Técnicas de

Separación: Prácticas
GRADO EN QUÍMICA

Celia López Serrano

Óscar Jareño Amorós
UNIVERSIDAD DE ALICANTE | FACULTAD DE CIENCIAS
ÍNDICE

DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA MEDIANTE

CROMATOGRAFÍA DE GASES ......................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 2
CÁLCULOS Y RESULTADOS ......................................................................................................... 2
CUESTIONES .............................................................................................................................. 3
CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 7
SEPARACIÓN DE Fe Y Al EN UNA MUESTRA ACUOSA MEDIANTE EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
....................................................................................................................................................... 9
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 9
CÁLCULOS Y RESULTADOS ......................................................................................................... 9
CUESTIONES ............................................................................................................................ 10
CONCLUSIÓN ........................................................................................................................... 14
DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN BEBIDAS MEDIANTE HPLC .................................................... 15
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 15
CÁLCULOS Y RESULTADOS ....................................................................................................... 15
CUESTIONES ............................................................................................................................ 15
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................... 22
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 23

1
DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN ACEITE DE OLIVA VIRGEN
EXTRA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

INTRODUCCIÓN
La cromatografía de gases es una técnica instrumental que es utilizada para separar y
analizar mezclas en un cromatógrafo. En cromatografía de gases (GC), la muestra pasa a estado
gas, es decir, se volatiliza, y se inyecta a la columna del cromatógrafo. Aquí, la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito, ya que dicha fase está constituida por un gas inerte,
y su única función es la de transportar el analito a través de la columna.

En concreto, en esta práctica, queremos determinar los diferentes ácidos grasos

contenidos en distintos tipos de aceite. Los ácidos grasos pueden ser saturados, mono
insaturados o poli insaturados, siendo los insaturados más saludables que los saturados. Se
determinarán los ácidos grasos C16 (saturado), C16.1, C18, C18.2. Para ello, se convertirán en sus
correspondientes ésteres metílicos.

Los resultados de esta determinación nos indicarán la composición y, por tanto,

clasificación de cada aceite, siendo el más beneficioso el aceite de oliva virgen extra.

CÁLCULOS Y RESULTADOS
Para determinar el contenido de ácidos grasos en muestras reales, se preparan cinco
patrones de concentración conocida en un intervalo entre 0,05-2,5 mg/Kg a partir de una
disolución madre de 100 mg/Kg. Se prepara una disolución intermedia para evitar coger
volúmenes tan pequeños que debido al material que disponemos en el laboratorio, sería
imposible realizar la determinación.

Esta disolución intermedia tendrá una concentración de 10 mg/Kg y debido a la estequiometría

1:1 se puede emplear la siguiente ecuación:

𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2
Donde C1 se trata de la disolución madre, C2 es la concentración de la disolución intermedia de
10 mg/Kg y V2 es el volumen de la disolución intermedia la cual se enrasa en un matraz aforado
de 10 ml, obteniendo el siguiente volumen:
𝐶2 · 𝑉2 10 · 10
𝑉1 = = = 1 𝑚𝐿
𝐶1 100
Por tanto, se pipetea un volumen de 1 ml de la disolución madre y se enrasa hasta un volumen
de 10 mL con n-hexano.

Una vez obtenida esta disolución, se emplea el mismo procedimiento para realizar los
cinco patrones entre 0,05-2,5 mg/Kg.

Como ejemplo, se procede a realizar el cálculo para determinar el volumen que se necesitaría
de disolución intermedia y obtener un patrón con una concentración de 2,5 mg/Kg:

𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2

2
Donde C1 se trata de la disolución intermedia, C2 es la concentración del patrón, que es de 2,5
mg/Kg y V2 es el volumen del patrón del cual se enrasa en un matraz aforado de 10 mL,
obteniendo el siguiente volumen:
𝐶2 · 𝑉2 2,5 · 10
𝑉1 = = = 2,5 𝑚𝑙
𝐶1 10
Se pipetea un volumen de 2,5 mL de la disolución intermedia y 1mL de patrón interno y se enrasa
hasta un volumen de 10 mL con n-hexano.

Por último, se ha de comentar que se tuvo que realizar otra disolución intermedia de
concentración 5 mg/kg para poder obtener un volumen de 0,1 mL de esta disolución y obtener
así el patrón de 0,05 mg/kg, debido a que no disponemos en el laboratorio de una
instrumentación que pueda medir por debajo de 0,1 mL.

En la siguiente tabla se muestra el resultado del volumen extraído de las disoluciones de

referencia para cada uno de los patrones a determinar en la práctica:
Tabla 1: Volumen pipeteado para realizar cada patrón

Concentración / mg/Kg Volumen / mL

0,05 0,1
0,5 0,5
1 1
1,5 1,5
2,5 2,5

CUESTIONES

1. ¿Qué dos fases son las que hacen posibles la separación?

Para llevar a cabo la separación, es necesario que haya tanto una fase móvil, que se trataría de
un gas, como de una fase estacionaria que se trata de un líquido.

2. ¿Qué propiedad debe tener el gas que se emplea como fase móvil?

Debe ser seco, libre de oxígeno e inerte, de manera que no se someta fácilmente a reacciones
químicas. Un ejemplo es el Ar o el He.

3. ¿Qué dos tipos de columnas son las más empleadas como fase estacionaria?

Las más empleadas son las empaquetadas, también llamadas de relleno y las capilares, también
llamadas tubulares abiertas.

4. ¿Qué significa trabajar en condiciones isocráticas? y ¿en gradiente?

Cuando hablamos de condiciones isocráticas, nos referimos a que, durante el tiempo de trabajo,
las condiciones cromatográficas se mantienen constantes durante la separación. En cambio, si
trabajamos en condiciones de gradiente, las características de la separación se van modificando
durante la elución.

3
 5. ¿Quién es el responsable de la detección del analito? ¿Qué tipos son los más comunes?

El analito se detecta gracias al detector, que es un dispositivo para revelar la presencia de las
sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica. Normalmente puede ser: Detector
de ionización de llama, detector de conductividad térmica, detector de nitrógeno y fósforo,
detector de captura electrónica, detector de conductividad térmica y el de espectrometría de
masas.

6. ¿Qué propiedad debe tener el analito para ser determinado por cromatografía de
gases?

Debe ser volátil por lo que su punto de ebullición no debe ser elevado, de manera que sea
posible pasarlo a forma gas para su posterior análisis. Por ello, en la práctica pasamos de un
ácido (que tiene un punto de ebullición muy alto) a un éster.

7. Con los dos cromatogramas obtenidos para el apartado 1 de la práctica realizada en el

laboratorio obtener: el tiempo muerto (tM), el tiempo de retención (tR), factor de
retención (k) y resolución (Rs) para los ácidos grasos palmítico (C16), palmitoléico (C16.1),
esteárico (C18) y linoleico (C18.2).
Tabla 2: Datos extraídos del cromatograma

Ácido graso Tiempo muerto Tiempo de Factor de Tiempo Resolución (Rs)

(tM) /min retención (tR) retención (k) corregido /
/ min min
Palmítico 2,256 12,974 4,75 10,71
Palmitoleico 2,256 13,622 5,038 11,366 9,09
Esteárico 2,256 18,962 7,405 16,706
Linoleico 2,256 19,448 7,62 17,192 5,86

Siendo A el ácido palmítico y B el palmitoleico:

𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑜: 12,974 − 2,256 = 10,71 𝑚𝑖𝑛

(𝑡𝑟 )𝐵 − (𝑡𝑟 )𝐴 11,366 − 10,71
Resolución (R S ) = 𝑤𝐵 + 𝑤𝐴 = 0,0752 + 0,0691 = 9,09
2 2

8. Construcción de la recta de calibrado: área de pico frente a concentración.

Representar la gráfica, obtener la recta y expresarla con sus errores. Dichas rectas son
el resultado de la representación del área del éster metílico/área patrón interno frente
a la concentración éster metílico/concentración de patrón interno.

Con los datos indicados en la hoja de cálculos proporcionada por el equipo docente, se
construye una recta de calibrado donde nuestra señal analítica (eje y) es el área de cada
patrón de éster metílico entre el área del patrón interno, y en el eje x encontramos la
relación entre la concentración del éster metílico y la concentración de patrón interno.

4
 Esta relación será constante para el estudio de los cuatro ácidos, obteniendo la siguiente
recta de calibrado:

Ilustración 1: Recta de calibrado para los 4 ácidos

Tabla 3: Ecuaciones de la recta para cada ácido graso

Tipo de ácido graso Ecuación de la recta

C16 y= (1,69 ± 0,09)x – (0,13 ± 0,08)
C16.1 y= (1,39 ± 0,05)x – (0,12 ± 0,07)
C18 y= (1,24 ± 0,03)x – (0,10 ± 0,05)
C18.2 y= (1,30 ± 0,04)x – (0,09 ± 0,05)

Ahora tratamos de interpolar los valores obtenidos a partir de la división entre el área
del éster metílico de cada uno de los ácidos en los diferentes aceites y el área de patrón
interno, a través de los siguientes datos:
Tabla 4: Datos de área proporcionados

Muestra Área
C16 C16.1 C18 C18.2 C13
Aceite oliva virgen extra I 1534.2 111.5 177.4 803.3 888.2
Aceite oliva virgen extra II 1531.2 114.3 167.0 811.7 866.4
Aceite oliva virgen extra III 1538.9 118.0 180.7 798.8 874.7
Aceite oliva I 1307.3 106.6 152.3 833.4 737.3
Aceite oliva II 1321.7 102.7 164.3 812.2 725.2
Aceite oliva III 1316.2 103.8 155.9 821.8 723.2
Orujo de aceite I 1203.4 93.4 152.4 786.2 744.3
Orujo de aceite II 1220.4 98.2 145.0 764.9 752.4
Orujo de aceite III 1197.4 95.9 159.6 772.3 740.5
Aceite de girasol I 653.8 10.5 317.9 4266.9 817.7
Aceite de girasol II 661.0 12.6 311.4 4323.9 829.7
Aceite de girasol III 648.3 14.8 324.9 4301.5 815.8

Como ejemplo se procede a realizar el cálculo de los gramos de ácido palmítico por cada
100 gramos de aceite, en este caso del aceite de oliva virgen extra:

5
 En primer lugar, realizamos el promedio de la división entre el área del éster y
el área del patrón interno debido a que tenemos tres replicados:

Á𝑟𝑒𝑎 𝐶16 1534,2

𝑦= = = 1,727
Á𝑟𝑒𝑎 𝐶13 888,2

1,727 + 1,767 + 1,759

[𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜] = = 1,751
3
Este promedio se incorpora a la ecuación de la recta obtenida en el apartado anterior,
y se obtiene la concentración del éster de ácido palmítico frente a la concentración de
patrón interno:

𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

𝑦 − 𝑏 1,751 − 0,08
𝑥= = = 1,08 𝑚𝑔/𝐿
𝑚 1,69
Este valor se multiplica por la concentración de patrón interno (645,2 mg/L) y se obtiene:

[É𝑠𝑡𝑒𝑟] = 𝑥 · [𝐶13] = 1,08 · 645,2 = 702 𝑚𝑔/𝐿

El siguiente paso es obtener los miligramos del ácido y para ello se emplearán las
siguientes operaciones estequiométricas para pasar del éster del ácido al propio ácido.
Teniendo en cuenta que la estequiometría es [Link]

𝑚𝑔 1𝑔 1 𝑚𝑜𝑙
702 · ·
𝐿 1000 𝑚𝑔 270,4 𝑔 𝑑𝑒 é𝑠𝑡𝑒𝑟 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑙𝑚í𝑡𝑖𝑐𝑜

256,4 𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑙𝑚í𝑡𝑖𝑐𝑜 1000 𝑚𝑔 𝑚𝑔

· · = 665,8 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑙𝑚í𝑡𝑖𝑐𝑜
1 𝑚𝑜𝑙 1𝑔 𝐿
Para la muestra de aceite se usaron 0,3 gramos, que se diluyeron con 6mL, por lo que se
requiere la densidad del aceite (0,916 mg/L) para calcular hasta que volumen se llevó en
la dilución:
1 𝑚𝑙
0,3 𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 · = 0,33 𝑚𝐿, por lo que se llevo a un volumen de 6,33 𝑚𝐿
0,916 𝑔
Este valor nos sirve para calcular los g de ácido:

𝑚𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑙𝑚í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 665,8 · 0,00633 = 4,19 𝑚𝑔 á𝑐𝑖𝑑𝑜 = 0,00419 𝑔 á𝑐𝑖𝑑𝑜

Este valor se divide con los gramos de aceite (0,3g) y se multiplica por 100 al tratarse de
un porcentaje en masa:
0,00419 𝑔 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑜
· 100 = 1,53
0,3 100 𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒
Como se ha llevado a cabo una dilución 1:10, debemos multiplicar todos los resultados
obtenidos por un factor de 10.

6
 Este procedimiento se realiza para los cuatro tipos de aceites, recogiendo los datos
obtenidos en la Tabla 5:
Tabla 5: Resultados obtenidos

Aceite C16 (gácido graso / 100gaceite) C16.1 (g/100g) C18 (g/100g) C18.2 (g/100g)
Aceite de oliva 15,3 ± 0,9 2,5 ± 0,7 3,4 ± 0,8 10,9 ± 0,8
virgen extra
Aceite oliva 15,7 ± 0,9 2,6 ± 0,7 3,6 ± 0,8 13,2 ± 0,8
Orujo de aceite 14,2 ± 0,7 2,5 ± 0,7 3,5 ± 0,8 12,2 ± 0,9
Aceite de girasol 7,3 ± 0,7 1,3 ± 0,7 5,5 ± 0,8 57,50 ± 0,10

9. A partir de estas rectas se determina la concentración de cada uno de los ésteres

metílicos de los ácidos grasos en cada una de las muestras problema expresada como
g. ácido graso/100 g. aceite. Presentar los datos con sus errores y cifras significativas.
La respuesta a este ejercicio queda indicada en el ejercicio 8.

CONCLUSIONES
Si consultamos la normativa por el BOE para el aceite de girasol, podemos comprobar
que el único ácido graso que está por debajo del límite establecido es el esteárico; tanto el
palmítico como el palmitoleico y el linoleico, superan con creces éste máximo. Concluimos así
que no se podría comercializar.

Debido a este resultado, se debería repetir el

procedimiento para comprobar que no ha habido
una serie de errores sistemáticos y humanos. La
muestra se podría haber contaminado al estar tanto
tiempo expuesta al aire (la botella estaba mucho
tiempo abierta), o podrían haber ocurrido otro tipo
de errores como la mala homogeneización del
material, o poca precisión a la hora de la medida y
pesada, así como algún posible error en el cálculo.

Ilustración 2: Normativa del aceite de oliva

Mirando la normativa para el

aceite de oliva virgen extra, el
aceite de oliva y el de orujo,
comprobamos que entran dentro
de la normativa establecida, por
lo que se pueden comercializar.

Ilustración 3: Normativa para el AOVE, AO y ORUJO

7
Cabe destacar que, durante la realización de la práctica, se debe tener especial cuidado del
tratamiento de residuos, debiendo desecharse la fase orgánica en el bidón correspondiente a
disolventes no halogenados.

8
SEPARACIÓN DE Fe Y Al EN UNA MUESTRA ACUOSA MEDIANTE
EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO

INTRODUCCIÓN
La separación líquido-líquido es un proceso empleado para separar una o varias
sustancias disueltas en un disolvente mediante su transferencia a otro disolvente insoluble, o
parcialmente insoluble, en el primero.

En este caso, lo que se quiere es la separación de hierro y aluminio presentes en una

disolución acuosa, usando cloroformo como disolvente (fase orgánica), debido a que ambos
cationes son insolubles en él. Se añadirá también 8-hidroxiquinoleína (oxina) como extractante,
de tal manera que forme complejos con metales.

Si se controla de manera correcta el pH en fase acuosa, se conseguirá que la oxina forme

complejo únicamente con Fe (III), lo que nos permitirá su posterior determinación. Para ello, el
pH debe mantenerse ácido, entre 2,8 y 3,5, y así se favorezca la formación del oxinato férrico.

La determinación de estos compuestos se ha llevado a cabo con un ICP-OES, en lugar de con un

equipo de FAAS.

CÁLCULOS Y RESULTADOS
Etapa 1

En esta etapa, el objetivo es determinar la fase orgánica una vez realizada la extracción
líquido-líquido de los siguientes patrones que nos sirve para obtener una recta de calibrado y
conocer la concentración de nuestra muestra problema.

Para determinar esta recta, se preparan cuatro patrones de concentración conocida en un

intervalo entre 5-20 μg/mL a partir de una disolución madre de 1000 μg/mL. Se prepara una
disolución intermedia con una concentración de 10 μg/mL y debido a la estequiometría 1:1 se
puede emplear la siguiente ecuación:

𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2
Donde C1 se trata de la disolución madre, C2 es la concentración de la disolución intermedia de
10 μg/mL y V2 es el volumen de la disolución intermedia la cual se enrasa en un matraz aforado
de 100mL, obteniendo el siguiente volumen:
𝐶2 · 𝑉2 10 · 100
𝑉1 = = = 1𝑚𝐿
𝐶1 1000
Por tanto, se coge un volumen de 1mL de la disolución madre y se enrasa hasta un volumen de
100mL con agua.

Como ejemplo procedo a realizar el cálculo para determinar el volumen que

necesitaríamos de la disolución intermedia y conseguir en el embudo una masa de 5 μg:

𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2

9
Donde C1 se trata de la disolución intermedia, C2 es la masa del patrón que es 5μg y V2 es el
volumen de patrón que debemos introducir, obteniendo el siguiente volumen:
𝐶2 · 𝑉2 5 · 1
𝑉1 = = = 0,5 𝑚𝐿
𝐶1 10

Tabla 6: Volumen pipeteado correspondiente a cada concentración

Masa Fe (μg) Volumen (mL)
5 0,5
10 1
15 1,5
20 2

Se pipetea un volumen de 0,5 mL de la disolución intermedia y se lleva hasta un volumen de

4mL con agua.

En la Tabla 6, se muestra el resultado del volumen extraído de la disolución de referencia para

cada uno de los patrones a determinar en la práctica.

Para calcular el rendimiento de la extracción necesitamos que la fase orgánica y la fase acuosa
estén en las mismas unidades y al tener los patrones con unidades de masa, debemos dividir
por el volumen que añadimos de fase orgánica que es un total de 4 ml y con ello obtener la
concentración de hierro en cada fase.

CUESTIONES
1. Indique cuáles son las precauciones que hay que seguir para llevar a cabo una extracción
líquido-líquido simple empleando un embudo de decantación. Visualice el vídeo.

Algunas de las precauciones a tener en cuenta son: Antes de usarlo, debemos asegurarnos de
que el embudo está en buen estado y no tiene fugas que podrían caernos en la mano al agitar.
Al verter el líquida, hay que comprobar que llave está cerrada, así como colocar un vaso de
precipitados debajo del embudo, para que, en caso de rotura, el contenido caiga en el vaso. A
la hora de agitar, se hace suavemente y se coloca una mano en la llave y otra en el tapón. Dentro
del embudo se produce sobrepresión, por lo que hay que abrir la llave de vez en cuando. La
parte que queda arriba en la disolución (la de menor densidad) se vierte a un vaso por la parte
de arriba del embudo, para evitar que se impurifique.

2. Visualice el vídeo e indique:

a. ¿Cómo se puede llevar a cabo una separación de naftaleno y ácido benzoico?

Para llevar a cabo la separación, se va a aprovechar las diferencias en propiedades ácido-base

entre ambos compuestos: el naftaleno tiene carácter neutro, y el ácido benzoico tiene un grupo
carboxilo con propiedades ácidas. Para ello, se va a preparar una disolución de éter etílico de
ambos componentes, y se va a tratar con NaOH, de modo que el ácido benzoico reacciona,
generándose benzoato de sodio que pasa a la fase acuosa, y que es soluble en ésta. Se separan
las dos fases por decantación, de manera que tenemos la fase orgánica que contiene el naftaleno

10
y la fase acuosa que contiene el ácido benzoico en forma de benzoato de sodio. Para obtener el
naftaleno, evaporamos la fase orgánica. Para obtener el ácido benzoico, se acidifica la fase
acuosa con una disolución de HCl, hasta conseguir pH acido, de forma que el benzoato de sodio
reacciona transformándose en acido benzoico, que precipita al enfriar en un baño de hielo.
Filtramos entonces a vacío el sólido obtenido para obtener el ácido benzoico puro.

b. Escriba las reacciones que tienen lugar.

Fase orgánica: PhCOOH + NaOH ↔ PhCOONa + H2 O

Fase acuosa: PhCOONa + HCl ↔ PhCOOH + NaCl

PhCOO− (org) ↔ PhCOO− (ac)

c. Indique cómo se puede mejorar la eficacia de la extracción en este caso concreto

Una opción sería añadir NaOH en exceso para asegurarse que todo el ácido benzoico pasa a
benzoato. También se puede mejorar si se realiza con varios volúmenes pequeños, en vez de
con un único volumen grande de disolvente. Habitualmente, con dos o tres extracciones con la
mitad, o un tercio del volumen final, suele ser suficiente.

3. De los métodos mencionados en el vídeo. ¿Qué método de extracción es más eficaz y por
qué?

El método más eficaz es el último que se muestra, en el que se añade cloruro sódico a la
disolución acuosa. El NaCl satura la fase acuosa y se produce el efecto salino: la solubilidad de
los compuestos orgánicos en disoluciones saturadas con electrolitos fuertes, es mucho menor
que en agua.

4. ¿Se puede considerar a la acetona como un buen disolvente para efectuar extracciones
líquido-líquido de muestras acuosas? ¿por qué?

No, debido a que la acetona es muy soluble en agua, porque ambos compuestos son disolventes
polares.

5. Si se quiere extraer ácido acético de una disolución acuosa empleando tetracloruro de

carbono para ello ¿cómo influye el pH sobre el rendimiento de la extracción?

El pH deberá ser ácido para que no se forme un exceso de acetato, y por tanto disminuya la
concentración de ácido acético que pasa a la fase orgánica.

6. Indique los equilibrios que tienen lugar a lo largo del proceso de extracción de cationes
metálicos de una disolución acuosa empleando cloroformo en presencia de 8-
hidroxiquinoleína.

n OxH(ac) + Mn+ (ac) ↔ MOxn(ac) + n H − (ac)

n OxH(ac) ↔ n OxH(org)
MOxn(ac) ↔ MOxn(org)
Equilibrio de la oxina: ROx ↔ ROxH ↔ ROxH2+

11
7. ¿Por qué se debe mantener la disolución extractante de oxina al abrigo de la luz?

La oxina es un compuesto orgánico inestable que tiende a reaccionar o degradarse cuando le

incide la luz.

8. Obtenga la ecuación de la recta de calibrado para el hierro empleando las disoluciones

obtenidas en la ETAPA 1.
En esta etapa de la práctica, nos interesa analizar las fases orgánicas de los respectivos
patrones (0,5,10,15 y 20 μg) a través del valor de sus concentraciones, ya que será necesario
para realizar el rendimiento de la extracción. Para ello, se divide por 4 mL, que es el volumen
total de la fase orgánica. Se determinó a través de 3 equipos diferentes la absorbancia de
cada uno de los patrones. Una vez realizado el promedio ya podemos representar la
siguiente recta de calibrado:

Tabla 7: Absorbancias de los equipos

[Fe] μg/ml Equipo 1 Equipo 2 Equipo 3 Media

0 0 0 0 05
1,25 0,0643 0,0678 0,0624 0,06483333
2,5 0,1085 0,1091 0,1081 0,10856667
3,75 0,1588 0,1628 0,1579 0,15983333
5 0,2187 0,2201 0,2179 0,2189

Recta de calibrado
0,25
y = 0,0426x + 0,0039
0,2 R² = 0,9966
Absorbancia

0,15

0,1

0,05

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentración (γg/ml)

Ilustración 3: Absorbancia frente a concentración

Ecuación de la recta y= (0,0426 ± 0,0014)x + (0,004 ± 0,004)

12
Tabla 8: Concentración de hierro en las disoluciones

Disolución Absorbancia μg/ml de Fe

(promedio)
1 0,115 0,108 0,111 2,520 ± 0,011
2 0,054 0,049 0,052 1,12 ± 0,03
3 0,088 0,085 0,084 1,92 ± 0,04

En la siguiente etapa, se procede a obtener la determinación de la fase acuosa a través de

la técnica ICP y con los datos obtenidos durante la práctica, se realiza una representación
gráfica para obtener la recta de calibrado:

Tabla 9: Datos ICP fase acuosa

Concentración μg/ml Absorbancia Fe (259,940)

0 66
1 14685,5
2 32517,7
4 69575,3
10 167933

Recta de calibrado
180.000
160.000 y = 16916x - 559,84
R² = 0,9994
140.000
120.000
Absorbancia

100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
-20.000 0 2 4 6 8 10 12
Concentración μg/ml

Ilustración 4: Absorbancia frente a concentración (fase acuosa)

Ecuación de la recta y= (16900 ± 200)x - (600 ± 1100)

Una vez calculado estos términos, calculamos el valor de la concentración de Fe que queda
en la fase acuosa, sustituyendo la y por el valor de la absorbancia:

𝑦 = 16900𝑥 − 600
𝑦 + 600 1484,71 + 600
𝑥= = = 0,123 μg/ml
16900 16900

13
Tabla 10: Concentración de hierro que queda en la fase acuosa

Disoluciones Absorbancia (259,940) [Fe] / (μg/mL)

1 1484,71 0,123
2 513,479 0,0659
3 502,953 0,0653

9. Con los datos obtenidos en la ETAPA 2, proceda a calcular el rendimiento de la extracción

del hierro.
Para calcular el rendimiento de la extracción debemos conocer el volumen de las dos fases
cuyo volumen en ambas fases son 10 ml, de esa manera la proporción de volúmenes es:
𝑉𝑜𝑟𝑔 10
𝑟= = =1
𝑉𝑎𝑞 10
A continuación calculamos la constante de reparto:
[𝐹𝑒]𝑜𝑟𝑔 2,520
𝐷= = = 20,5
[𝐹𝑒]𝑎𝑐𝑢 0,123
Por tanto aplicamos la fórmula del rendimiento:
𝐷∙𝑟
𝑅= = 0,953 ∙ 100 = 95,3 %
1 + (𝐷 ∙ 𝑟)
Para el resto de disoluciones se obtiene el siguiente rendimiento:

Tabla 11: Rendimiento de las disoluciones

Disolución D R (%)
1 20,5 95,3
2 17,0 94,4
3 29,4 96,7

CONCLUSIÓN
La primera etapa es la correspondiente a la recta de calibrado de los patrones de fase
orgánica, y en ésta se obtiene una regresión lineal bastante baja, que se puede solucionar
realizando un mayor número de extracciones.

Durante el proceso, posiblemente se han cometido ciertos errores humanos y

sistemáticos que nos han impedido que los datos fueran precisos, tales como no extraer
suficiente fase orgánica y se quede cierta cantidad de la orgánica en la fase acuosa, que a la hora
de la medida en ICP puede interferir inconvenientemente, ya que la llama puede apagarse al
notar la presencia de fase orgánica dentro de la muestra. También, durante el proceso de
agitación, debido al estado del material de laboratorio, se habían producido pérdidas durante
cada extracción que afectan directamente a la reproducibilidad.

Por último, en cuanto al rendimiento de la extracción, cabe destacar que es bueno ya

que está próximo a un valor del 100%. Sin embargo, es preciso realizar una extracción continua
para obtener una extracción mucho más efectiva.

14
DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN BEBIDAS MEDIANTE HPLC

INTRODUCCIÓN
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes
de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil, y está
indicada para la determinación de compuestos orgánicos semivolátiles, es decir, muestras tales
como aguas, suelos, alimentos o extractos. Su región de absorción es la del UV-Vis.

En este caso, queremos determinar el contenido en cafeína de distintas bebidas,

concretamente en té negro, té rojo, café con y sin cafeína, y coca cola con y sin cafeína. Para la
determinación de forma cuantitativa, se van a realizar patrones de distinta concentración con
los cuales obtendremos una recta de calibrado.

A lo largo de la realización de la práctica, se deberá tener en cuenta que, antes de meter

las muestras de cola en el ultrasonidos, deberá desgasificarse todo lo posible. Se hace uso del
ultrasonidos con objetivo de quitar todo el gas contenido en la bebida para poder medirlo
correctamente. Para las muestras de café y té, se deberán filtrar antes de pasarlas al vial, para
así evitar impurezas que nos impidan su correcta determinación.

CÁLCULOS Y RESULTADOS
Los Cálculos y Resultados se desarrollan dentro del apartado Cuestiones.

CUESTIONES
1. ¿Qué dos fases son las que hacen posibles la separación?

Las dos fases que lo hacen posible son la fase móvil y la fase estacionaria.

2. ¿Qué dos modalidades de cromatografía de líquidos son las más empleadas?

Las más empleadas son la fase reversa HPLC y la fase normal HPLC

3. ¿De qué polaridad es la fase estacionaria en la modalidad de fase normal? ¿Y en fase

reversa?

La fase estacionaria tiene una alta polaridad en la fase normal, mientras que en la fase reversa
tiene una naturaleza apolar.

4. ¿De qué polaridades la fase móvil en la modalidad de fase normal? Y ¿en fase reversa?

La fase móvil en la fase normal será apolar, y en la fase reversa, será polar.

5. Si determino analitos polares qué tipo de cromatografía emplearía.

Dado que mi analito es polar, utilizaría la fase normal. Así, el analito se mezclaría correctamente
con la fase estacionaria de dicho método, y a su vez no interaccionaría con la fase apolar de la
fase móvil. Debemos tener en cuenta que la velocidad con la que se mueve cada sustancia
depende de su afinidad relativa por ambas fases.

15
 6. Si determino analitos apolares qué tipo de cromatografía emplearía.

Al contrario que lo mencionado en la pregunta 5, para un analito apolar lo óptimo sería utilizar
HPLC de fase reversa.

7. ¿De qué dos formas se puede inyectar la muestra?

Se puede de manera automática mediante, normalmente, un sistema de válvulas inyectoras, o

se puede hacer de manera manual.

8. ¿Qué significa trabajar en condiciones isocráticas? Y ¿en gradiente?

Cuando hablamos de condiciones isocráticas, nos referimos a que, durante el tiempo de trabajo,
las condiciones cromatográficas se mantienen constantes durante la separación. En cambio, si
trabajamos en condiciones de gradiente, las características de la separación se van modificando
durante la elución.

9. ¿Quién es el responsable de la detección del analito/s? ¿Qué tipos son los más
comunes?

Los analitos se detectan mediante un detector. En el caso del HPLC, hay dos tipos: los encargados
de medir una propiedad del soluto o de la disolución. En el caso de la medida de los solutos,
algunos de los más comunes son el de absorción UV-visible, el de absorción infrarroja, el de
fluorescencia. Para la disolución, cabe destacar el detector de índice de refracción o el de
conductividad.

10. ¿Por qué se emplea cromatografía de líquidos para la determinación de un único

compuesto?

Es debido a que la cromatografía de líquidos es una técnica de separación, muy sensible,

pero no es una técnica cuantitativa o cualitativa.

11. Para la cromatografía en papel de una tinta de pluma estilográfica, indicar cuál es el
factor de retención para las diferentes bandas coloreadas observadas.

El factor de retención se define como:

𝑡𝑟
𝑘=
𝑡𝑚
Por tanto, debemos calcular el tiempo de retención y el tiempo muerto de cada banda coloreada
de cada muestra. El tiempo muerto se considera desde el centro hasta donde acaba la gota, y el
tiempo de retención desde el centro hasta el final de cada banda coloreada.
Tabla 12: Muestras con su tiempo muerto correspondiente

Muestra Agua Agua y sal Vinagre Metanol Etanol

tm / cm 4 5,5 4,5 3 3,1

16
Tabla 13: Tiempo de retención

Agua Agua con sal Vinagre Metanol Etanol

Rojo 3,8 4,2 4,3 2,6 2,9
tr / cm Amarillo 5,2
Verde 4 4,5 3,1
Azul 5,5 3

Tabla 14: Factor de retención

Agua Agua con sal Vinagre Metanol Etanol

Rojo 0,95 0,763 0,95 0,87 0,935
k Amarillo 0,945
Verde 1 1 1
Azul 1 1

12. Para la cromatografía en papel de una tinta de pluma estilográfica, describir el impacto
de la naturaleza del eluyente sobre las diferentes bandas, así como la posición relativa
a las que han aparecido.

La diferencia en las muestras se debe a la diferencia de difusión entre las que contienen
iones disueltos (vinagre y agua con sal), lo que facilita el movimiento, y las muestras que no
los contienen (metanol, etanol y agua) tendrán un menor desplazamiento, así como una
separación entre bandas de colores.

También cabe destacar que en el caso del etanol y en metanol, se produce una rápida
evaporación, por lo que la gota dejará de crecer antes.

13. Para la cromatografía en papel de una tinta de pluma estilográfica, identificar,

mediante búsqueda bibliográfica, qué tipo de compuestos pueden estar presentes en
las tintas. Asignar el color observado al compuesto.
Tabla 15: Composición de la tinta

Componente Peso (%)

Aleppo galls, gall-nuts, ácido tánico 40-60
Sulfato de hierro (FeSO4 · 7H2O) 15-20
Goma arábiga 10-15
Índigo 2-4
Dicromato de potasio / sulfato de potasio y aluminio 2
Fenol / ácido bórico 2

Los colores que corresponden son:

17
Tabla 16: Colores correspondientes a cada compuesto

Compuestos Color
Ácido tánico Amarillo
Sulfato de hierro (FeSO4 · 7H2O) Azul-verdoso
Goma arábiga Ámbar
Índigo Azul
Dicromato de potasio / sulfato Rojo
de potasio y aluminio
Fenol / ácido bórico Incoloro

14. Construcción de la recta de calibrado: área de pico frente a concentración.

Representar la gráfica, obtener la recta y expresarla con sus errores.

En primer lugar, debemos determinar la concentración de cada uno de los patrones a

partir de la siguiente tabla:
Tabla 17: Mililitros utilizados para cada patrón

Patrón Volumen disolución madre / mL

1 0,25
2 0,5
3 1
4 2
5 2,5
6 3,75

Como conocemos la concentración de nuestra disolución madre y el volumen de cada

uno de los patrones podemos determinar la concentración de cada uno de ellos a través
de la siguiente expresión:

𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2
Como ejemplo procedo a realizar el cálculo para determinar la concentración del primer
patrón, donde C1 se trata de la disolución madre con un valor de 996,7 mg/L, V1 es el
volumen de la disolución madre y V2 es el volumen del patrón que está en torno a unos
25 mL, obteniendo la siguiente concentración:
𝐶1 · 𝑉1 996,7 · 0,25
𝐶2 = = = 9,967 𝑚𝑔/𝐿
𝑉2 25
Este procedimiento se realiza para cada uno de los patrones obteniendo los siguientes
resultados expresados en esta tabla:

18
Tabla 18: Concentración de patrones

Patrón V madre / mL Concentración patrón /ppm

1 0,25 9,967
2 0,5 19,934
3 1 39,868
4 2 79,736
5 2,5 99,67
6 3,75 149,505

El objetivo es obtener la recta de calibrado que representa el área del pico frente a la
concentración de cada uno de los patrones, así que a través de los datos facilitados por
el equipo docente y la concentración halladas a través de la expresión anterior, podemos
realizar la siguiente recta:

Tabla 19: Datos utilizados para la recta de calibrado

Concentración patrón / ppm Área

9,967 286,9
19,934 532,7
39,868 1022,3
79,736 1962,2
99,67 2470,9
149,505 3985,7

Cafeína
4500
4000 y = 26,06x - 21,462
3500 R² = 0,9963
3000
2500
Área

2000
1500
1000
500
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentración (ppm)

Ilustración 5: Área frente a concentración de cafeína

Ecuación de la recta y= (26,0 ± 0,8) – (21 ± 65)

A continuación, procedemos a calcular el límite de detección y cuantificación cuya discusión

será mencionada en el apartado de conclusiones y discusiones:

19
 LOD
3 · 𝑆𝑦⁄ 3 · 95
𝑥
𝑋𝐿𝑂𝐷 = = = 13 𝑝𝑝𝑚
𝑏 21
LOC
10 · 𝑆𝑦⁄ 10 · 95
𝑥
𝑋𝐿𝑂𝐶 = = = 45 𝑝𝑝𝑚
𝑏 21

15. Calcular la concentración de la cafeína en las muestras estudiadas en mg/L y mg/Kg.

Presentar los datos con sus errores y cifras significativas.

Para cada una de las muestras, tenemos tres medidas relacionadas con la señal analítica,
que en este caso es el área. Al tener la ecuación de la recta, podemos sustituir estos
valores obteniendo la concentración en partes por millón.
Una vez obtenido estos valores, se realiza el promedio de estas tres concentraciones
con su respectivo error y, por último, en las muestras de café y de té se realizó un factor
de dilución de 2,5. Por tanto, se mostrará a continuación los datos relacionados con la
concentración diluida y, tras aplicarle su factor de dilución, obtenemos la concentración
real.

Tabla 20: Resultados finales obtenidos

COLA SIN CAFEÍNA

Muestra Área [] real (ppm) Media Error Resultado
final
Cola sin cafeína I 17,4 1,49125
Cola sin cafeína II 16,4 1,45288 1,5078 0,064 1,51 ± 0,06
Cola sin cafeína III 19,7 1,57951

COLA
Muestra Área [] real (ppm) Media Error Resultado final
Cola I 3153,7 121,84
Cola II 3182,2 122,93 122,29 0,572 122,3 ± 0,6
Cola III 3160,3 122,09

CAFÉ SIN
Muestra Área [] diluida [] real (ppm) Media Error Resultado final
Café sin I 37,5 2,2625 5,6564
Café sin II 44,8 2,5427 6,3567 6,1584 0,437 6,16 ± 0,44
Café sin III 45,9 2,5849 6,4622
CAFÉ
Muestra Área [] diluida [] real (ppm) Media Error Resultado final
Café I 729,8 28,828 72,071
Café II 703,4 27,815 69,538 71,386 1,618 71,4 ± 1,6
Café III 734,8 29,020 72,550

20
 TÉ VERDE
Muestra Área [] diluida [] real (ppm) Media Error Resultado final
Té I 1542,5 60,015 150,036
Té II 1428,9 55,655 139,138 146,365 6,25 146 ± 6
Té III 1541,3 59,968 149,921

TÉ NEGRO
Muestra Área [] diluida [] real (ppm) Media Error Resultado final
Té I 2954,2 114,18 285,46
Té II 2879,3 111,31 278,28 284,605 5,94 285 ± 6
Té III 3002,2 116,02 290,07

TÉ ROJO
Muestra Área [] diluida [] real (ppm) Media Error Resultado final
Té I 1763,4 68,491 171,228
Té II 1748,9 67,934 169,837 170,483 0,700 170,5 ± 0,7
Té III 1754,6 68,153 170,383

El siguiente paso es expresar los resultados en mg/Kg. Para ello, se multiplica el volumen
(que es 0,15L) y se divide por la cantidad pesada, que en el caso del café es de 0,0005
kg, 0,0015 kg en el caso del té verde y 0,001675 kg para el té rojo. El té negro no se
realizó en la práctica. Por último, en la cola se aplica la inversa de la densidad al no pesar
ninguna cantidad. Se realizan los siguientes cálculos:
𝑚𝑔 0,15 𝐿
[𝑐𝑎𝑓é] = 71,4 · = 21420 𝑚𝑔/𝐾𝑔
𝐿 0,0005 𝑘𝑔
𝑚𝑔 0,15 𝐿 𝑚𝑔
[𝑡é 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑒] = 146 · = 14600
𝐿 0,0015 𝑘𝑔 𝐾𝑔
𝑚𝑔
122,3 𝐿
[𝑐𝑜𝑙𝑎] = = 123,53 𝑚𝑔/𝐾𝑔
0,99
Para los errores se hace de la misma forma al tratarse de constantes, obteniendo
Tabla 21: Concentración de cada muestra

Muestra Concentración mg/Kg

Café 21400 ± 500
Café sin cafeína 1850 ± 130
Té verde 14600 ± 600
Té rojo 15270 ± 60
Cola 123,5 ± 0,6
Cola sin cafeína 1,52 ± 0,06

21
CONCLUSIÓN

Tabla 22: Comparación de datos con la normativa

Muestra Experimental (%) Normativa (%)

Café 2,14 0,1-2,5
Café sin cafeína 0,18 0,1-0,3
Cola 0,012 0,015
Cola sin cafeína 0,00015 ----
Experimental (mg/100 ml) Normativa (mg/100 ml)
Té verde 14,6 15
Té rojo 17,05 20

Convirtiendo los datos obtenidos en porcentaje, podemos comparar las cantidades

establecidas para cada muestra. En el caso del café, estaría dentro de la normativa, tanto con
cafeína como sin. Para la cola con cafeína, también se ha obtenido un valor que entra dentro de
los límites establecidos. Sin embargo, para la cola sin cafeína no se ha podido encontrar ningún
valor. De todas formas, la detección de cafeína en la cola sin, no se ha podido realizar de manera
fiable debido a que su concentración está por debajo del límite de detección.

Para el caso del té, nos tenemos que fijar a través de las cantidades reguladas en mg/100
ml. Para ello se divide entre 10 el valor de la concentración en ppm, y de esa manera la
concentración en el caso del té verde es 14,6 mg/100 ml, según la legislación se establece en
unos 15 mg/100 ml por lo que podemos decir que está bastante próxima a este valor y sí que se
podrá comercializar. Como hemos mencionado anteriormente los datos de cola sin cafeína y de
café sin cafeína, se encuentran por debajo del LOD y por tanto se puede confundir con la señal
que nos muestre el blanco, aunque para esta práctica se hará una excepción y nos servirá como
orientación a la hora de realizar los cálculos.

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