
d. Superficie
(º e. Color
f. Tipo de Hemólisis

3. Realizar pruebas [Link]ón:. cata lasa, PYR,Jest de CAMP, bacitracina y optoquina,

agar bilis-escúlina y caldo sal al 6,5% ..

Diagnóstico microbiológico de una muestra problema entregada a los alumnos.

l. Realizar siembra de muestra problema en medios adecuados.

2. Realizar observación macroscópica y microscópica.
3. Realizar pruebas de identificación ..
4. Identificación del microorganismo.
5. Realizar diagnóstico de certeza mediante Test de Aglutinación de Látex, de acuerdo al
siguiente procedimiento:

Test de Aglutinación en Látex.

, Procedimiento

1. Utilizar 0,4 mL de solución de enzima para extraer el antígeno de pared celular y

depositar en tubo pequeño.
2. Tomar 4 - 5 colonias y emulsionar con el asa en el tubo con la solución enzimática.
3 .. Incubar por 10 minutos a 35Q C en baño termorregulado. Agitar los tubos por 2 a 3
segundos y poner por 5 minutos más.
4. Sacar, dejar temperatura ambiente.
5. Los anticuerpos deben estar a temperatura ambiente y se agitan vigorosamente.
6. Depositar una gota de cada uno de los reactivos con látex en el centro de los anillos
que están en las tarjetas.
7. Agregar una gota del extracto enzimático.
8. Mezclar con varilla de madera.
9. Rotar,
1 O. Utilizar control.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A
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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

QRQ.~N N~IS~~RIA~~~
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De acuerdo a la clasificación establecida-en la segunda edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (y actualizado con anexo especial Nº 5 de 2004), este orden comprende
sólo una familia de importancia para el ser humano: Neisseriaceae. Este orden forma parte de de
la Clase Betaproteobacteria, Phylum Proteobacteria.

- _j

Forman parte de esta familia de acuerdo a la segunda edición del Manual de Bergey de la
B'acteriología Sistemática {2005) y anexo especial del Volumen 4 de 2008, los géneros Neisseria,
Chromobacterium, Eikenel/a y Kingella. · · ·· · ·

,,Garaeterística·s·ge neralesi
L·::,--·.•c·.,,··~·---··------
j

. . . La familia Neisseriaceae está compuesta porfp"~;~~L~ªps,,~:ª~:;_;,ª~~~áre$7ylpor¿~:~·suB~31~5

se pueden presentar ~li_é@s, de a· {afJ:{IEI~~ZS~9~ª· Son ,§_ñi:p;17q1,rg~1,~yg;s, aunque-tienden a
resistir la decoloración. ~p-:;,~SP:<j)f'.\:1:1:¡:i:d~s y pueden presentar cápsula y salvo una excepción son
~fi&f@i:e;~ r~É_ffibs. fl~tfn~J:B¡es;·~ruaerq~reaw@!1Wo7reffgtere1Tua~·wrs}c1rr%:.a1e
[:§:@z. La f~~l1"J>J'!(cl{l(f,áVóilliN'a de desarrollo es de ~Z:liii32!Cl:W
...,,:.._,_.,,, ____..;.....,..:.,,.._;.-........-.,-· - sus requerimientos nutricionales
pueden ser simples o muy complejos. ~'f:o'tjgc~·r;i:;~X~~~¡y~~n;2~,:~~!~tgl5ª·
• .J
_Los miembros de esta familia son habitantes de las membranas mucosas del hombre y
animales.

Las especies patógenas primarias exclusivas para el s~r humano son i]yJ__iss1ú3ii
,~q~7tflff9:~:c1t~'JY ':f_!Jj!3~r_I,iiTme'í[Link], las que a su vez son¡pJiJ§1~~6:li~ffbs. [Link] bacteria
que anteriormente fue parte de la familia Neisseriaceae, cuál es l'f(lo.r:C1xeflriJ:atarrlfalis y que crece
en los medios de cultivo dando una morfología colonial similar a de Neis;~ria, ¡g:~ro:,'.que-;pued,e
~y ,.. ,:.,_ ··.-~. . ·-·-···-
Ías~ ~

if;e:(f~c:iJn:r~nt~;gifei;~n:ciéfd;ard~:~5'~)n~aJ~~~r11JJI~:bI~f@~~;.;5,a.

El género Neisséria presenta muchas otras especies, siendo N; cinerea, N. f/avescens, N.

lactamica, N. mucosa, N. sicca, N. sub/lava y N. elongata con sus subespecies elongata, , __ ./

glycolytica, y nitroreducens las que ~-

p,u~de!t:ser;;:ai-stap·a:s,desde; 0
el~ser;ho-m¿fntí·~como::sapro:bi•~~s,
~:::' ·>: '·"·:,·,. ·,:· - . :;;..,:..SL.s.~.:~'.:L.[~,i-~-.-_,_.,~~.::.:...:..,...:..._·•. · · · ··· .,, ·'' · , . ·· ' _...:;_··· ·. :~:._.!--,__...,.
pudiendo comportarse · como, Pl~Q:g¡f~os'ff,i:,eE_2ffaií}§}js especialmente -en -pacientes
inmunodeprimidos, principalmente en sepsis, cuadros óseos, meningitis, etc.

GrraEfeffsticas• móffólógicas)
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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7- 2014

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Las es pe ci es ij:iaroi!efüs:;'sorr:-e"g~g;rfrlf~EI:!t'~!r~@fti(lo, rfe1)yifiEiftclij AA tne'cfi6s; erírtqupcfo'.§s

í-- ;c,rn'-sanErr"é~~'fi_eñ:ffrraJ::-ar:nlfroctc:id<:rs"'SC'qr:o.s'-nt.,t'tl'.íenf~s. Estos los obtienen en medios como agar
'--✓

;t~~:&?~~~:;i~!~if~}~,~~i~~~;i;!~;;;;;\t;!;~~ás ([g;q)~_~;[l~y!fi]Jfjd Yun ~?J]2f~,

Las especies ~~:m'e_Jil~'.s en cambio c~~I'.fñ]_IJ;Ia::e;ro-~p-S:i~, en medios corrientes y son menos

termosensibles y menos fotolábiles. Algunas de estas· e;p:i:!}1~@/pti~clUéJFi;plgirle'fftpsXci~fotéii-6J§IJ?s
(ª1'ñarílfó0;.i.íé'raó:S:-o). Estas especies saprobias habitan las superficies mucosas y piel del hombre y
animales.

r-

Llamado también 'tgo~$", es un ID_'filg_gdcl),j:~J;~m~~'[~Jl~~ que tiene ,qr:Jl;l~~fffñ"f>Jia~

con sus lados adyacentes cóncavos o aplanados; ~t;:<f~19-X[á,l'@'.~~-~'iít~z"_¿lg§@P?:~~ñ[t~fi:~~9
epac¡a.~l~s. Por la acción de enzimas autolíticas estimuladas por el calor y un pH alcalino, pueden
~b~;se formas aberrantes, deformadas, grandes, vacuolazas o bien como cuerpos granulares
más pequeños. Pueden pr:_:,:!:_!~,: ifE!]:~;~a, @1Yl2r~r~PBsidón,- ,;;-~~J_a:,c:gmlka, sin
í
propiedades antigénicas.~á_QJirírnóv,J]gs. l~~IE~Jl · p~J~{eBfl~~es
~fil}fil~~s. Son [~2-st~-i;~;~r,1_~'i;tfes~s,@1ón. En medios de cul · -~-~~~;§n~~~~~c¡nr;;B_(l~~rmando
diferentes ~iP;?,SJ~;?lÍ~~¡i, siendo algunas d e ~ ~ ~=, diámetro d¡gjb.:~J¡~';'J~Q~~~o
( ¡JJ[z~~\f!;~¡ c:p'j'pJ:~'i'fl]]½B;il?:1;®,T6:Jgri§ªS~P· Estas características coloniales se asocian co~ la
@]1~[ff~~rnz;<1@?[Link]']]'as. También pueden desarrollar formando Cg!fI'!l~i2~:r:ª1.'.fd~[lmñVe3ias,
[:¿qo~~];~' 'i,1}~-~~~glgf@-:-da.§filBtP'<ilf§~Fa-~~9i:a;cp1,15~cr~:~IISf<r',9'~;f!~as.
\_

( la~:;P.B,~~r:¡;\'i11-¿~@Pltªs (de naturaleza proteica) se produce una gran ~i§:d~-d¡¡:a

i'S~~g~l'.):~~~2§:qr~tri!J:%~'g~i;i;~fil'ifü:isJ(f~J[Jj'.~a o blenorragia), ~~¡ei~i;ir.e~Ci-0~~,-
"''(ü>'AfOtras patologías menos frecue~tes son oftalmia neonatorum, faringitis, proctitis, artritis.

Uamado ta~bién 'm1~ni:n§P~~~,~-~,~~~~~~~~ía ~!~i,'ª!~~~·,i~!~~!~~!::~d as las

cepas presentan {;_~P ·ª·ª' ~~,1a1n:t1g:~SeJbfil@t,;,fos~,,agr1:13ªac{ceA<.'f~~;gm1;1os. N.
meningitidis es{;~;;;3R,fü~!!g~Jlj,~ que N'. _'!_~~orr~~eae ya que ~k~~~~Utcff-m1tt~ o.
Entre las ~~~9~;;i!'.i1:1lb.~].iR:ij];e;if:%rnierioa;~oJillli§ y humedad, f~í¡ffa:~o;lpn:i'ag~flCJ'.~~$ríillª-fi_t~,
rlisag{clcveces-,m[Link]oj[Link]s;Tugrisá
\::--::'\~~·•••••~.L.:..:.~.;.:.:...:..;_.,._-..,..., ...;_',
'·s .. J
ceas o de color miel.

Este agente se ubica en el ~~spJJlá.tótloVsfj\p1~Ií..6], existiendo un 10 a 40% de

portadores asintomáticos, porcentaje que aumenta en períodos epidémicos. Es agente de
meningitis cerebroespinal epidémica o endémica, dependiendo ello del serotipo infectante.
Ocasionalmente son agentes de rinofaringitis, - bronquitis, traqueobronquitis y sepsis
meningocócica.

GÉNERO EIKENELLA:

Eikenella corrodens es la única especie .del género. Es un bacilo Gram negativo, más bien
cocobacilo, no esporulado, no capsulado, inmóvil y anaerobio facultativo.

Es exigente en su desarrollo, requiriendo hemina y peptonas enriquecidas y un 3-5% de

C02, En estos medios presentan un deslizamiento sobre la superfície del agar y lo corroe. Son
oxidasa positiva. Es no hemolítico y posee olor característico en el medio de cultivo.

Es habitante normal de la cavidad oral, tracto respiratorio superior, y de la superficie

mucosa del intestino y tracto genitourinario. Es oportunista, aislándose de endocarditis,
meningitis, osteomielitis, neumonía, infecciones postquirúrjicas.
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GÉNERO KINGELLA:

· _El género Kingella tiene 3-~species: K. kingae, que coloniza e! tracto respiratorio superior,
principalment~ en niños, K. ora/is, que se encuentra en la cavidad oral y K. denitrificans cuyo -.
hábitat es desconocido.

Corresponde a bacilos Gram negativos cortos con extremos._rectos, no posee flagelos,

puede agruparse en pares o cadenas. En ocasiones puede resistir la decoloración de la tinción de
Gram, pudiendo ser confundido con . bacilos Gram positivos. . Anaerobio facult~tivo,
nutricionalmente fastidioso, de lento crecimiento, se desarroll_a en agar sangre, chocolate o
medios líquidos suplementados. Produce colonias de 1 a 2 nim · de diámetro a las 48 horas,
mucosas con una papila [Link], pueden presentar bordes_ irregulares. Presenta un pequeño_ halo
de ~ hemólisis en agar sangre de cordero .. Es oxidasa positivo y cata lasa negativo.

./

K. kingae era descrita como una rara causa de infección en humanos, sin embargo en la
última década han aumentado los reportes, probablemente por una mejor recuperac1on e
identificación, teniendo predilección por lactantes y niños menores en quienes produce
fundamentalmente infecciones osteoarticulares, También es causa de endocarditis,. sepsis,
queratitis e infección del SNC.

G:ÉNERO CHROMOBACTERIUM:

Este· género presenta sólo. una especie, Chromobacteriúm. viólaceum que es un· bacilo
:.· Grám negativo,·anaerobi~ facultativo, habitante común dél suelo y agua en las regiones tropicales
y subtropicales·que se caracteriza por producir un pigmento no difusible llamado violaceíria que da
a las colonias un distintivo color violeta, aúnque hasta 9% de las cepas aisladas no producen
pigmento. Esta especie crece bien en agar nutritivo a 37ºC a las 24 horas. Es oxidasa y cata lasa
positivo. '

Este microorganismo es un patógeno oportunista que rara vez produce infección. La

infección por esta bacteria ocurre, por lo general, luego de la :exposición de heridas al agua o
suelos contaminados. Sin embargo, también hay reportes de cuadros diarreicos donde la vía de
'tra'nsmisión füe la ingestión de agua contaminada. Se le ·asocia'á sepsis,·abscesos multiples en el
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hígado y dermatitis pustular difusa.
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Pruebas de identificación:

• Reacción OF Glucosa

Permite diferenciar la capacidad ·de las bacterias en estudio de oxidar y fermentar la glucosa bajo
condiciones aerobias y anaerobias respectivamente, produciendo ácido-o ácido y gas.

Procedimiento: sembrar en picadura 2 tubos de medio OF glucosa con la bacteria en

identifica·ción. A uno de los tubos se le agregará además vaselina líquida estéril para proporcionar
condiciones anaeróbicas. Se incuba a 37ºC por al menos 24 h.

Interpretación de los resultados:

Reacción Positiva: el medio originalmente verde cambia a amarillo

Reacción negativa: el medio permanece verd·e o vira al azul.
Fermentación: acidificación en ambos tubos 0/F = +/+ ·
Oxidación: acidificación sólo en un tubo aerobio 0/F = +/-

• Degradación de hidratos de carbono para Neisseria:

Consiste en determinar la producción de ácidos, a partir de hidratos de carbono en un medio

básico de agar con cistiha y tripticasa (CTA), adicionado de un indicador de pH.

Procedimiento: a partir de colonias. de 18 h. de incuba~ión desarrolladas en .medio no inhibidor en

microaerofilia, inocular el. plano inclinado del. CTA ~iólido, adicionado del hidrato de carbono
respectivo y en un CTA control. Si el medi9 a utilizar es semisólido, picar el medio en profundidad.
Ambas siembras deben reálizarse co~ un inóc'ulo espeso. lncÚbar a 35-37ºC en aerobiosis.. .
. ' . . .
Las reacciones positivas se observan dentro de las 24 h. de incubación. De lo contrario, dejar hasta
72 h.

Interpretación de los resultados:

Reacción positiva = produ~ción de ácido con viraje. del medio a color amarillo, prirnexo en el inicio
de la picadura.
( - Reacción negativa= no hay cambio de color del medio.
(

Deben tenerse presente las siguientes precauciones:

a) la presencia de C02 da falsas reacciones positivas, porque el gas se disuelve en el medio para
formar un ácido bibásico débil, el ácido carbónico.

b) inóculos realizados con cultivos de más de 18 h de incubación pueden llevar a resultados tardíos
en las pruebas bioquímicas, debido a la autolisis celular.

c) inóculos realizados a partir de medios inhibidores pueden dar como resultado falsos positivos,
por presencia de microorganismos contaminantes que crecerían al no estar en presencia del
inhibidor.

d) reacciones tardías falsamente positivas también pueden producirse si el inóculo se realizó a

partir de un cultivo con hidrato de carbono.

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• Reacción Oxidasa --

Está basada en la producción de la enzima oxidasa, la que al encontrarse en - presencia de oxígeno

·atmOsférico, citocromo C y un rea·ctivo oxidasa, Oxidan el react_ivo para formar indofenol que es un
compuesto coloreado_.

-Procedimiento: la técni¿a consiste· en tomar con la punta de ·un asa una pequeña cantidad de
cultivo bacteriano de 24-48 horas de edad y transferirlo a un trozo de papel filtro previamente
embebido .con el reactivo_oxidasa. La lectura debe realizarse dentro de 30 segundos.

Precauciones:
- -
1 La prueba no debe realizarse sobre cultivos -- en medios con glucosa, ya que su
fermentación inhibirá la actividad de la enzima.
·2 Se han observado falsa·s reacciones positivas al hacer la prueba a partir de cólónias
obtenidas· en medios con demasiada sangre. .
3 El fierro contenido en el.m.e5iio o bien, liberado por el_ asa puede catalizar la oxidación del
reactivo, dando falsos positivos. ·
4 La reacción positiva debe leerse por un cambio de color de las colonias y no por el medio
que las circunda.
5 No utilizar reactivo de Kovacs para determinar indo!.
6 Una vez que las colonias se han ennegrecido éstas pierden su viabilidad.
7 Se puede utilizar diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina en vez de diclorhidrato de
tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, el cual es más estable pero menos sensible. Por ..esta
razón el segundo compuesto debe [Link] d}ariamente dando u_na solución incolora.
Proteger de la luz.

Principales características de los géneros de la familia Neisseriaceae de importancia·para el ser

humano

Característica - Neisseria Kingella Eikeñella Chromobacterium.

Morfología diplococos Coco bacilos bacilos bacilos
Oxidasa + + + +
Catalasa + - - +
Crecimiento anaerobio - + + +
Ácido de glucosa V + - +

Características diferenciales de los géneros Neisseria y Kinqel/a con Moraxella (anterior integrante
de la familia Neisseriaceae)

Características
Ácido a partir
Morfología celular Oxidasa Catalasa
de glucosa
Neisseria Diplococos 1 + + V
Kingelfa Cocobacilos + - +
2
Moraxelfa Diplococos + + -
1
N. elongata tiene forma bacilar. La producción de ácido depende de cada una de las especies del - J

género.
2
Moraxella actualmente pertenece a la familia Moraxelfaceae, orden Pseudomonadales.

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 udp Escuela de
Tecnología Médica 100 , ,'
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Características diferenciales de N. qonorrhoeae, N. meninqitidis, K denitrificans y M catarrha/is

N. M.
Característica N. meningitidis K. denitrificans
gonorrhoeae catarrhalis 1
Crecimiento en agar sangre - V + +
:Beige agris, Beige a gris, Beige a gris, Rosada,
Morfología colonial en agar
: transparente, transparente, transparente, . opaca, seca,
chocolate
lisa, 0.5 -lmm lisa, 1-3 mm lisa, 1-2 mm 1-3 mm
Ácido.a partirde:
Glucosa + + + -
Maltosa - + - -
Lactosa - - - -
Sacarosa - - - -
Fructosa - - - -
N03 • N02 - - + +
DNAsa - - - +
1
Moraxella actualmente pertenece a la familia Moraxellaceae, orden Pseudomonadafes.

Características bioquímicas de Eikenel/a corrodens

Pruebas bioquímicas Resultados

Oxi_dasa +
Cata lasa -
Motilidad -
Lisina descarboxilasa +
Ornitina descarboxilasa +
Nitrato a Nitrito +
Ácido y gas a partir de carbohidratos -
Indo! -
Esculina -
.. --

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 TABLA CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIÉS DEL GENERO NEISSERIA (DE IMPORTANCIA PARA EL SER HUMANO}

CARACTERISTICA N: gono_rrhoeae [Link]ítídis . N. lactamica · N. sícca N. subf/ava N. flavescens [Link] N. cinerea N. elongata

cocos + + + + + + + + -
FORMA
bacilos - - - - - - - - +
pares + + + + + + + + +
_, -
li\GRUPACIÓN
tetradas - - + + + - -
cadenas
cortas
- - - - - - - +

PIGMENTO AMARILLO - - +. d :+- + d d. w

oveja .. - - - d - - - . - -
HEMÓLISIS ·.

SANGRE DE: humana - - d - - - 1,

- -
,.
OXIDASA ·+ + + + + + + + +
glucosa + + + + + - + - -
maltosa - + + + + - + - -
PRODUCCIÓN DE fructosa· - - - + d - + - -
~CIDO EN CTA sacarosa - - - + d - + - ~

manita · - - - - - - - - -
.. - -
lactosa · . - + - - - - -a

REDUCCION DE NITRATOS ., ·. - - - - - - + - -
REDUCCION DE [Link] b -b + + + + + + +
+: 90% o más son positivas; -:-90% o más son negativas; d: 11-89% son positivas; w: reacción positiva débil; a:_unas pocas cepas pueden formar una pequeña cantidad de ácido a partir de glucosa,
mayoría negativas; b:_ el nitrito en bajas concentraciones puede ser reducido a N2 por N. gonorrhoeoe y por serngrupos A, De Y de N. meningitidis.

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1. Características generales

Con el término de bacilos Gram negativos no fermentadores (BNF), se designa un

heterogéneo grupo de microorganismos que constituye, aproximadamente, el 15,0 % de todos los
aislamientos en los laboratorios de microbiología clínica.

En el grupo de BNF se encuentran géneros como Moraxe/la, Acinetobacter,

Psychrobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Achromobacter, Bordetella, Olige/Ja,
Stenotrophomonas, Shewanella y Chryseobacterium, entre otras de menor importancia médica.
Esto demuestra que corresponden a bacterias tax~>nómicamente muy diversas, pero esta
agrupación es útil para_la clasificación en el diagnostico clín,ico.

Este grupo de bacterias se consideran como patógenos oportunistas, especialmente de

infecciones intrahospitalarias, donde los principales factores de riesgo para los pacientes son
tratamientos con antimicrobiancis y/o cirugía, instrumentación y permanencia del paciente en
salas de cuidados intensivos por períodos prolongados. Sólo una especie es patógeno obligado
para el ser humano: Burkholderia pseudomallei (agente etiológico de melioidosis). La necesidad
de dilucidar si se trata dé una infección o una simple colonización así como sU elevada resistencia a
los antimicrobianos, convierte al aislamiento de estos agentes bacterianos en muestras clínicas en
un problema grave para los pacientes ya que compromete su recuperación de forma importante.
Los BNF son un grupo de microorganismos aerobios, que o bien no utilizan hidratos de carbono
como fuente de energía, o los degradan a .través de vías metabólicas diferentes a la fermentación.
La identificación de BNF ocasiona numerosas dificultades en los laboratorios, ya que la mayoría de
las pruebas bioquímicas corrientemente usadas para el diagnóstico bacteriológico resultan, con
frecuencia, poco útiles para estas bacterias.

Estas especies son incapaces de acidificar medios como el TSI y crecen considerablemente
mejor en condiciones aerobias que en condiciones anaeróbicas. A las pruebas de escrutinio que se
utilizan para su identificación como morfología microscópica, oxidasa, movilidad, prodúcción de
indol y acidificación de carbohidratos, se le han agregado pruebas como el crecimiento a
temperatura ambiente y crecimiento en. medios selectivos como el agar Mac Conkey. Algunas
cepas solamente crecen a'temperatura ambiente y son incapaces ·de crecer en este medio;

2. Significado clínico

Pseudomonas aeruginosa es la especie más frecuentemente aislada del grupo de bacilos

Gram-negativos no fermentadores, .. seguida de Acinetobacter sp. y Stenotrophomonas
maltophilia. Estos dos últimos agentes_se [Link] por producir infecciones intrahospitalarias y
en su gran mayoría se asocian al uso _de respiradores o al implante de catéteres. Como una
característica importante, estos. dos agentes presentan. una elevada resistencia natural a los
antibióticos y son capaces de adquirir resistencia contra· otros antibióticos con facilidad. Por lo
anterior, estos agentes son [Link] el ambiente hospitalario y son cada vez más frecue11tes
los aislamientos de estas bacterias produciendo infecciones severas.

A continuación se descril:ieri IÓs órdenes; familias, géneros y-especies de BNF que tienen mayor
importancia para el ser humano.
 1

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Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

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De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda .[Link]ón. del Man [Link]. de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (2005), este orden comprende dos familias de importancia para el ser
humano: Moraxel/aceae y Pseudomonadaceae. Este orden forma parte de de la Clase
Gammaproteobacteria, Phylum Proteobacteria.

FAMILIA MORAXELLACEAE

.La familia Moraxel/aceae comprende 4 géneros, siendo 3 los de importancia dínica:

Moraxella, Acinetobacter y Psychrobacter.

Este grupo bacteria está formado por bacilos y cocos aislados, de a pares o formando
cortas cadenas. Son Gram negativos, pero con tendencia a resistir la decoloración. Son inmóviles y
pueden ser capsulados y fimbriados: Son quimiorganótrofos aerobios y productores de oxidasa,
excepto Acinetobacter. Generalmente producen catalasa. Algunas especies son parásitos de las
mucosas de hombre y animales, causando ocasionalmente infecciones. Las otras especies se
encuentran asociadas a alimentos y al medio ambiente.

GÉNERO MORAXELLA:

•. El género Moraxel/a está compuesto por las siguientes especJes:

.M. lacunata, M.. nonliquefaciens, M.. bovis, M'. atlantae, M. osloensis, M. catarrhalis, M. avis, M.
caviae, M. cuniculi, M. canis, M... caprae, M. Equi y M. lincolnii.

M. phenylpyruvica fue reclasificada dentro del género Psychrobacter; denominándose

Psychrobacter phenylpyruvicus.

Moraxella lacunata:

Es agente de un cuadro infeccioso conocido como blefaroconjuntivitis angular crónica. Si

bien la conjuntivitis puede ser causada por una gran variedad de microorganismos de los cuales
M. lacunata es uno de los menos aislados, es importante debido a que puede provocar úlceras
en la córnea. Por otra parte, M. lacunata es la única especie exigente en su desarrollo, ya que
para crecer en medios artificiales requiere de suero de conejo, debido a que éste le sirve de
· neutralizador del efecto tóxico de ciertos componentes de fas peptonas.

Moraxella catarrhalis:

Esta especie fue conocida antiguamente como Neisseria catarrhalis y Moraxe/la subespecie
Branhamela catarrhalis). Habita normalmente en la cavidad nasal y menos comúnmente en la
faringe. Se la ha aislado de secreción de los senos maxilares, oído medio y aspirados bronquiales
en bronquitis y neumonía,· y ocasionalmente en infecciones· sistém1cas. A diferencia de las otras
especies citadas que morfológicamente corresponden a bacilos, M. catarrhalis es un diplococo
Gram negativo, morfológicamente similar a ·las Neisserias, aunque difiere·n en sus características
genéticas. Crece en medios corrientes, con colonias de· menos de 2 mm. de diámetro y son
apigmentadas.

Se decolora con dificultad formando a menudo tétradas, con las caras planas adyacentes.
Las células más viejas tienden a la autolisis, por lo que se observan hinchadas y de diferentes
tamaños. Es aerobia estricta y no utiliza glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa ni fructosa. Una de
las características bioquímicas que permite diferenciar a esta especie del género Neisseria es que.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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v,, Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014 _
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el 100% de las cepas producen DNAsa, característica que no poseen estas últimas. También se
pueden diferenciar de las Neisserias en que M. catarrhalis no acidifica la glucosa, maltosa y
sacarosa y reduce los nitratos.· Aproximadamente·. el 90% de las cepas aisladas de muestras
clínicas son productoras de ~ lactamasa, produciendo una de dos tipos (BR0-1, o menos
comúnmente, BR0-2) confiriéndoles resistencia a penicilina y ampicilina. También .se ha descrito
resistencia adquirida a tetraciclinas · y cotrimoxasol. La resistencia a macrólidos es muy
infrecuente. · · ·

r·· Las especies M. lacunata, M. nonliquefaciens, M. bovis, M. atlantae, M. osloensis, M.

catarrhalis y M. lincolnii son aerobias, no· exigentes en su cultivo, parásitos obligados, ya que no
hay evidencias que se encuentren en el medio ambiente, aislándose fundamentalmente de la
r --.
nasofaringe del hombre. Muchas de. estas especies actúan. como patógenos oportunistas, es
decir, causando enfermedades ·en aquellos g·rupos de pacientes que presentan factores
predisponentes. Por ejemplo, M. nonliquefaciens se ha aislado ocasionalmente en secreción
nasal de pacientes con sinusitis crónica, en desgarro y secreción bronquial de pacientes con
cuadros pulmonares crónicos; sin embargo, su rol como patógenos no ha quedado bien
establecido.

Las especies M. caviae, · M. ovis, M. cunicu/i, M. i:anis, M. · caprae y M. equi también

corresponden a diplococos arriñonados Grám negativos y se aíslan de animales.

GÉNERO ACINETOBACTER:
,_

Su nombre deriva de "akinetos" ("a"= sin, "kine" = movimiento), falta de actividad motriz,
es decir es inmóvil. Las bacterias del género Acinetobacter son bacilos o cocobacilos Gram
negativos, muchas, veces dispuestos en parejas. Se observan como diplococos en la fase
estacionaria de crecimiento y como· bacilos· aislados o 'diplobacilos en la fase exponéncial. No
e fermentan la glucosa y son aerobios estrictos, cata lasa positivos y oxidasa negativos. Crecen bien
en todos los medios de cultivo de rutina, siendo su temperatura óptima de crecimiento de 33 a
35º C.

Hasta el momento se han descrito 16 especies, siendo las más relevantes para el ser
humano A. calcoaceticus, A. baumannii, A. haemolyticus y A. /woffi.

Estas especies se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y forman parte de

la microbiota de l,a piel del ser humano, especialmentE? en zonas húmedas como axilas e ingle. Se
les puede en~ontrar en el medio hospitalario cor:isiderá[Link] _como impoi:tantes patógenos
nosocomial~s, especialmente en enfermos inmunodeprimidos y en pacientes de unidades de
cuidados intensivos. Actúan como oportunistas pudiéndose aislar desde infecciones del tracto
urinario, sangre, aspirados bronquiales y heridas inf!=!ctadas. Entre los factores de riesgo que
predisponen a la infección por A. baumannii están el alcoholismo, tabaquismo, enfermedad
pulmonar crónica y procedimientos invasivos en pacientes hospitalizados. El principal lugar
anatómico de colonización e infección por A. baumannii es el tracto respiratorio, de aquí la
importancia clínica de esta especie en las neumonías nosocomiáles, especialmente en pacientes
de UCI que requieren yentilación mecá,:iica,' co11stit(.!yendo actualmente una complicación
/'•
importante en este tipo de enfermos.
: ~ '!" • +

Se ha establecidp que. algLJnas. cepas pueden sobrevivir. en el ambiente hospitalario

durante años debido a su ~esistencia a las droga~.antimi~rolJians o a su capacidad de [Link] en
[Link] secos inanimad,os . como _instrumen~os médicos, .guantes, almohadas, sábanas y
estructura de las camas de los hospitales, etc._Se considera que el personal de los servicios
hospitalarios es la fuente principal que origina brotes hospitalarios.
r.

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GÉNERO PSYCHROBACTER:

Sólo la especie Psychrobcicter phenylpyruvicus (antiguamente Moraxe/lá·phenylpyruvica)

ha sido descrita en cuadros clínicosmuy esporádicos en el ser hum~rio; como agente de artritis
séptica, absceso del pie, y una pÓsible endocarditis infecciosa. Esta especie. corresponde a un
cocobacilo Gram negativo que crece bien en agar sangre y agar chocolate, no se desarrolla en agar
Mac Conkey, es·no hemolítico, oxidasa y catalasa positivos; no ferme·ntador; inmóvil, que reduce
• .I
nitratos a nitritos, desdobla la urea· y desamina tanto fenilalanina como triptófano. Los sistemas
comerciales para. la identificacicm de bacilos Gram ·negativos ·ria fermentadores (APl20NE,
Biomerieux, E.U.A} pueden identificar Bruce/la melitensis_ erróneámente como P. phenylpiruvicus,
po'r' lo ·que es· necesario la 'diferenciación mediante la aglutinación con antisueros para Bruce/la,
· una revisión exhaustiva de la tinciónde Grani y la consideración· que P. phenylpiruvicus desamina
la fenilalanina. ·

FAMILIA PSEUDOMONADACEAE

Esta familia está compuesta por un grupo grande de patógenos oportunistas de plantas y
:animales. Comprende,actualmente de 10 géneros, de los cuales sólo el género Pseudomonas es
-~
importante para el ser humano. )

Son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el

suelo, materias orgánicas en descomposición, vegetales y aguas y en-el ambiente intrahospitalario. '· ,,)

. Morfológicamente corresponden- a bacilos Gram negativos rectos o ligeramente curvos,

· -moviles por uno o varios flagelos· polares. Utilizan los carbohidratos a través de metabolismo
oxidativo, pero no fermentativo por ser aerobios estrictos. No son exigentes en su cultivo; Son
· oxidasa positivo.

GÉNERO PSEUDOMONAS:
. ./

El género Pseudomonas ha sufrido importantes cambios taxonómicos en el último tiempo.

La especie tipo es P. aeruginosa y d_e la gran variedad de especies [Link] y P. putida tienen
importancia pa~a el ser humano. Existe otrn género con~cido como Burkholderia donde se han
agrupado otras especies que pertenecieron anteriorment~ al gé[Link] d~ las Pseudomonas siendo
Burkholderia cepacia, Burkholderici pseudomallei y [Link] mallei ias que se han aislado de
muestras clínicas.

Pseudomonas aeruginosa:

" . . .. - ' ''• . . . . . . . . '

Es el bacilo no fermentador .más [Link] a partir d_el ser humano. las características de esta
. especie y que permite su identificación es un olor caracterísÚcci como a uvas· producto de una
. aminocetofen~na, el tipo de colonias. y• la producción de Piocianina (un exopigmento que
corresponde a una f~nazina,· no. fluorescente de color azui, soluble -en agua y cloi-ofcirmó}. ·Este
0

pig~ento es exclusivo_.de P. aeruginosci. Si la cepa ,°además produce otro pigmento denomina

pioverdina ([Link]ína}, le confiere un. color grisáceo al medio de. cultivo. También puede ·• .,.1

producir piorrubina y pio;,;elanin~ . que enmascaran la piodanina. Es·_. un. ba~ilo que ,mide
aproximadamente de 0,5 a 1 µm de ancho por 3 a 4 µm de largo; posee un solo flagelo, pero en
forma ocasional algunos pueden tener dos o tres. Es capaz de crecer a 42ºC. Al igual que otras
Pseudomonas fluorescentes, produce cata lasa y oxidasa, así como amoniaco a partir de la arginina,
y puede utilizar citrato como única fuente de carbono.

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Los factores que contribuyen a la patogénesis y virulencia incluyen la capacidad de

adherencia, producción de toxinas y producción de glicocálix, lo cual puede favorecer la formación
de un biofilm mucoso alrededor de las colonias, formando una barrera contra las defensas del
hospedador, los antibióticos y desinfectantes.

P. aeruginosa junto con los demás BNF se caracteriza por ser patógeno oportunista o
potencial ya que en condiciones normales no le produce daño a su hospedador normal, pero sí
tiene la capacidad de producir enfermedad cuando hay factores predisponentes. ··

Coloniza predominantemente partes dañadas de[_organismo, como quemaduras y heridas

quirúrgicas, el aparato respiratorio· de personas con enfermedades subyacentes o las lesiones
físicas en los ojos, produciendo infecciones de tipo piógeno. Desde estos lugares puede invadir el
organismo y causar lesiones_destructivas o sepsis y meningitis. Las personas con fibrosis quística o
inmunodeprimidas son propensas a la colonización por P. aeruginosa, que puede conducir a
infecciones pulmonares progresivas graves. Las foliculitis y las otitis relacionadas con el agua se
asocian con ambientes húmedos y cálidos como las piscinas y bañeras de hidromasaje.

Esta es la especie es el BNF más aislado del ambiente: puede encontrarse en las heces, el
suelo, el agua y las aguas residuales. Puede proliferar en ambientes acuáticos, así como en la
superficie de materias orgánicas propicias en contacto con el agua. Se le ha aislado de fuentes
inanimadas dentro del área hospitalaria como soluciones terapéuticas, desinfectantes (amonios
cuaternarios y clorhexidina), jabón hexaclorofeno; forceps, catéteres, termómetros, incubadoras,
etc .. Tiene gran importancia clínica yá que presenta resistencia natural a la mayoría de las drogas
''-- antimicrobianas y es considerada un importante agente de infección intrahospitalaria (o
nosocomial).

De acuerdo a distintas fuentes bibliográficas, P. aeruginosa es responsable del 17% de Jas

neumonías asociadas a asistencia respiratoria mecánica, 11% de infecciones del tracto urinario, y
3,8% de bacteriemias primarips en las unidades de cuid_ados intensivos de adultos. Sin embargo en
. las unidades de padentes quemados, ~s causa del 21,5% de las neumonías; 20%.de las infecciones
urinarias y 9% de las bacteriemias primarias. Otros estudios muestran que es el bacilo. Gram
negativo mas frecuentemente aislado (27%) y el más comúnmente encontrado en _los cultivos de
traqueostomías.

Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida:

Estas especies poseen las mismas características descritas para el género, móviles por uno
o varios flagelos localizados en un polo, que pueden variar de 1 a 6 y que permite diferenciar estas
dos especies de P. aeruginosa, la cual es generalmente monótrica.

No producen piocianina y la producción de pioverdina es variable. Tampoco crecen a 42ºC.

Una diferencia entre ambas especies es que P. f/uorescens posee mayor actividad proteolítica que
P. putida.

Las especies P. fluorescens y P. putida se aislan de suelo, agua y plantas y están asociadas
al medio ambiente hospitalario. Son recuperadas con menor frecuencia en muestras humanas. Sin
embargo, P. fluorescens es considerado igualmente como típico patógeno oportunista para el
hombre, asociada . a sepsis ocasionada por diversas·· causas, · como he_ridas, transfusiones
san,guíneas, infección post~opératoria y'enfermedades inflamatorias de la pelvis. Pcir su parte; P.
putida ha sido asociada igualmente a sepsis, transfusiones de sangre, además de bacteriuria y
bacteremia asociada con contaminación intravascular. Pueden formar parte de la microbiota
orofaríngea y la mayoría de los aislam!entos son de muestras de tracto respiratorio, en especial de
pacientes con fibrosis quístka:

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, ,.•·•.••.·.-

. udp Escuela de -
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De acuerdo a la clasificación establecida en ia segunda edkión del Man [Link] de Bergey de la

Bacteriología Sistemática · (2005), este orden comprende dos familias, de las cuales
A/teromonadaceae con de_ su género Shewanelfa tiene importancia clínica en el ser humano. Este
orden forma parte de de la Clase Gaínmaproteobacteria, Phylum Proteobacteria.

FAMILIA AlTEROMONADACEAE·
Esta familia está compuesta de 14 géneros, siendoShewanella el de importancia para el -.
ser humano.

GÉNERO SHEWANELLA:

Este género ha sufrido v:arios cambios taxonómicos. Sus especes han formado parte de la
familia Vibrionaceae y Flavobacteriaceae. Tiene amplia distribución en la naturaleza como
ar:nbientes antárticos, sedimentos, campos petrolíferos y alin,entos deteriorados con elevado nivel
p~oteico.' Se· la puede considerar como una patógena oporturiistá para humanos ·y animales . /

acuáticos. Hasta el mciniénto, se han descrito 2 especies de importancia en [Link] humanó. , ..

Shewanella putrefaciens

Inicialmente fue denominada como Achromobacter putrefaciens, luego fue reclasificada

como Pseudomonas putrefaciens. Sin embargo, su contenido en G+C respecto a otros miembros
característicos del género Pseudomonas hizo que su reclasificación se modificara de nuevo y se
designara como Alteromonas putrefaciens. Gracias a los nuevos estudios filogenéticos, esta
especie fue reagrupada finalmente en el género Shewanella.

Esta especie agrupa bacilos Gram negativos no fermentadores, siendo su principal

característica fenotípica la de producir H2S en el TSI. Crece en agares comunes a las 48 horas,
prodüciendo coloniás color salmón o marrón bronceado. Es oxidasa y cata lasa positivo. Es lactosa,
sacarosa y glu~osa negativo. No descarboxila la lisina. Es citrato y o~nitina descarboxilasa positivo.
No es capaz de crecer en caldo 6,5% de sal.

Se le considera un patógeno oportunista en el ser humano, causando infecciones

asociadas con otras bacterias en . pacientes con endocarditis infecciosa, abscesos en las
ext_remidades inferiores, infecciones de los tejidos blandos o en tejidos intraabdominales de
pacientes con diálisis peritoneal, en pacientes con neumonía asociada a ventiladores, empiemas
torácicos, en pacientes con bacteriemia, en infecciones del tracto biliar, oculares y abscesos
cerebrales. En general, los pacientes afectados son adultos y ancianos .con enfermedades de base,
sin embargo también hay publicaciones que señalan el aislamiento en niños de corta edad que
presentan complicaciones clínicas.

Esta especie es susceptible a gentamicina, piperacilina, cefotaxima y tetraciclina.

Shéwanella a/gae
,./

Esta especie presenta gran similitud ·fenotíprca con 5. · pútrefaciens, sin embargo a
diferencia de ésta, es capaz de crecer en caldo sal 6,5% de sal y forma colonias en agc1r sangre que
presentan un color que varía del verde_ al naranja. El color verde, qUe también puede observarse
en fluídos orgánicos de pacientes, se debe a la capacidad de la bacteria de reducir el fierro (111).
Otra diferencia es que S. a/gae puede formar colonias mucoides y hemolíticas (del tipo beta) en
agar sangre de cordero. Además es capaz de crecer a 42ºC y producir ácido a partir de la maltosa.

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Se asocia comúnmente a infecciones áticas y de tejidos blandos, pero también algunas
más graves como bacteremias, meningitis, endocarditis infecciosa y pericarditis purulenta. Se le ha
descrito también causando osteomielitis en un paciente con fractura expuesta que tuvo contacto
con agua estancada. En efecto, normalmente las infecciones ocurren por el contacto de heridas
con agua contaminadas con la bacteria. Más atípicamen_te se le ha descrito causando diarrea
crónica sanguinolenta.

Estudios realizados en r~tón ~ugieren que S. algae es más virulenta que S. piltrefaciens
debido probablemente a que produce una sustancia hemolítica o exotoxina.

S. algae es caracterísicamenté susceptible a aminoglicósidos, carbapenems, eritromicina y

quinolonas. Al igual que S. putrefaciens, es susceptible a gentamicina, piperacilina, cefotaxima,
pero al contrario de esta, es resistente a penicilina.

í
De acuerdo a la clí:!sificación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la
Bacteriología Sistemática (2009), este orde.n propuesto posee una familia de importancia para el
ser humano: Flavobacteriaceae, específicamente los géneros Chryseobacterium, Myroides y
Empedobacter. Este orden forma parte de de Ia Clase Flavobacteria, Phylum Bacteroidetes.

FAMILIA FLAVOBACTERIACEAE
(

GÉNERO CHRYSEOBACTERIUM:

Este g~nero inciuye bacilos Grám negativos, 'oxidasa· positivo, que producen colonias
pigmentadas. A diferencia ·de la fámília Morax~/lar::eae, que por ser aerobia estricta, no es capaz de
utilizar la glucosa· en condiciones anaeróbicas del· género, ef género Chry~eobacteríuin lo háce
·pero muy débil y lentamente, por lo cual algunos autor_es considera~ a este género dentro dé los
BNF.

La especie más importante para el ser humano es Chryseobacterium meningosepticum

(anteriormente [Link] como Flavobacterium ineningosepticum) y corresponde a bacterias no
móviles, oxidasa positiva que producen un pigmento amarillo. Es un ·agente de infecciones
intrahospitalarias y causante de meningitis y' sepsis neonatal, aunque es muy raro encontrar esta
especie en infecciones de adultos. Esta especie coloniza· vías respiratorias, por lo que es frecuente
encontrarlo en aislamientos de muestras clínicas humanas.
··-
Esta especie crece bien en agar sangre, produciendo colonias pequeñas, húmedas y
amarillas.

Las otras especies que pertenecieron al género Flavobacterium y que también han sido
descritos en cuadros clínicos en seres humanos fueron reclasificados: Flavobacterium odoratum es
actualmente Myroides odoratus y Flavobacterium brevis es actualmente Empedobacter brevis. La
especie Flavobacterium muitivorum fue reclasificado como Sphingobacterium mu/tivorum y
FlavÓbacterium spiritivorum como Sphingobacterium spiritivorum, ambos. pertenecientes. a la
. familia Sphingobacteriaceae, orden "Sphingobaéte~iale~_":. .

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. De acuerdo a·· Ia dasificaéión establecida en la segund'a edidón del. Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (2005), este orden propuesto .comprende sólo una familia propuésta:
"Xanthomonadaceae". Este orden forma parte de de la Clase Gammaproteobacteria, Phylum
Proteobacterla.

FAMILIA "[Link]"
Esta familia comprende 12 géneros, de los cuales sólo Stenotrophomonas tiene
•. importancia médica.

GÉNERO STENOTROPHOMONAS:

El género comprende 5 especies, siendo Stenotrophomonas maltophilia la úQica de

interés clínico. Anteriormente esta especie estuvo agrupada dentro del género Pseudomonas
(Pseudomonas maltophilia) y luego dentro del género Xantomonas (Xantomonas maltophi!iá). ·

Después de P. aeruginosa, Stenótrophomonas maltophilia es el bacilo no fermentador

más aislado de muestras clínicas. Es un patógeno oportunista que se aisla de agua, leche y ·./

alimentos congelados.

· Corresponde a un ·bacilo recto y en ocasiones ligeramente· cúrvo, con una longitud de 0.5 a
'1.5 µm; aislados o agrupadós en pares. Las colonias desarrollan en forma rápida en los medios de
cultivo corrientes ya que no es exigente, y desarrolla un característico color café verdoso en agar
sangre que se intensifica con el aumento de temperatura, además de un fuerte olor amoniacal. En ~.
agar Mac Conkey las colonias son rugosas de 3 a 5 mm de diámetro. Es móvil a temperatura
ambiente (flagelos polares) y variable a 37ºC. Generalmente es ~o hemolítica. No crece a una
temperatura inferior a 5ºC, y a u~á terri°perat~ra superior dé 40 ót, siendo la temperatura óptima
de crecimiento 35 ºC. Es una bacteria de vida libre, de amplia distribución geográfica, aislándose
____ /
también del ambiente hospitalario donde produce infecciones iritrahospitalarias, por lo cual forma
parte de la microbiota transitoria del paciente hospitalizado. Ha sido aislada de muestras , ..,,,,/

provenientes de heces de humanos y animales. Puede encontrarse en diversas fuentes ~

,./
ambientales, como aguas sucias o residuales, leche cruda, etc. ,,.-,_,
·· . ./
~
Es capaz de producir biofilm, por lo cual se une ávidamente a la superficie de implementos ,j

~édicos, como lo son ventiladores mecánicos y catéteres endová.sculáres. Esta propieda·d le

concede inmunidad natural contra los medios de . defensa del h·ospedador, contra y
antimicrobianos.

Para el diagnóstico de [Link] débe considerar la información que entrega el G'ram,

características coloniales, olor característico, movilidad, prueba de oxidasa negativa y DNAsa
positiva. Esta última prueba, que se considera clave, debe iné:ub~rsei liasta 72 h~ras para evitar los
falsos negativos. Otras pruebas adicionales incluyen la oxidación de la glucosa y maltosa en medio
OF, descarboxilación dé la lisina, licuefacción de la gelatina y producción de H2S, evidenciada con
papel de acetato de plomo,
·- ./
~
Los aislados clínicos de S. maltophilia generalmente obedecen a colonización de los
tejidos en los pacientes, sin embargo es capaz de producir cuadros graves tales como neumonía en
pacientes de UCl con ventilación mecánica y bacteriemias asociadás a catéter venoso central. r--.,
También puede próducir en formá -inhabitual meningitis, endocarditis, endoftalmitis, lTU,
· conjuntivitis, mastoiditis aguda; infección de heridas, abscesos y' un., amplio rango de infecciones
cutáneas como celulitis y ectima gangrenoso. Se considera un patógeno [Link] en pacientes

udp Escuela de
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r-, Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014
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con factores de riesgo como: estancia prolongada en el hospital, uso prolongado de diversos
antimicrobianos, incluyendo carbapenémicos y cefalosporinas de última generación, neutropenia,
edad avanzada y procedimientc;>s invasores en pacientes de UCI.

( .
Los sitios en los que más comúnmente se ha aislado s. maltophilia han sido a partir de
hemocultivos, cultivos de ~spirado bronquial, heridas quirúrgicas, abscesos pulmonares, líquido
pleural y líquido de abscesos pancreáticos. Sin embargo, las infecciones pulmonares ocupan hasta
32% del total de las infecciones causadas por este microorganismo.
(.

(' Se ha descrito la presencia de esta bacteria en otros objetos que se utilizan comúnmente
en los pacientes como por ejemplo en nebulizadores, en sensores de temperatura de ventiladores
('
mecánicos y en fuentes de agua de unidades de hemodiálisis.
í'

Desde el punto de vista de susceptibilidad, S. maltophifia es intrínsicamente resistente a

múltiples familias de antibacterianos. La múltiple resistencia antibiótica está dada por mecanismos
en los que participan la producción de ~-lactamasas {Ll y L2), bombas de eflujo y la
impermeabilidad de la membrana externa, los cuales le confieren resist_encia de alto grado frente
a ~-lactámicos {e inhibidores de ~-lactamasas), incluyendo cefalosporinas de tercera generación y
carbapenems {por la producción de metalo ~-lactamasa), aminoglucósidos, macrólidos y, de forma
('
variable, a las quinolonas. Dado este escenario, la CLSI ha establecido que las pruebas de
í"
susceptibilidad por difusión se realicen solamente con sulfametoxasol trimetoprim, minociclina y
( levoftoxadno. La terapia recomendada en la infección por esta especie es con sulfametox_a~ol
trimetoprim.
(

r·

De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (y actualizado_ con anexo especial Nº 5 de 2004), este prden comprende
(
dos familias de importancia médica: Legionel/aceaey Coxiel/aceae. Este orden forma parte de de
( la Clase Gammaproteobacteria, Phylum Proteobacteria.

(
FAMILIA LEGIONELLACEAE

Esta familia comprende sólo 1 género, Legione/la que posee 44 especies.

í ..

GÉNERO LEGIONELLA:
í"
1

í El género presenta más de 64 serogrupos, siendo Legionella pneumophila serogrupo 1 la

responsable de más de 90% de los casos de enfermedad. Corresponde a un parásito intracelular
de protozoos de agua dulce que, con mecanismos parecidos, puede desarrollar su ciclo vital en
('
células de mamíferos. En humanos es responsable de la "Legionelosis". Esta es una enfermedad
que presenta dos formas clínicas diferenciadas: la -infección pulmonar o "Enfermedad del
Legionario" (McDade y cols 1977) que se caracteriza por neumonía con fiebre alta, y la forma no
neumónica conocida como "Fiebre _de Pontiac" (Fraser y cols 1979) que se manifiesta como un
síndrome febril agudo y autolimitado.
í

El primer brote tje legionel?sis detectado fue en Filadelfia {Estados Unidos), donde varios
excombatientes de la Guerra del Vietnam presentaron una variante de la neumonía que provocó
varias muertes en sus filas y que recibió el nombre de legionella con motivo de los legionarios.
Cuando se inhala agua contaminada con la bacteria en forma de aerosol, la enfermedad se
í'
;
manifiesta en personas susceptibles, causando una forma de neumonía adquirida en la comunidad
(NAC). La bacteria puede llevar a complicaciones pulmonares siendo sus síntomas fatiga, dificultad
para respirar· y en ocasiones diarrea o dolores_ musculares. En Latinoamérica su incidencia es
desconocida y en Chile hay [Link] de casos basados en la detección del antígeno en orina. En

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'-.,/

2001, se produjo en Murcia uno de los brotes más importantes, donde más de 650 personas ~

. /
fueron infectadas y 4 fallecieron. La mayor fuente de contagio es el sistema de aguas de grandes
edificios, hoteles y hospitales, humidificadoras, torres de enfriamiento, máquinas de rocío, SPA's y
fuentes de agua termal. Las cáñérías con agua tienen ·una capa biófila donde viven hongos,
protozoos y algas que forman un gran tamiz que esconde microorganismos que tienen una gran
importancia en el desarrollo de la Legianella. Es debido a esto que la bacteria se instala en el
interior de las amebas, donde resiste mucho más las posibles agresiones externas, como aguas a
altas temperaturas o el contacto con el cloro, y donde se reproduce, En general, los sistemas de
aire acondicionado no son una fueñte relevante de Legianel/a; · ·

La neumonía que produce esta bacteria es clínicamente indistinguible de otras neumonías \

atípicas y con frecuencia los pacientes requieren hospitalización, El periodo de incubación .es
normalmente de 2 a 10 días y es más frecuente en personas de edad entre 40 y.70 años. El riesgo
de contraer la enfermedad depende del tipo e intensidad de la exposición y del estado de salud
del sujeto susceptible, aumentando en inmunocomprometidos, en diabéticos, en pacientes con .
erifermedad pulmonar crónica, así como en fumadores o alcohólicos._

\
Morfológica mente corresponde a un bacilo Gram negativo que en cultivo es largo y fino de
0,3 a 0,9 µm de ancho y desde 1,5 a 15 µm de largo. Se caracteriza porque puede observarse como
cocobacilo en los tejidos infectados y formas bacilares alargadas en los medios de cultivo. Es
aerobia estricta, capnófila, poco sacarolítica. Su principal fuente de· energía lo constituyen los
aminoácidos y se le considera fastidiosa para su aislamiento in vitro ya que requieren hierro y
cisteína. Es catalasa, oxidasa y gelatinasa positiva.

· Para el diagnóstico de laboratorio se cuenta con ·el cultivo, siendo el 'medio BCYE
suplementado con polimixina B, anisomicina y cefamandol para evitar el crecimiento de
microbiota, el más recomendado. Este medio enriquecido contiene, entre otros ingredientes,
. extracto de levadura, L-cisteína, pirofosfato férrico y a Cetoglutarato. Puede ser aislada desde
muestras respiratorias, sin embargó, la sensibilidad del cultivo de expectoración es baja (50% en
laboratorios especiaiizados}. Se obtiene mejor rendimiento de aislamiento con las muestras de
lavado broncoalveolar. La bacteria crece a partir de las 48 hrs. de incu_bación a 37ºC en aerobiosis.
Las colonias son de color azulado y de textura esmerilada con aspecto de "vidrio molido". _Se
·,_ _/

confirma su identificación mediante aglutinación con partículas de látex. Un informe de cultivo

negativo, sólo se emite después de 10 días de incubación y revisión periódica. Otra técnica para el
diagnóstico es la lnmunofluorescencia directa que puede detectar la bacteria en muestras
respiratorias y tejidos en dos a cuatro horas, sin embargo puede dar falsos positivos por
reacciones cruzadas. Su sensibilidad varía entre 25 y 66%. Otra alternativa es la detección de
antígenos en orina (donde se eliminan) lo cual es de gran aporte en el diagnóstico de la bacteria ya
· que su antígeno es detectable desde el inicio de los síntomas y en algunos casos hasta muchos
meses después, sin influir la adminístración previa de antibióticos. Es una prueba rápida que utiliza
inmunocromatógrafía de membrana para detectar antígenos en ·15 minutos.' Aunque sólo detecta
· L.'-pneumaphila serogrupo 1, afortunadamente, es el agente de mayor frecuencia. La sensibiÍidad . /

de ésta técnica oscila entre 60 y 90%. Diagnóstico serológico: únicamente permite realizar un
diagnóstico retrospectivo: Se requieren dos muestras de suero; la primera obtenida en la fase
aguda de la enfermedad y la segunda a las 6-8 semanas, dado que aproximadamente un· 15% de
los pacientes seroconvierten después de 6 semanas. La deteccion de anticuerpos se realiza con
inmunofluorescencia indirecta. Un incremento de· 4 veées o más en él título se considera
diagnóstico.

En muestra única, un título de 256, en presencia d'é neúmoriía, se considera diagnóstico.

Sin embargo, dada la prevalencia de anticuerpos en personas asintomáticas, ésta se debe , __ ,,:

interpretar con precaución. PCR tradicional y en tiempo real a partir de muestras respiratorias,
orina, suero, y leucocitos. La sensibilidad fluctúa entre 30 y 86%.

Respecto a la susceptibilidad de la bacteria, la eritromicina ha sido la terapia de elección.

Sin embargo, dado las fallas de tratamiento se han probado con éxito otras drogas
antimicrobianas, como azitromicina y quinolonas como levofloxacina y ciprofloxacina. En el caso
de Fiebre de Pontiac el tratamiento es sintomático.

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De acuerdo a la clasificación establecida en la· segunda edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (y actualizado con anexo especial _Nº 5 de 2004)1 este orden comprende
dos familias de importancia para ei ser humano: ·Burkholderiaceae y Alcaligenaceae. Este_ orden
forma parte de' d_e la Óase Betaproteo~ácterla, Phylum Proteobacteria. .

·-~
FAMILIA BURKHOLDERIACEAE

GÉNERO BURKHOLDERIA

Este género presenta 29 espedes, sin embargo sólo 3 de ellas tienen importancia médica:
B. pseudomallei1 B. mallei y B. cepqcia. Estas tres especies estaban antiguamente clasificadas
como parte el género Pseudomonas, compartiendo entonces las características ya descritas para
ese género .

. Burkholderia pseudomallei:

Esta especie produce colonias húmedas o rugosas, acompañadas de un olor a putrefacción

mezclado con olor picante. Crece en aerobiosis en medios que contienen nitrato y es variable en la
producción de oxidasa. La confirmación debe confirmarse por reacciones serológicas usando
sueros comerciales.

Tiene distribución ubiéua y s·u incidencia -es frecuente en re~iones tropicales, tales como el
sudeste de Asia y el nort_e ·de· Australia. ·Este·· bacilo ataca tanto animales como humanós,
predominando en individuos con condici(>n· de lnmunosupresión. Es agente de melioidosis,
enfermedad que afecta los ganglios y es considerada una enfermedad emergente y un .arma
biológica de categoría B (bioterrorismo): · ·.
\.. ..~

Burkho/deria mallei:

Corresponde a bacilos Gram negativos bastante claros y con los extremos redondeados, de
2-5 µm de largo y 0,3-0,.8. µ11') de ancbo y con inclusiones granulares de _varios tc;1maños; a menudo
se tiñen irregularmente y no t_ienen cápsulas ni formai:i ·espora_s. A diferencia de [Link] demás especies
del génl:!ro, Burkholderia mallei no tiene flagelos y por' tanto no es móvil. En los medios de cultivo
varía su apariencia, que depende de la edad del .~ultivo y el tipo de medio. En los cultivos viejos
, existe un pleornorfismo ,claro pudiendo .formar fila~entos ramificados en la superficie. Es
aeróbic_a, créciendo de forma óptima a 37°C [Link] aunque lentamente en rnedi9s de cultivo
ordinarios
. como
. el agar· nutritivo y se " recomienda
~ , .. . la incubación
_, ,. durante 48 horas; el
enriquecimiento con_ glicerol es particularmente útil,

Esta especie es agente del muermo en los equinos y que ocasionalmente puede
'-,___
transmitirse al hombre (zoonosis), [Link] por he_riqas o inhalación.

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Burkholderia cepacia:

, Esta especie produce variados pigmentos según la composición química del medio en que
desarrolle (en especiaí la presencia de fierro se relaciona con la producción de un endopigmento ~/.
amarillo) pudiendo una misma cepa producir uno o varios pigmentos.· Pierde rápidamente su
viabilidad en los medios de cultivo. Normalmente es un fitopatógeno, pero se le ha aislado como
patógeno oportunista en humanos en pacientes neutropénicos sometidos a ventilación mecánica, ,.J
en pacientes con sepsis, meningitis, endocarditis, ITU, neumonía y portadores de fibrosis quística.

FAMILIA AlCALIGENACEAE

Esta familia está formada por b_acilos, Grarn negativos aislados o de a pares, móviles o
inmóviles, aerobios estrictos, catalasa y oxidasa positivo; por lo general no utilizan los hidrato~ de
-carbono y no reducen los nitratos a nitritos.

Comprende 10 géneros, de los cuales tienen importancia médica Alca/igenes,

Achromobacter, Bordetella y O/igella.

GÉNERO ALCALIGENES:

Está formado por bacilos Gram negativos, móviles por flagelación perítrica, aerobios
estrictos, no exigentes y no utilizan los hidratos de carbono. Oxidasa y catalasa positivo. La única
especie del género que tiene importancia médica es A. faecalis subsp. faecalis. Las especies
Alca/igenes denitrificans y Alcaligenes xylosoxidans pasaron a formar parte del género
Achromobacter.

Las especies del_ género Alcaligenes son bacterias que se encu_entran principalmente
formando parte de_l suelo con ambier;ite húmedo y en el agua. Constituyen un gé[Link]
muy difíciles de identificar, porque no poseen características bioquímicas específicas.

Alca/igenes faecalis subsp. faeca/is:

Esta especie crece en los medios habituales para aerobios dentro de 24 horas y para una
identificación confiable se puede utilizar pruebas bioquímicas automatizadas en paneles ID 32 GN
(bioMerieux, Francia).

. Puede ·forma.r partl;! de la microbiota saprófita de. la piel y el tra~to gastrointestinaL La

mayoría de los aislamientos clínicos provienen de hemocultivos y secreciones_ del tracto
respiratorio de pacientes hospitalizados, y están relacionados con la contaminación de equipos
médicos y fluidos. Ocasionalmente se ha aislado en úlceras corneales, endoftalmitis; abscesos
cerebrales y otitis crónica. Todas ellas en pacientes con factores de riesgo para desarrollar
infecciones, como inmunodeprimidos, diabéticos, alcohólicos, o también como un patógeno
oportunista coinfectando junto a ,otros microorganismos virulentos.

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GÉNERO ACHROMOBACTER:

Está formado por 7 especies, de las cuales Achromobacter denitrificans y Achromobacter

xy/osoxidans subsp. xy/osoxidans son las más importantes para el ser humano.

Corresponden a bacilos Gram negativos rectos, aerobios obligados, móviles por flagelación
perítrica, oxidasa y cata lasa positivos.

Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans:

Esta especie crece bien en agar nutriente, formando colonias circulares no pigmentadas,
blanco grisáceas. En agar BHI las colonias alcanzan un diámetro de 1 mm.

La infección por esta especie es rara .. Los casos reportados definen el perfil clínico de
riesgo: pacientes de mediana edad o añosos, neonatos, pacientes inmunocomprometid os, etc.,.
que adquieren la infección (en la mayoría de los casos) durante la hospitalización, aunque hay
casos reportados de infecciones adquiridas en la comunidad. El reservorio para Achromobacter
permanece desconocido. El organismo puede sobrevivir y multiplicarse en soluciones acuosas y ha
sido aislado de jabones, soluciones antisépticas, respiradores, nebulizadores, agua corriente,
fluidos de diálisis y piletas de natación. Los aislamientos clínicos han sido cultivados de otitis,
líquido pleural, peritoneal y cefalorraquídeo, osteomielitis, catéteres, etc.

Achromobacter xy/osoxidans subsp. denitrificans:

Esta especie crece comparte las características de la subespecie xylosoxidans. Se le ha

aislado de una variedad de muestras clínicas tales como heces, orina, sangre líquido pleural,
secreción ática purulenta, secreción prostática y secreción faríngea.

GÉNERO BORDETELLA:

Las Bordetellas se caracterizan por ser pequeños coco bacilos de 0,2-0,3 x 0,5-2 µm y se
pueden encontrar solos o en pares. Son Gram negativos, presentan tinción bipolar. Son inmóviles
o móviles (B. bronchiseptica) por flagelos perítricos: C~talasa positivos. No requieren factores de
crecimiento para su cultivo. Su cultivo es difícil. Son aerobios estrictos. La temperatura óptima de
desarrollo es de 35-37°C. Estas bacterias son parásitos obligados de mamíferos y sobreviven poco
tiempo en el medio exterior, teniendo tropismo por las vías respiratorias, aunque forman parte de
la microbiota de ciertos animales.

De las_ 8 especies que posee el género, la e_specie tipo es Bordetella pertussis.

Tres especies son pa'tógenos humanos, B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica.

De estas, B. pertussis y ocasionalmente 8. parapertussis causan Tos Convulsiva (también
denominada Tos Ferina o Coqueluche) en humanos_. La especie B. bronchiseptica raramente
infecta a humanos sanos, aunque se· han informado enfermedades en personas
inmunocomprometid as.

Bordete/Ja pertussis:

Esta especie, también llamada Bacilo de Bordet~Gengou, son cocobacilos pequeños de

lµm por 0,2-0,3 µm y que se encuentran solos, en parejas o en cortas cadenas y presentan tinción
bipolar. Son Gram negativos, inmóviles, capsulados. Son aerobios estrictos. La temperatura óptima
de desarrollo es 35-37°C. No produce pigmento. Son hemolíticos y no necesitan de factores de
crecimiento. Habita solamente en el ser humano, se aloja en la boca, faringe, y/o la nariz de la
persona infectada, transmitiéndose por contacto directo de persona a persona, mediante gotitas
de secreciones respiratorias expulsadas al respirar, toser o estornudar.

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B. pertilssis es agente etiológico de Tos Convulsiva que afecta preferentemente a niños,

entre 6 meses a· 5 años y es producida por la acción de una citoxina traqueal y la toxina pertussis
producida por la bacteria que genera proliferación, desmarginación y activación linfocitaria. El
recuento· de leucocitos en· los pacientes suele oscilar entre 15;000 y 20.000/µL, pero puede ser
normal o llegar a 60.000/µL; al frotis sanguíneo el 60 a 80% de las células corresponde a linfocitos
pequeños.

La tos convulsiva presenta 3 períodos: catarral (1-2 semanas), paroxístico (de 2 a 5

semanas) y convaleciente (1 a 3 semanas hasta meses). El método de diagnóstico de referencia es
por cultivo de secreción nasofaríngea, aspirado bronquial o lavado brocoalveolar en agar Bordet-
Gengou o Regan Lowe, lo cual tiene una especificidad del 100% pero una sensibilidad no superior
al 40%. A las 48-72 fi las colonias son lisas, cupulifórrries, brillantes, redondas (corrio perlas o gota
de mercurio), ligeramente opacas,· hemolíticas, mucosas. Otra forma de cultivo es utilb:ando
aspirado nasofaríngeo, el que debe depositarse en una cantidad· de 0,2-0,5 mL por placa. La
siembra debe ser efectuada de inmediato en el medio y las placas se incuban a 35-37ºC en
ambiente húmedo en jarra hermética, por 7 días (la jarra se puede flamear para eliminar esporas
y hongos). La lectura se realiza bajo lupa estereoscópica, a partir de los 2 días (B. pertussis no
crece en menos de 2~3 días). El máximo rendimiento del cultivo se obtiene en el período catarral y
la primera semana del período paroxístico. Durante los brotes epidémicos se recomienda
confirmar el diagnóstico con té~nicas ge cultivo.

También se pueden utilizar técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos policlonales

o monoclonales (sensibilidad intermedia de 50-60%), aglutinación con antisueros específicos
desde la colonia o del aspirado nasofaríngeo, y PCR (que amplifica un segmento de la toxina
pertussis)
.' que es el..método
' .. ' de.. diagnóstico
' . . más. sensible
. . .
y de
.. elección. en adultos
~ ·,
.

Las causas de la tos [Link] en adultos inmunocompetentes son variadas, sin embargo
y
la mayoría de los estudios r~velan. que exduyendo el tabaquism~ el uso de fármacos que éausan
tos, sobre el 90% de los casos se .deberían a la existencia en· los pacientes de rinosinusitis crónica,
asma bronquial y reflujo gastroesofágico, en forma aislada o [Link] estas.

Los adultos y adolescentes frecuentemente no presentan el cuadro de estridor y

paroxismo. Por esta razón, en general una persona de cualquier edad que presenta tos por causa • ../

desconocida durante más de 14 días es conveniente estudiar una posible Tos Convulsiva.

En el caso de los niños, los factores de riesgo de mortalidad son la edad menor de 6
meses, prematurez e inmunización incompleta. Además existen evidencias de que la presencia de
' neumonía y leucocitosis implican una peor sobrevida.

El agente ingresa al organismo por la vía aérea a través de la inhalación de gotitas de

Flugge, se adhieren e invaden· 1as células del epitelio respiratorio. Se le considera un patógeno
respiratorio altamente contagioso dado que un riiño infectado es capaz de contagiar al 80-100% '· _.,,/
de los contactos intradomiciliarios y al 50-80% de sus compañeros de colegio. Esta enfemedad ~

produjo alto nivel de mortalidad hasta la década de 1940 período en el que comenzó a realizarse
la vacunación contra el agente lo que produjo un drástico descenso de la aparición de la
enfermedad. Sin embargo, en la actualidad se ha establecido la reaparición de casos en
adolescentes y adultos, incluso aumentando su incidencia en este grupo de riesgo, mientras sigue
disminuyendo su prevalencia en niños pequeños. Se estima que la incidencia ha aumentado
debido a que existen mejores métodos de diagnóstico y el que la inmunidad conferida por la
vacuna tradicional sería transitoria y se extinguiría después de 10 años de administrada, lo que
permitiría la reinfección de los adultos.

La principal medida para prevenir esta enfermedad es la vacunación con DPT. Dado que su
efectividad se obtiene solamente después de la tercera dosis, es fundamental mantener a los
niños con todas sus vacunas al día, de acuerdo al calendario de vacunación infantil existente en
" ...,/
Chile.

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 udp Escuela de
/ -~,
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. . .

La vacuna DPT, constituida por los toxoides diftérico y tetánico y Bordetella pertussis
(componentes contra Difteria, Tétanos y Tos Convulsiva, respectivamente), se aplica a los 2, 4 y 6
meses de edad, junto con la Polio yla vacuna Hib (contra. i11fecciones por Haemophilus influenzae
tipo b). A los 18 meses y 4 años de edad, se administra un refuerzo de vacuna DPTy Polio.
/'

La tos convulsiva es una enfermedad de notificación obligatoria y la confirmación

diagnóstica la realiza el Instituto de Salud Pública.

'"--
GÉNERO OLIGELLA:

Este género comprende dos especies Oiigel/a urethralis (anteriormente cÓnocida como
Moraxel/a urethralis) y O/igella ureolytica. P¿seen las mismas ·características del género Moraxella
ya que formaban parte de ese género.

O/igella urethralis:

Esta especie es"éomensal del tracto ·genitourinario y la mayor ·parte de los aislados clínicos
son de infección del tracto Úrinario, predominantemente en hombrés. Aunque las infecciones
sintomáticas son raras, se ha~ informado bacteremias, artritis séptica que imita una artritis
gonocócica, y peritonitis. El diagnóstico es por cultivo.

O/igéllá ureo/ytica: ·

Esta especie támbién sé le ha encontrado primariamente como agente de infección del

tracto urinario, usualmente en pacientes con catéter urinario de largo plazo u otros sistemas de
drenaje urinario. Estos pacientes · tienen predisposición a desarrollar cálculos urinarios,
. .

posiblemente debido a que la bacteria hidroliza urea y. alcaliniza la orina, conduciendo a la

precipitación de fosfatos. Se ha informado de un caso de batteremia ocurrido en un paciente con
uropatía obstructiva. El diagnóstico es·por cultivo. · · · ·

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'· /

· Pruebas usadas , en la identificación de·. bacilos Gram negativos no

·, fermentadores

· • Prueba de oxidación-fermentación:

. Se siembran 2 tubos de los carbohidratos uno de ellos con oxígeno y el otro sin oxígeno. La
fermentación se produce en el tubo sfn oxígeno. Los microorganismos que son capaces de
fermentar los carbohidratos taml:iién son capaces de oxidarlos, .por lo tanto los fermentadores
producen ácido en los dos tubos.· (Color amarillo). Los .microorganismos .oxidativos o· no
. .fermentadores producen ácido. y reacción amarilla sólo .. en el tubo abierto. Algunos
microorganismos no utilizan la glucosa por ninguna de estas dos vías por lo que no producen
cambios en ninguno de los dos [Link] y son los llamados nooxiqativos.

• Prueba de la oxidasa:

Esta prueba se basa en la capacidad de la enzima citocromooxidasa de oxidar el sustrato '-../

tetrametil-para fenifdiamina dihid~oclórico; formando un producto final de color púrpura oscuro,

-.
el indofenol. Este puede hacerse visible agregando u·na pequeñ,:i'cantfdad de la colonia un papel a
impregnado con el sustrato. o a tiras preparadas comercialmente: La reacción tiene un tiemp~ de
10 segundos.

• Motilidad:

Es posible observar la motilidad al microscopio tomando una gota de un cultivo en caldo

iriéubado a 25 ºC por 6-24 horas (portaobjeto y cubreobjeto).

• Crecimiento en agar Mac-Conkey:

-~..'..:
Las bacterias que se desarrollan bien en este medio presentan un diámetro de [Link]
mayor de 3 mm. Aquellas con mal desarrollo presentan colonias puntiformes o no se desarrollan.

'-. /

• Producción de pigmento:

1 Agar F: se utiliza para determinar la producción de pioverdina pues inhibe la producdón

de piocianina.

2 Agar P: se utiliza para determinar la producción de piocianina debido a que irihibe la

producción de pioverdina.

Algunas esp'ecies como es el caso de P.- aeruginosa: prnducen un' pigmento soluble que
difunde al medio, lo que permite reconocer fácilmente estos microorganismos.

Los alumnos deben informarse en relación a técnicas que nos permiten observar la producción de
pigmento, producción de indol, descarboxilación y Tinció'n de flagelos.

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y, Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico, Edición Nº7 - 2014
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'--./

Tabla l. Características fenotípicas de especies del género Pseudomonas

P. P. P. pseudo-
Prueba P. putida P. stutzeri P. alcaligenes
aeruginosa f/uoresceris .· a/caligenes
/'

Oxidasa 100 100 100 100 100 100

Crecim. Mac Conkey 99 100 100 100 93 98
Crecim. en 42 ºC 100 o o 90 75 48
Reducción de N03 74 19 o 100 93 61
Gas en nitratos 60 4 o 100 5 o
(
Pioverdina 69 91 82 o o º·
Hidrólisis de arginina .. 99 99 99 o 36 7
Descarbox. de lisina o o o o o ND
Desam. de fenilalanina 8 3 2 55 21 20
Indo! o o o o o o
Hidrólisis de urea 66 44 43 17 8 21
Hidrólisis de gelatina 46 100 o o 3 2
/"
\ ....
Hidrólisis esculina o o o o o ND
Acido de: Glucosa 98 100 100 100 19 o
Fructosá 89 99 99 95 100 o
Galactosa 81 98 99 91 4 o
Manosa 79 99 99. 89 1 o
Ramnosa 22 43 28 23 o o
Xylosa 85 97 98 94 8 ·o
Lactosa o 11 13 o o o
Sacarosa o 47 10 o o o
Maltosa 12 31
,
19 99 11 o
Manito! · · 68 · .. 93 "'17 · 70 .3 o
Lactosa 14 6i 42 o O· o·
Movilidad 95 100 100 100 90 98
No. de flagelos 1 >1 >1 1 1 1

Tabla 11. Características fenotípicas de especies de Acinetobacter1.

Prueba A. calcoaceticus A. baumannii A. haemo/yticus A. lwoffi

Crecim a 37 ºC . 100 100 100 100
Crecim a 42 ºC o 100 o o
Hidról. de gelatina o o 96 o
Ácido de glucosa 100 95 52 o
Arginina 100 98 96 o
Citrato 100 100 .· 91 o
Malonato 100 . 98 o o
Hemólisis o o 100 o
1
Los valores indican porcentaje de positividad.

/·

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Tabla 111. Bacilos Gram-negativos, no fermentadores, oxidasa negativa·, indo! negativo.

Prueba Acinetobacter sp. Stenotrophomonas

maltophilia
Movilidad - +
Pigmento - café
Crecim. en Mac Conkey V + {débil)
Crecim. a 42 ºC V V
Reducción de nitratos - V
Hidrólisis de esculina - V
Hidrólisis de gelatina V +
Ureasa V ' -
Arginina - -
ONPG - +
Ácido a partir de:
Glucosa V +
. )
Maltosa V +
Sacarosa - V
Manito! - -
Xilosa V V
DNAsa (hasta 72 h) - +

+, porcentaje de positividad ~ 90%; -, porcentaje positividad ;S;10%; V, porcentaje de positividad

10-90%.

Tabla IV. Característicás fenotípicas de especies del género Burkholde,:ia

.,

B. pseudomal/ei B. mallei B. cepacia B. glodioli

Oxidasa 100 88 95 100

·Crecim. en Maé Conkey . 100 6 60 o
Crecim. a42 ªC 100 100 37 33
Reducción de nitratos 100 o o o
Gas de nitratos 100 100 o o
Hidrólisis de arginina o o 92 o
Descarboxi: de ornitina o o 66 o \. .,/

Desamina. de fenilalanina o ND 2 o • J
Hidrólisis de urea 43 12 45· · 100
Hidrólisis de gelatina 100 o ·74 100
Hidrólisis de esc:ulina 57 o 67 o
Ácido de: Glucosa 100 100 - 100 100
Fructosa 100 ND 100 100
..
Galactosa 100 ND 100 100
Manosa 100 ND 1Ó0 100
Ramnosa 71 ND o o ,j

Xilosa 86 12 99 100
o
• o

Lactosa 100 12 99
__ )
o o
\.

Sacarosa 86 83
Maltosa 100 · o 98 o
Manito! 100 62 100 100
Lactosa 100 ND o 98
Movilidad 100 o 99 100
No. de flagelos >1 o >1 1
Los valores indican el porcentaje de cepas para las diferentes pruebas o reacciones. ND= no determinado.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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·. :y_. Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Tabla V. Diferenciación de especies de Pseudomonas, Burkholderia y Stenotrophomonas de

mayor aislamiento en el ser humano. -

Glucosa Hidrólisis Desarrollo

Piocianina Oxidasa 0/F arginina a 42ºC Gelatina

P. aeruginosa + o- + +/- + + +

P. fluorescens - + +/- + - +
P. putida - + +/- + - -
1
B. cepacia - +o(+) +/- - d d
2
S. ma/tophilia - - +/-3 - d +
1. Produce pigmento amarillo en medios como agar Kligler y agar TSI.
2. Esta especie produce una coloración verde lavanda en agar sangre, además es DNAsa
positivo. _ · . .
3. La oxidación de la glucosa es muy tardía.

Tabla VI. Esquema para la identificación de bacilos Gram-negativos no fermentadores diferentes a

Pseudomonas y BUl'.kholderia.

NO OXIDADORES DE GLUCOSA OXIDADORES DE GLUCOSA

Mac Conkey positivo - Oxidasa negativo Mac Conkey positivo - Oxidasa negativo
NO MOVILES Acinetobacter lwoffi · NO MOVILES Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter haemolyticus
Oxidasa positivo - -- - -Oxidasa positivo
MOVILES Alca/igenes faeca/is MOVILES Achromobacter spp.
Achromobacter xylosoxidans Achromobacter xy/osoxidans
subsp. denitrificans
Bordetel/a bronchiseptica Agrobacterium spp.
Achromobacter xylosoxidans - -
NO MOVILES Myroides odoratus NO MOVILES Chryseobacterium .
{Flavobacteriu_m odoratum) - meningosepticum
Moraxel/a nonliquefaciens Empedobactér brevis
·- (F/avobacterium breve)
Moraxella osloensis Sphingobaúerium multivorum
... ' ·- -
(Flavobacterium multivorum)
Psychrobacter. phenilpíruvicus
(Moraxella phenylpiruvica)
O/igella urethralis -
Moraxella atlantae
Mac Conkey negativo - Oxidasa positivo

NO MOVILES Eikenella corrodens NO MOVILES Ffavobacterium spp.

Flavobacterium spp. Sphingobacterium spiritivorum
(Flavobacterium spiritivorum)
Moraxel/a lacunata
. Moraxel/a nonliquefaciens _
Moraxel/a bovis
Moraxella osloensis

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Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014

Tabla VII. Características de identificación de Moraxel/a catarrhalis

.. Diplocococos Gr¿m
Morfología.(*) negativos
Oxidasa(*) ·· .. +·· . - ~- . .

CTA glucosa -
CTA maltosa -
CTA sacarosa -
Reducción NO 3 a NO 2 • +
DNAsa·(*) +
* Pruebas básicas, por sí solo confirman la identificación de M. catarrhalis.

Tabla VIII. Diferenciación de especies de Moraxella y O/igella más aisladas del hombre ·

req. fenilala- acetato

.. ~uero motilidad urea nína.. de Na nitratos citrato

M. lacunata* + - - d - + -
M. nonliquefaciens - -· - - - + -
M. atlantae - - - - d - -
Psychrobacter
..
phenílpiruvicus (M. · - - + +. .d d -
phenylpytu\iica)
M. osloensis - - d + d -
O. urethralis * d - + d -· d
O. ureolytica * d + d
* desarrollan mal en medi9s_que no contengan suero y en agar s_angre crecen lentamente.

Tabla IX. Cocobacilos Gram-negativos. asacarolíticos. oxidasa-positiv0s, indól negativos1 •

Psychrobacter
...
{)//oraxella Moraxella phenilpyruvicus · ·oligella 0/igella
Prueba
lacunata osloensis (Moraxella · urethralis · ureolytica '· .,/

phenylpyruvica)
Movilidad - - ·- - + '--/

Cata lasa + + + + +
Crecimiento en
Mac Conkey
- V V V V

Cree. a 42 ºC - D V + -
Ureasa - - + - +
Fenilalanina
desaminasa
D - + + +
Hidrólisis de
gelatina
+ - - - -
Reducción de
nitratos
+ V V + -
1
+, porcentaje de positividad?: 90%; -, porcentaje positividad ~10%; V, porcentaje de positividad
10-90%. D, inestabilidad de la cepa.

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Tecnología Médica
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Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

Tabla X. Bacilos Gram-negativos, no cocoides, asacarolíticos, oxidasa positivos, indol negativos.

Prueba Alca/igenes Alcaligenes · Achromobacter Myroides Delftia

faeca/is xylosÓxidans piechaudii odoratus acidovorans
subsp (Alca/igenes (Flavobacterium (Coma monas
dentrificans piechaudii) odoratum) acidovorans)
Cree. Mac
Conkey
+ + + + +

Reduc. Nitratos - + + - +
Ureasa - ··-
- - + -
Flagelos pe pe pe - > 1 po
Fenilalanina
desaminasa
- - V - -
1
+, porcentaje de positividad 2: 90%; -, porcentaje positividad S10%; V, porcentaje de positividad
10-90%. Pe = Perítrico. ·

Tabla XI. Bacilos Gram-negativos, no cocoides, sacarolíticos, no fermentadores, oxidasa positivos,

indo! negativos1•

Prueba Alcaligenes Sphingobacterium

xylosoxfdans subsp · multivorum
xy/osoxidans (Flavobacterium
spiritrivorum)
Crecim. en Mac Conkey + +
Pigmento .. - amarillo claro/ -
ONPG - +
Arginina dehidrolasa
..
V -
Flagelos pe -
Reducción de nitratos + - . -·
Ureasa - +
Hidrólisis de esculina - +
Hidrólisis de gelatina - -
Ácido a partir de:
..
Glucosa + +
Maltosa - +
Sacarosa +
Manito! - +
Xilása + +
. . .
1
+, porcentaje de positividad 2: 90%; -, porcentaje positividad S10%; V, porcentaje de positiv:idad
10-90%. Pe = Perítrico.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Eiwin [Link] V. - TM. Pedro Cortés A.
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. -udpEscuela de
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Tabla XII. Bacilos Gram-negativos. no fermentadores. oxidasa positivos. indol positivos. no

móviles1.

Prueba Chryseobacterium Empedobacter brevis

- ..
meningosepticúm (Flavobacterium breve)
Cata lasa . + +
Crecim. en Mac Conkey V ~{ ·ND
..
Crecim a 42 2c V -·
Reducción de nitratos - -
ONPG + -
Hidro!. de almidón - V ..
Ureasa - -
Hidrólisis esculina ,. + , . -
Hidrólisis gelatina .+ +
Ácido a partir de: ··-
Glucosa + V
Maltosa + +
Sacarosa - -
Manito! + -
Xilosa - -
1
+, porcentaje de positividad ~ 90%; -, porcentaje positividad S10%; V, porcentaje de positividad
10-90%. ND, no determinado: -.

Tabla XIII. Esquema de diferenciación de las especies de Alcaliqenes y Achromobacter

Achromobacter
Alcaligenes faecalis
ssp. faecalis piechaudii denitrificans xylosoxidans

0/F glucosa -/- -/- -/- +/-

Oxidasa + + + +
Motilidad
{Flagelos + + + +
perítricos)

Red. de nitratos - + + +
Desn itrificación
(FLN) + - + NO
Crecimiento a
42ºC.
+(10%) + {75%) + {56%) + (84%)
Xilosa - - - +

Tabla XIV. Especies de Chryseobacterium, Myroides y Sphinqobacterium de aislamiento más

frecuente en el ser humano ~-.

Glucosa Manito! Sacarosa Maltosa

aerobia 0/F 0/F 0/F Urea lndol

C. meningosepticum + + - + - +
M. odoratus
(C. odoratum}
- - - - + -

S. multivorum + - + + + -

.. '
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Tecnología Médica 124 "',: - ·.
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Tabla XV. Características diferenciales del género Bordetella que se aislan del ser humano

Cata lasa + + +
'-..~ Oxidasa + +
Crecim. Agar Mac Conkey + +
/ '
,_ Crecim. En agar nutriente sin
/ ---, + +
sangre
Pigmento marrón b café en
agar peptona o Müeller Hinton
:+
/ ',

Reducción del Nitrato +

Motilidad +
lndol
Citrato de Simmons + +
Urea + + (4 h)
Glucosa +
Lactosa +
Animales/ Ser
Aislamiento Ser humano Ser humano
/' humano

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/ . Tecnología Médica
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•/

ACTIVIDAD PRÁCTICA N2 3:

OBJETIVOS:

1) Reconocer las características morfológicas y fisiológicas principales de los principales

Bacilos Gram negativos No fermentadores (Acinetobactery Pseudomonas).
2) Identificar las diferentes especies de cada uno de los géneros y su importancia en clínica.
3) Adquirir habilidades y destrezas en la identificación de las diferentes especies.
4) Determinar la susceptibilida_d a los antimicrobianos de las cepas de susceptibilidad variable
y su importancia en el control de Jas infecciones produddas por estos géneros·.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS:

Se entregarán cepas de Acinetobacter y Pseudomonas (eventÜalrrÍente podrán inclú[Link]

Burkholderia y Stenotrophomonas):

1. Cultivar y aislar en placas de agar sangre y Mac Conkey las cepas entregadas.
2. Realizar estudio de morfología macroscópica y microscópica.
3. Describa las colonias en las placas de agar sangre según:
-Forma
0
Borde
· ~ Elevación
-Superficie
-Color

4. Realizar pruebas de identificación.

Diagnóstico microbiológico de !,!na muestra problema entregada a [Link].

'-. _./

1. Realizar siembra de muestra problema en medios adecuados.

2. Realizar observación macroscópica y microscópica.
3. Realizar pruebas d_e identificación.
4. Identificación del microorganismo.

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Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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Tecnología Médica · Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. EdiciónN°7 - 2014

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De acuerdo a la clasificación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sist_emática (y actualizado con anexo especial Nº 5 de 2004), este orden comprende
sólo una familia: Pasteurellaceae, la cual presenta dos géneros de importancia para el ser humano:
Haemophilus y Pasteure/la. Este orden forma parte de de la Clase Gammaproteobacteria, Phylum
Proteobacteria.

FAMILIA PASTEURELLACEAE
Está constituida por bacterias de forma bacilar de Ó,2 x 0,3-2,0 µm Gram nega'tivos,
inmóviles, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos. En general son [Link]íciles de cultivar,
/ .
requieren de medios enriquecidos y presentan una actividad bioquímica limitada. Son oxidasa
positivos y la mayoría son cata lasa positivos.
(.

GÉNERO HAEMOl>HILUS:

Características generales

El género Haemophilus se [Link] de bácilos o coéobacilos Gram negativos anaerobios

facultativos de tamaño menor a 1 µm de ~nch~ y largo variable. Algunas especies son capsuladas.
Su crecimiento es generalmente óptimo cuando se incuba a 33-37°C en una atmósfera con 5-10%
de C02. A la mayoría de las especies se les considera nutricionalmente fastidiosas porque
requieren para su crecimiento medios enriquecidos con NAD (nicotinamida adenina dinucleótido o
factor V termolábil) y/o hemina o protoporfirina (factor X termoestable), por lo que usualmente
no crecen en agar sangre, el cual contiene adecuadas cantidades de hemina pero contiene factor V
únicamente dentro de los eritrocitos. Sin embargo, Haemophilus puede crecer en agar sangre
alrededor de otras bacterias, como Staphylococcus aureus, que proporcionen el factor V. A este
fenómeno se le conoce como satelitismo.

Son capaces de reducir los nitratos a nitritos y fermentar carbohidratos. Otras pruebas
utilizadas para su identificación son: indol, catalasa, ureasa y descarboxilación de aminoácidos
como lisina y ornitina.

En el género Haemophilus se han descrito 9 especies que se asocian al ser humano, ya sea
como parte de la microbiota en el tracto respiratorio superior o como agentes de infecciones.

La especie más importante desde el punto de vista de las infecciones en el ser humano es
H. influenzae.

Tanto H. influenzae como H. parainfluenzae presentan biotipos cuya determinación se

basa en tres pruebas bioquímicas: lndol, Urea y Ornitina. Estas pruebas no se usan rutinariamente,
sin embargo, permiten obtener datos de interés epidemiológico.

Características morfológicas

. Las especies de Haemophilus en placas de agar sangre no crecen, excepto cuando se

produce satelitismo, observándose como colonias puntiformes. Un medio enriquecido que
proporciona losfactores necesarios para su crecimiento óptimo es el agar chocolate, en el cual se
· observan colonias pequeñas, lisas, color gris a crema. Microscópicamente son cocobacilos Gram

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negativos que pueden presentar además pleomorfismo celular, dependiendo de la edad del
cultivo y el medio que se utiliza. En los cultivos más viejos se observan células b_acterianas con
formas bacilares, mientras que en los cultivos más jóvenes se encuentran formas cocoides o
coé:obacilares. Las colonias de Haemoph1fus se observan peqUeñas, color gris a crema y lisas en el
agar chocolate.

Haemophilus influenzae:

Es la especie tipo. Puede poseer cápsula que constituye un importante factor de virulencia
y según la composición antigénica de ésta se distinguen 6-serovares: desde a hasta f. H. influenzae
tipo_ b es el responsable de la . mayoría de los cuadros invasivos, como meningitis, epiglotitis,
celulitis y artritis. Las cepas no capsuladas son responsables de cuadros localizados como
bronquitis, sinusitis, conjuntivitis y otitis media.

Haemophilus ducreyi:

Esta especie, que requiere factor X, es causa del chancro blando o Chancroide
(enfermedad de transmisión sexual).

H. parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. aphrophilus y otros pueden actuar como

patógenos oportunistas produciendo endocarditis, abscesos cerebrales y dentales.

Nota: Cabe mencionar que algunas especies de Haemophilus (como H. aphrophilusyH.

parainfluenzae) están dentro del grupo HACEK, que son un conjunto de microorganismos Gram
· ri~gativos de crecimiento 'lento y exigente que requieren Una atmósfera con dióxido de carbono
'pará crecer. Las especies! que pertenecen a ·este grupo son de diversos gériéros: Haemóphilus,
· Ar;:tinobacil/us áctinomycetemcomltahs, Cardiobacterium hominis, Eikenella ·torródens y Kingella
·'kingae .. Las bacterias HACEK residen normalmente en la éavidad búéal y se asocian con infecciones
locállzádas en la boca. También :pueden causar infecciones sistémkas graves, principalmente
endocarditis bacteriana.
.....-.·--._,,

'características de especies de· Ha€~0philus de importancia clínica.

\ /

Requerimiento de Fermentación de 2
1
Especie Hemólisis Catalasa
X V C02 Glu Sac Lac Man

H. influenzae + + + - + - - - +
H. haemolyticus + + - + :+- - - - +
H;ducreyi ··+ - - - _.,
- - -
H. parainfluenzae - + v3 - + + - + V

H. parahaemolyticus - + - + + ·+ - - +
H. segnis - + - .. . w_ 4. .W - - V

H. paraphrophilus - + + - + + + + - '. ___ ,/

H. aphrophilils - ·- + -•. +· + +· + -
., ;
2 .
~ Hemólisis en sangre de. caballo. _Glu = glucpsa; Sac = sacprosa; Lac =;= lactosa; Man= man9sa; ·
4 .
3
V= variable. w =reacción débil.· ·

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..\.....,, Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición N°7 - 2014
0'--.,
Diferenciación de los biotioos de H. inf/uenzae y H. parainf/uenzae.

--
'
Especie Biotipo lndol Ureasa Ornitina Descarboxilasa

1 + + +
11 + + -
111 - + -
IV - + +
H. influenzae
V + - +
VI - - +
VII .+ - -
VIII --,.
.. - -
1 - ·- +
11 - + +
111 - + -
H. parainfluenzae IV + + +
VI + - +
( .. VII + + -
VIII + - -

GÉNERO PASTEURELLA:

En este gé~ero se incluyen en la _actualidad 20 especies. Corresponden a cocobacilos o

bacilos cortos de 0,3 - 2 µm de diámetro por 1-2 µm de. largo, inmóviles, aislados de a pares-o en
cortas cadenas. Son Gram· negativos y presentan tinción bipolar. _Son anaerobios facultativos.
Capaces de crecer en un rango de 22-44º[Link] bien en agar sangre, donde forman colonias de
1-3 mm. de diámetro, redondeadas y grisáceas entre las 24 y 48 hrs. Algunas especies pt1eden
producir~ hemólisis.

Se caracterizan por ser catalasa y generalmente oxidasa positivo. Fermentan

carbohidratos habitualmente sin prodt1cción de gas y reducen nitratos a nitritos. Algunas especies
pueden producir indo! y ureasa.

Son parásitos de la mucosa del tracto respirator_io y di~estivo de mamíferos y aves, pero
rara vez del hombre.

Pasteurella multocida:

La especie tipo es P. multocida que es ta' que posee mayor importancia como causá de
enfermedad humana, pudiendo ser responsable de. infecciones. localizadas, como celulitis y
abscesos, infecciones pulmonares crónicas e incluso infecciones sistémicas. Ha sido reportada en
heridas por mordedura de perro.

Pasteurella multocida incluye tres subespeéies: P. multocida spp multócida, P. mu/tocida

ssp septica y P. multocida ssp ga/licida. La identificación de subespecies se basa en la producción
de ácido a partir del sorbitol y del dulcitol, aunque esta distinción no se considera relevante en los
aislamientos clínicos.

Crece bien en agar sangre, agar chocolate y Müeller-Hinton, pero no en agar Mac Conkey.
· Tras 24 h de incubación en agar sangre; P. multocida crece formando ·colonias lisas de 1-2 mm de
diámetro, de un color gris azulado brillante, [Link]íticas y en ocasiones mucosas. El crecimiento
en medio de agar sangre y la característica tinción bipolar ayudan a diferenciar P. mu/tocida del
género Haemophilus, con el que puede confundirse en la observación microscópica inicial.

udp Escuela de
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 udp Escuela de .
Tecnología Médica
Manual. de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

La ausencia [Link]ólisis en medios con sangre, la producción de indo!, la descarboxilación

de la ornitina y una reacción de urea negativa permite·n [Link] P. multocida de las· otras --.
especies del género.

De acuerdo· a la clasificación establecida en la segunda ·edición del Manual de Bergey de la

Bacteriología Sistemática (y·actuafizado·con anexo espedal Nº 5 de-2004), este orden comprende
U familias de las cuales Brucel/acéae, con su género Bruce/la es la que tiene importancia para el
ser humano. Este orden forma parte de de la Clase Alphaproteobacteria, Phylum Proteobacteria.

fAMIUA BRUCEUACEAE
Esta familia incluye bacterias patógenas de plantas y animal~s como Agrobacterium,
Bartonella y Bruce/la, bacterias c0.n capacidad para interactuar con cé[Link] eucarióticas en forma
intercelular o intracelular.

GÉNERO BRUCELLA:

Está constituido de un grupo muy homogéneo de bacterias, puesto de manifiesto por su

relación antigénica y por estudios de-hibridación DNA-DNA con> 90% de homología para todas las
especies. Con base en estos estudios se propuso que el-género estaba constituido por una sola • .J
especie, 8. melitensis y las otras especies restantes corresponderían a biovares . .Sin ·embargo, la
organización clásica del género· en seis especies se mantiene por las características de
patogenicidad y de preferencia de hospedador de cada una de las espedes. ·

Este género está constituido por bacilos cortos pequeños Gram negativos de 0.5 X 0.5
hasta 1.5 µm de longitud, inmóviles, aerobios, no esporulados y no capsulados. Se encuentran en
forma aislada o en grupos irregulares o cortas cadenas. Son oxidasa y catalasa positivo. No licúan
la gelatina, son ureasa positivo (con una excepción), reducen los nitratos a nitritos y no producen
•. /
ácido de los carbohidratos. No coagulan la leche. Varias especies producen H 2S, cuya intensidad se
lee _en el tiempo.

No desarrollan bien en los medios comunes, requiriendo medios enriquecidos como: agar
infusión de hígado, Tween 40, medio de Kuzdas y Morse, caldo agar Brucella, medio de Castañeda,
agar glucosado, agar papa o agar tripticasa adicionado de süero estéril al 5% que care'zca de
aglutininas para Bruce/la. Pueden crecer en agarTSA.

Por lo general el crecimiento es lento; las colonias aparecen después de 2-4 días de
incubación a 37°C, necesitando inicialmente para su desarrollo una atmósfera de CO2 al 10%. Son
no hemolíticas. El pH óptimo fluctúa entre 7-7,2, En medios líquidos a las 24 h s·e o_bserva un ligero
enturbamiento, el que entre los 8-10 días presenta un sedimento viscoso amarillento.
;_ .. ./

Las colonias presentan un ·diámetro ·de 0,5-3 mm después de 3 días de incubación y son
redondeadas, de bordes lisos, convexas y transparentes. Sin embargo; en el transcurso dé los-días
.. los cultivos tienden a modificarse, produciéndose .variaciones de colonias lisas a rugosas que se
relacionan con pérdida de patogenicidad y antigenicidad. _Son muy sensibles a los agentes externos
y se destruyen a la temperatura de pasteurización. En la leche refrigerada se mantienen viables
durante 10 días y en queso y mantequilla durante 2 a 4 meses.

,,-.,,

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udp Escuela de •.,'.,•

Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.

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 udp Escuela de
Tecnología Médica
,c .
.. _',_,. Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológi~o. Edición Nº7 - 2914

De acuerdo a la organización clásica hay 6 especies con sus respectivos biovares, que se
diferencian basándose en el crecimiento en medios con colorantes (tionina, fucsina), C0 2,
producción de H2S y aglutinación específica.

La enfermedad que produce en el ser humano se denomina brucelosis y se produce en-

personas que están en contacto con animales infectados o subproductos como leche y quesos no
pasteurizados (zoonosis) y en personal de laboratorio que trabaja con el microorganismo, razón
por la cual se debe emplear cabinas de Bioseguridad.

En la brucelosis (también conocida como Fiebre de Malta, Fiebre ondulante, Fiebre

recurrente o Bang) el microorganismo penetra a _través de la piel (incluso intacta) por la mucosa
respiratoria, conjuntiva! o digestiva (ingesta de productos lácteos contaminados). Tras un perí9do
de incubación de 10-20 d(as, las BruceHas alcanzan los ganglios linfáticos regionales y de allí pasan
a la sangre (sepsis).

El diagnóstico se realiza aislando el microorganismo a partir d_e la sangre (hemocultivo) o

por métodos indirectos como la reacción de Wright-Huddlesson, Test de Coombs anti Bruce/la,
í
Prueba del rosa de bengala, Elisá, radioinmunoensayo, etc.
,_
Las Brucellas son parásitos obligados de los mamíferos, en los cuales produce esterilidad,
aborto o portación asintomática. Las distintas especies reconocen los siguientes hospedadores
naturales:

Especie Nº de biovares Hospederos naturales

Bruce/la melitensis (3 biovares) - _ovinos y caprinos

_Bruce/la abortus (7 biovares) bovinos
Bruce/la suis (5 biovares) -cerdos
·-
Bruce/la canis (no tiene). perros, zorros y coyotes
' - Brucella ovis (no tiene) corderos
Brucella neotomae · - (no tiene) ratas ·del desierto ·-. -

De estas especies, B. ovis y 8. neotomae poseen baja virulencia por lo cual no tienen importancia
médica.

Características diferenciales entre los géneros Bordete/la, Bruce/la y Haemophilus

CARACTERISTICAS Bordetella Bruce/la Haemophilus

Parásito estricto +: + +
Localización en· cilios réspiratorios + - -
Aerobio estricto + + -
_Requerimientos nutritivos:
Tiamina -. .. + -
Nicotina mida + - -
Factor X y/o V - - +
Fermentan carbohidratos - - +
Reducción de nitratos D + +
Alcalinización leche tornasolada + - -
Oxidan aminoácidos + + -
Utilizan citrato D - -

udp Escuela de
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 •. /

··..J.,

-udp EscUela de .. .
Tecnología Médica
Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Edición Nº7 - 2014

De acuerdo a la clasifkación establecida en la segunda edición del Manual de Bergey de la

·Bacteriología Sistemática (y actuali_zado con anexo especial N2' 5 de 2004), este orden comprende --.
2 familias, siendo Bifidobacteriateae la que tiene importancia: para el ser humano. Este orden
'pertenece a la Subclase Actinobacteridae, Clase Actinobacteria, Phylum Actinobacteria.

FAMILIA BIFIDOBACTERIACEAE

Esta familia incluye dos géneros de importancia. para el ser humano: Gardnerella y
Bifidobacterium. Este último es anaerobio por lo cual se estudiará en conjunto con las demás
especies anaerobias en otro capítulo de esta Guía.

GÉNERO GARDNERELLA:

Está formado por una sola especie: Gardnerella vagina/is. 'Es· un bacilo Gram variable
(positivo o negativo) y pleomorfo. Mide 0,Sxl,5-2,5 µm. No capsulado, no esporulado e inmóvil.
tatalasa y oxidasa negativo. Anaerobio facultativo. Produce ácido de los carbohidratos, pero no
gas. Hidroliza el hipurato de sodio y es. susceptible al·polianetolsulfonato de sodio (discos de 20
µg}, pruebas claves para su identificación. ·

En agar sangre humana (o en agar Brucella, agar Sangre humana de doble capa) forman
colonias pequeñas de bordes lisos con ~ hemólisis circunscrita a. la colonia. El agar Columbia con
ácido nalidíxico se usa para su aislamiento selectivo.

Crece bien,en,microá[Link]. crecen en medios corrientes. Su temperatura óptima de

des~rrollo es de 35 a 37°C y su pH óptimo está entre 6 a 6.6. · · ·

Su hábitat son los genitales y tracto urinario en la especie humana (hoi:nbre y mujer). Es
consfderado el mayor_ productor de vaginosis _bacteriana.

Un aspecto interesante es· que Gardnerella se· adhiere a. la superficie de las células
epiteliales mucho más que Lactobacíl/us. Se ha comprobado que Mobíluncus también pose.e esta
misma característica cuando el medio vaginal pierde su acidez. Se desconoce la repercusión de
este fenómeno pero tiene mucha importancia en la clínica, ya que por esto se forman las "Clue
Cells" (o células clave), típicas de las vaginosis.

Características de Gardnerella vciqinalis

Catalasa -
~ hemólisis HSS +
Hipurato de Na + \

Bilis 10% s
Metronidazol 50 µg (PSD} s
Nitrofurantoína 150 µg >45mm
Sulfamida 1 mg. R
Polianetol sulfonato de sodio (20 ug.) s \ _j

HSS = Human blood bilayer PSD = Agar Peptona Almidón dextrosa

udp Escuela de
Tecnología Médica TM. Mg Cs. Erwin Landskron V. - TM. Pedro Cortés A.
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udp Escuela de
Tecnología Médica Manual de Microbiología Clínica y Diagnóstico Microbiológico. EdiciónNº7 - 2014
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Pruebas convencion~les para la identificación de especies de Haemophilus

• Prueba de requerimientos de factores X y V

El factor X (hemina) y el factor V (NAD) son