Tema 1. Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias.
1.-Técnicas de aglutinación.
2.-Técnicas de precipitación en medio líquido.
3.-Técnicas de precipitación en gel.
4.-Técnicas de fijación del complemento.
5.-Diagnóstico y seguimiento serológico de las enfermedades.
1.-Técnicas de aglutinación
El cuerpo humano posee la capacidad de defenderse ante productos extraños, nocivos
o no. Para ello, utiliza las células y tejidos que forman el sistema inmune. El sistema inmune
(SI) es el encargado de proteger al individuo de las agresiones de otros seres vivos procedentes
del medio ambiente exterior (microorganismos, parásitos, etc.) o del propio medio interno.
Este SI es una red de células distribuidas por todo el organismo, intercomunicadas y
perfectamente coordinadas formando nuestro sistema defensivo. Estas células tienen una gran
movilidad y pueden localizarse en la sangre o situarse en órganos, como el ganglio, en tejidos,
como el bazo. Funcionalmente, el SI está integrado por dos grandes sistemas o mecanismos
defensivos, la inmunidad innata y la adaptativa. La inmunidad innata o inespecífica es un
sistema de defensa con el que todos nacemos y que nos protege contra todos los antígenos,
sin previamente haber estado expuestos a ellos. También existen otras barreras que
imposibilitan la entrada de los materiales dañinos en el cuerpo (tos, lágrimas oculares, moco,
piel, ácidos gástricos, etc.). La inmunidad adaptativa o específica se desenvuelve con la
exposición previa a diversos antígenos. El SI desarrolla una defensa específica contra ese
antígeno con la producción de anticuerpos, dirigidos contra los nuevos antígenos aparecidos
en el sistema. Los anticuerpos son inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B que se
producen como respuesta a un antígeno extraño. El objetivo del SI es neutralizar y/o eliminar
lo extraño. Lo hace siguiendo diversos mecanismos, dos de ellos son la aglutinación y la
precipitación.
La aglutinación es un fenómeno que consiste en un agrupamiento de antígenos por la
acción de los anticuerpos constituyendo una red visible a simple vista.
❱ Características:
◗ La viscosidad y fuerza iónica del
medio en que ocurre la unión debe de
ser adecuadas.
◗ La sensibilidad y especificidad de
los resultados depende del grado de
pureza de los antígenos, se trata de
que no haya intrusos que dificulten la
unión.
❱ Ventajas: la facilidad, rapidez de la
técnica, el grado de sensibilidad
permisible y la detección de gran diversidad de anticuerpos. Además, la temperatura no
influye prácticamente en las pruebas.
❱ Desventajas: se trata de una técnica semicuantitativa por lo que es poco reproducible. Si
existe exceso o déficit de anticuerpos o antígenos la agregación no se hará efecto. En el caso
de exceso, se saturan los receptores de la superficie e impide la formación de agregados. Si es
exceso de antígenos tampoco se forman, ya que cada partícula captura a los pocos anticuerpos
existentes individualmente.
❱ Utilidad clínica: se suelen utilizar en enfermedades infecciosas, para trasfusiones,
autoanticuerpos en pacientes con enfermedad autoinmune etc.
❱Tipos
Directa: el antígeno es particulado, es decir, que el o los antígenos que son
reconocidos por los anticuerpos forman parte de una partícula, las bacterias o glóbulos rojos
(la tipificación de grupos sanguíneos se hace con aglutinación directa). Se usa en antígenos con
dos o más sitios de unión. Se necesita un medio iónico adecuado. Se puede realizar
determinación cualitativa, son ejemplos tipado de grupos sanguíneos, diagnóstico de
brucelosis o serotipado de bacterias en gastroenteritis
Indirecta: el antígeno no se encuentra formando parte de una partícula; entonces lo
que se hace es fijarlo a una, las partículas de látex o hematíes (fijación de antígenos de T. cruzi
a glóbulos rojos). La aglutinación indirecta reversa es lo contrario: lo que se fija a la partícula
de látex o hematíes es el anticuerpo (hay aglutinación si el antígeno está presente en el
suero).Esta aglutinación se produce por partículas de mayor diámetro en suspensión,
formándose una malla grande visible.
2. Técnicas de precipitación en medio líquido (difusión doble)
Se pondrán anticuerpos y antígenos y se dejarán que difundan sin forzarlos. No es una
buena técnica para cuantificar debido a su falta de precisión. Existen otras dos técnicas de
difusión pasiva, pero en lugar de utilizar medio líquido, utilizan geles semisólidos. También
requieren un tiempo de incubación.
Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-
Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que
hablamos no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-
Ac. Cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero
conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad
de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo.
En un extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades
de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de
Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una
molécula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de
equivalencia, en donde la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que
precipitan.
La reacción de precipitación depende de la valencia del Ac y del Ag. La valencia del Ac
da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente
posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla
del máximo número de epítopos que posee. Para que se pueda producir la interacción
secundaria Ag-Ac con la consecuente formación del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben
ser, al menos, bivalentes.
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se
dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
La dispersión de la luz depende de la longitud de onda de la luz, del tamaño de la
partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.
La turbidimetría y la nefelometría son técnicas analíticas basadas en la dispersión de la
luz; en ambas técnicas se obtendrá el resultado de una concentración de proteína en
suspensión.
❱ La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través
de una suspensión de partículas utilizando para ello un
espectrofotómetro. Se suele utilizar para soluciones concentradas,
por ejemplo, la determinación de proteínas totales en suero, líquido
cefalorraquídeo u orina.
❱ La nefelometría mide la luz dispersada en dirección distinta a la
luz emitida, utiliza como
instrumento el nefelómetro y se suele utilizar para
concentraciones más diluidas.
La nefelometría se basa en la medición de
radiación dispersa; en cambio, la turbidimetría se basa
en la medición de la intensidad de un haz disminuido.
Si se desea cuantificar proteínas concretas, se
utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas
proteínas de la muestra, en este caso se habla de
inmunoturbidimetría e inmunonefelometría.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos
reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rápidamente,
pero existe una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y, es precisamente en
esta fase en la que aparece la dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e
inmunonefelometría se mide la dispersión de la luz provocada por los complejos Ag-Ac.
❱ La inmunoturbidimetría se basa en la disminución de la luz transmitida a través de una
suspensión de complejos Ag-Ac utilizando para ello un espectrofotómetro.
❱ La inmunonefelometría cuantifica la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida de
una suspensión de complejos Ag-Ac utilizando como instrumento el nefelómetro.
Estas técnicas permiten un gran automatismo, por ello es más sencillo procesar un
mayor número de muestras en menor tiempo. Se obtienen valores de cuantificación muy
precisos de la cantidad total de determinadas proteínas en suero. Algunos ejemplos de
determinaciones que se pueden cuantificar por ambas técnicas son la cuantificación de IgG,
IgA, IgM, C3, C4, proteína C reactiva.
2.1. Pruebas de unión secundaria
La reacción antígeno-anticuerpo va seguida de una segunda reacción. Si el antígeno es
soluble, la reacción que se da es de precipitación. Si el antígeno es particulado (suspensión), la
reacción es de aglutinación.
❱ Son de menor sensibilidad que las primarias, pero más clásicas.
❱ Aglutinación: en placa, en tubo.
❱ Precipitación: inmunodifusión en agar, inmunoelectroforesis.
❱ Hemoaglutinación.
❱ Inhibición de la hemoaglutinación.
❱ Fijación de complemento.
Finalmente, hay que comentar que las reacciones de precipitación se dan cuando se
mezclan cantidades suficientes de antígenos solubles con anticuerpos.
Si hay exceso de anticuerpo, no hay suficiente antígeno para formar un
inmunocomplejo visible. Si hay exceso de antígeno, se forman inmunocomplejos pequeños
constituidos por un anticuerpo y dos antí[Link] la zona de equivalencia se forma una
auténtica red de inmunocomplejos que precipitan de forma visible.
3. Técnicas de precipitación en gel (o medio sólido)
Se utiliza un soporte gelificado en el que se difunden el antígeno y el anticuerpo. Se
suelen utilizar medios de agar. Se agrupan dentro de dos clases: técnicas
inmunoelectroforéticas e inmunodifusión.
3.1. Técnicas inmunoelectroforéticas.
Se trata de la separación y caracterización de proteínas, basada en la separación
electroforética y la reacción con anticuerpos específicos frente a las mismas. Se utiliza un
medio con un pH cercano al 8,6 y un gel de agarosa 1 % de un grosor no más de 1 mm. Se
utiliza este pH ya que, manteniendo los anticuerpos en estas condiciones son prácticamente
inactivos. El grosor de la base de agarosa y su porosidad permite el paso de complejos
antígeno-anticuerpo y una separación adecuada de las proteínas. Estos complejos se tiñen con
colorantes como el azul de Coomassie. Esta técnica permite la unión de ligandos, la precisión
de la actividad enzimática y la separación electroforética.
Se basa en la separación de las proteínas por electroforesis. Una vez separadas, se
deposita el suero de anticuerpos y se forma un precipitado tras un periodo adecuado de
difusión, para permitir que las proteínas se encuentren con sus anticuerpos específicos.
3.1.1. Inmunoelectroforesis cruzada
Se conoce también por inmunoelectroforesis cuantitativa de dos dimensiones. Se
realiza una separación de proteínas inicial y, a continuación, se vuelven a someter a una
segunda electroforesis, esta vez en un gel que contiene los propios anticuerpos específicos
contra la proteína.
En esta segunda acción es cuando se forman los inmunoprecipitados; de este modo,
cada precipitado tendrá sus propias características
migratorias. Así, cada banda que veamos
corresponderá a un antígeno diferente, de esta
manera será posible conocer la cantidad de
proteína así como la cantidad de anticuerpo
específico en el gel, de manera que se puede
realizar una relativa cuantificación de los
componentes. Se diferencia del método anterior
en que las proteínas, tras su electroforesis inicial,
no se incuban con anticuerpos.
3.1.2. Inmunoelectroforesis en cohete
Se le da este nombre por la forma característica del precipitado en el gel. Esta técnica
consiste en cargar en el gel diluciones seriadas con aumento progresivo de la cantidad de
antígeno, de forma sucesiva y en perpendicular a la dirección del campo eléctrico, al mismo
tiempo que el anticuerpo se encuentra dosificado por el gel.
3.1.3. Contrainmunoelectroforesis
Se trata de utilizar el principio de que las inmunoglobulinas migran hacia el polo
negativo y las proteínas hacia el positivo, se colocan de forma inversa a su migración,
imponiendo así su encuentro. Colocaremos en el polo positivo el suero con los anticuerpos,
mientras que cerca del polo negativo colocaremos las proteínas y estas migrarán hacia el polo
positivo. De este modo, ambos se encontrarán a una distancia intermedia, certificando así la
interacción.
3.1.4. Inmunoelectroforesis de afinidad
Esta técnica se fundamenta en el cambio de conformación de una proteína cuando
existe una interacción con su ligando. Se utiliza para estimar constantes de unión. Esta
variación se ha usado en la identificación de alérgicos a través de su reacción con IgE.
3.2. Técnicas de inmunodifusión
Usa un soporte de agar donde se
propagan los antígenos y anticuerpos. Se
establece un equilibrio entre las
concentraciones de antígenos y de
anticuerpos se puede ver una banda de
precipitado.
3.2.1 Inmunodifusión radial
Es una técnica que puede determinar
cuantitativamente la concentración de un antígeno, es decir,
puede averiguar la cantidad de antígeno de la muestra. Es
una técnica muy sensible y se usa en la clínica para la
detección de niveles de proteínas plasmáticas. El principio de
la técnica se basa en incorporar un anticuerpo a una placa de
agarosa solidificada. Se cortan pocillos dentro de la agarosa y
se llenan con concentraciones conocidas de antígeno
correspondientes al anticuerpo que queremos estudiar. El
objetivo es obtener una curva de calibración. Se colocan las muestras en los pocillos. Habrá
complejo AgAc en toda la zona circundante al pozo dentro de la línea de precipitina. Cuando se
forma esta línea significa que la proporción de antígeno-anticuerpo es equiparable. Esta es
conocida como la zona de equivalencia. Esta reacción tarda 24-48 h).
4. Técnicas de fijación del complemento
En esta técnica se unen antígeno-anticuerpo formando un inmunocomplejo que activa
el complemento. Se añade un sistema indicador recubierto de anticuerpos específicos. Estos
complejos son capaces de lesionar membranas celulares (eritrocitos y otras células). Si se lisan
los eritrocitos (hemólisis) indica que hay complemento libre que no se fijó en el primer
complejo y que, por tanto, no hay anticuerpos en el suero. Se utiliza en el diagnóstico de la
brucelosis.
Figura. Se representa la reacción que aparece entre los anticuerpos frente a la
brucelosis. Estos captarían todo el complemento existente en el medio evitando la lisis de los
hematíes, prueba positiva. Si el suero problema no tiene anticuerpos se observaría una
hemólisis y prueba negativa.
5. Diagnóstico y seguimiento serológico de las enfermedades infecciosas
5.1. Inmunodifusión radial
Mediante esta técnica podemos:
❱ Estudiar los niveles séricos de las diferentes inmunoglobulinas (A; M; D; G), los déficits o
aumentos de inmunoglobulinas en el caso de hipo o hipergammaglobulinemias que podemos
encontrar en ciertas enfermedades hepáticas, autoinmunes, etc.
❱ Analizar los niveles de las cadenas ligeras (kappa y lambda), como en el caso de los
mielomas.
❱ Determinar algunos componentes de la secuencia del complemento. La dosis es importante
en el caso del estudio del lupus. El tipo C1 es útil para el diagnóstico de una enfermedad
llamada edema agioneurótico hereditario, donde veremos que el C1 inhibidor o bien la enzima
que controla uno de los primeros pasas de su secuencia de activación estarán ausentes.
5.2. Inmunoelectroforesis
Es de utilidad para la determinación de bandas monoclonales para ver exactamente
su composición y se revela con antisueros específicos. En el proteinograma la aparición de
bandas patológicas podría centrarse en cualquier nivel,
siendo por ello necesario hacer el estudio
inmunoelectroforético. La inmunoelectroforesis será útil en
la clasificación de los mielomas y en la detección de bandas
monoclonales, en síndromes linfoproliferativos como la
macroglobulemia de Waldenstrom, cuyo componente
monoclonal es IgM.
El 8% de los pacientes mayores de 60 años sanos
pueden presentar bandas monoclonales benignas.
5.3 - Inmuofluorescencia para la detección de anticuerpos antinucleares
Podemos encontrar los anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero de determinados
enfermos. El sustrato empleado es hígado de rata, que se incuba junto con el suero que se va a
estudiar, se lava y se añaden las antiglobulinas humanas marcadas con fluoresceína o
rodamina. Volvemos a hacer una incubación y lavado. Las preparaciones están listas para
observar al microscopio de fluorescencia. Si el suero del paciente tenía ANA, estos se fijarán a
nivel de estas estructuras, apareciendo la fluoresceína positiva en los núcleos.
Para el estudio tenemos que tener en cuenta el título de la positividad (es la dilución
del suero estudiado que aún nos da fluorescencia positiva) y el tipo de patrón.
5.3.1 Tipo de patrón
❱ Periférico: equivale a un halo de positividad alrededor del núcleo pero por dentro en lugar de
por fuera. Este patrón traduce anticuerpos anti ADN de doble cadena.
❱ Moteado: equivale a pequeñas imágenes fluorescentes redondeadas o en motas. Este patrón
está producido por anticuerpos ENA (antígeno nuclear extraíble). Estos antígenos tienen dos
fracciones: una es la fracción resistente a la ribonucleasa (SM) y el otro es la fracción
ribonucleasa (NP).
❱ Homogéneo: equivale a todo el núcleo fluorescente, este patrón está producido por
anticuerpos antinucleares dirigidos contra varias partes del núcleo de diferente naturaleza.
❱ Nucleolar: solo es visible la fluorescencia en el núcleo. Traduce anticuerpos anti ARN
ribosomal.
Estas técnicas pueden utilizarse para diagnosticar enfermedades reumáticas y del
tejido conectivo como: lupus (LED), síndrome de Sjoëgren, esclerodermia, enfermedad media
del tejido conectivo, poliomelitis o dermatomiocitis.
La principal utilidad de las técnicas de fluorescencia está en la exclusión del LED.
Prácticamente el 100% de los pacientes con lupus tienen Ac antinucleares, es decir, que si esta
técnica es negativa, excluye el LED. En cambio, sin son positivos, no nos indicará
necesariamente que tenemos lupus, debido a que otras enfermedades también pueden
presentar Ac antinucleares positivos. Lo más común en el lupus es encontrar un título elevado
y un patrón periférico o bien homogéneo.
Un titulo es el número de veces que una solución (sangre de una persona) puede ser
diluida antes de que una sustancia (anticuerpo) pueda ser detectada. Así un título de ANA 1:80
significa que la sangre se puede diluir en 80 porciones.
Si el título fuera elevado y el patrón moteado podría tratarse de un LED como de una
enfermedad mixta del tejido conectivo. El patrón nuclear es típico de la esclerodermia. Si el
título no es elevado, la detección de la alteración resultará difícil y tendremos que utilizar otras
técnicas más sofisticadas como son:
5.3.2 Técnicas de detección de anticuerpos anti ADN
❱ RIA. Radioinmunoanálisis.
❱ Flagelados (Crithidia lucilia). SI se observa inmunofluorescencia a nivel del quinetoplasto
diremos que estamos ante la presencia de AC anti DNA.
5.3.3 Técnicas de determinación de anticuerpos anti ENA
Siglas inglesas de extractable nuclear antigens, antígenos nucleares extraíbles, que son
los que se extraen del núcleo celular mediante soluciones salinas isotónicas
(ribonucleoproteínas, Sm, etc.).
Estos anticuerpos se dirigen frente a los antígenos nucleares no histónicos (anti SM,
anti RNP, anti Ro/SSA, anti La/SSB).
El principal problema de la utilización de esta técnica radica en su complejidad.
Los anticuerpos anti ENA podrán ser detectados por técnicas de hemaglutinación o
bien de electroforesis.
EL patrón moteado puede aparecer en el LED y en las conectivopatías mixtas, y cuando
lo encontremos, realizaremos sobre le mismo un tratamiento con ribonucleasa y, si
desaparece, se deberá a RNP, y por tanto, se tratará de una conectivopatía.
5.3.4 Técnicas de estudio de anticuerpos tisulares
❱ Antimitocondriales: el sustrato es el riñón enfermo (cirrosis, hepatopatías)
❱ Anti músculo liso: el sustrato es el estómago de rata (hepatopatías crónicas)
❱ Anti células parietales: (anemias perniciosas, síndrome de Sjoërgen)
❱ Anti suprarrenales: con sustrato en las células suprarrenales hiperplásicas (enfermedad de
Addison)
❱ Anti islotes de Langerhans: páncreas humano (diabetes tipo I)
❱ Anti microsomales: sustrato tiroides humano (hipotiroidismos, tumores)
❱ Anti tiroglobulina: el sustrato es la hemaglutinación en cordero (tiroiditis crónicas,
mixedema, enfermedad de Graves Basedow)
La diferencia entre esta técnica y la de anticuerpos antinucleares es que utilizan
sustratos diferentes.
En el diagnóstico y manejo de la enfermedad infecciosa, las pruebas basadas en la
reacción Ag-Ac son una valiosa herramienta. Los procedimientos más comunes son la técnica
de captura, para el estudio del antígeno y la técnica indirecta para el análisis de los
anticuerpos.
❱ Técnicas de captura. Son utilizadas para conocer si un paciente tiene circulante el Ag de
superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB). Se emplea una placa de multipocillos de
poliestireno unido a un Ac monoclonal específico. Al poner en contacto el suero del paciente
daría positivo si realmente hubiera AgsHB.
❱ Técnicas indirectas. Se utilizan para ver la presencia de Ac G, M o A para un determinado
antígeno sea un virus, parásito, bacteria u hongo. Se emplean placas de poliestireno
sensibilizadas con los Ag respectivos. Por ejemplo, si deseamos investigar Ac contra el VIH. Al
introducir el suero del paciente, si realmente hubiera Ac en el mismo nos daría positivo.
Finalmente, los resultados de las pruebas deben ser valorados dentro del contexto de
una correlación clínica para evitar falsos positivos o negativos. Por ello, se deben realizar
interconsultas clínicas de los pacientes. La interacción entre el equipo clínico y el laboratorio
justifica un estudio personalizado que evitará errores en el diagnóstico, consiguiendo el mejor
tratamiento para el paciente.
