Principios de
criopreservación.
Criopreservación
de semen en
bovinos y
caninos
CURSO:
TERIOGENOLOGIA
AUTOR: MVZ
FERNANDO BENAVIDES
MANRIQUE
TEMAS:
➢ PRINCIPIOS DE CRIOBIOLOGÌA
➢ DILUTORES
➢ TECNICA DE CONGELACION Y DESCONGELACION
➢ TECNICA DE REFRIGERACION
➢ TECNICA DE VITRIFICACION
OBJETIVOS DE LA CRIOPRESERVACION
• MANTENER LA DIVERSIDAD GENETICA
• DISTRIBUCION DE BUENA GENETICA
• TRATAMIENTO DE INFERTILIDAD
• BANCO GENETICO
PRINCIPIOS DE CRIOBIOLOGIA
Una solución esta compuesta de agua y solutos (sales,
proteinas, carbohidratos, etc.)
Encontramos agua y solutos (solución) dentro y fuera de la
celula.
Para congelar una celula necesitamos que se encuentre dentro
de una solución mantenga vivas las celulas.
PRINCIPIOS DE CRIOBIOLOGIA
La temperatura de congelación es inversamente proporcional a
la concentración de solutos presentes. Mientras mas agua
tenga (el dilutor o la célula) mas rápido se congela.
CONGELACION: agua se transforma en cristales de hielo, los
solutos al quedarse sin agua se concentran y aumenta su
osmolaridad absorviendo agua
Lo primero que se congela es lo que esta fuera de la celula, ya
que la celula esta protegida por la membrana plasmatica
(lipidica).
Cuando la solución extracelular se congela, al concentrarse los
solutos del dilutor, absorben agua del interior de la célula
deshidratándola.
La deshidratación celular ayuda a que la membrana plasmática
se flexibilice y no sea dañada por los cristales de hielo extra e
intracelulares..
El éxito de la crio preservación radica en que no se dañen las
células, para ello debe estar lo suficientemente deshidratada
para que el hielo intra y extra celular no dañe las células en la
congelación, pero sin que se deshidrate demasiado.
Si la congelación es muy rápida, el exterior e interior de la
célula se congela rápido y no llega a deshidratarse. Entonces se
forman cristales de hielo dentro de la célula dañando la
membrana y matando a la célula.
Si la congelación es muy lenta, la deshidratación celular es muy
intensa y la célula colapsa.
En la descongelación primero se descongela la solución
externa y la célula absorbe mas o menos agua dependiendo de
la velocidad de la descongelación
El éxito de la congelación y la descongelación depende de
la temperatura, velocidad de congelación y
descongelación, de la cantidad y tipo de solutos de la
solución externa (dilutor) y de la membrana de la célula
(efecto mecánico o de disolución).
A B C
MP
SOLUCIÓN
CITOPLASMA
SOLUTO
HIELO
PROCESO CORRECTO DE LA
CONGELACIÓN Célula con membrana
flexible. Congelación
Espermatozoide en solución Soluto libre deshidrata la célula sin daño.
CONGELACION MUY RAPIDA
CONGELACION MUY LENTA
ACCIÓN DE LOS CRIOPROTECTORES PENETRANTES
Criopreservante penetrante
. . . .. . . . . .
. . . .
. . .. . . . .. .
.. . . . ..
.... .
..
.... .
CRIOPROTECTOR –
TOLERANCIA OSMÓTICA
FASE DE TRANSICIÓN DE
LÍPIDOS DE MEMBRANA
CONGELACIÓN: EFECTO SOLUCION Y
FORMACION DE CRISTALES
INTRACELULARE
CRIOPROTECTOR
• HYGROSCOPIA
• TOLERANCIA OSMÓTICA
• MODIFICA CRISTALES DE HIELO
• NEUTRALIZA EL EFECTO SOLUCION
• El congelamiento y
descongelamiento de las soluciones
de células debe permitir el
mantenimiento de la osmolaridad,
Semen pH, además de proveer una fuente
de energía y prevenir el daño de los
cristales de hielo.
Congel • Durante el congelamiento de una
suspensión celular, el material
ado extracelular se congela,
especialmente el agua, por lo que
los solutos se encuentran en alta
concentración, motivando que la
gradiente osmótica saque agua de
las células.
• Agentes Crioprotectores
• Penetrantes.- Ligan agua,
constituyéndose en una
fracción no congelada:
• Glicerol, dimetilsulfóxido,
metanol
• - No penetrantes.- Actúan
osmóticamente para promover
la deshidratación de la célula
durante el congelamiento:
proteínas, azúcares,
polivinilpirolidona
Semen Congelado
• GLICEROL
• Es el mejor crioprotector en las diferentes especies.
• Se usa combinado con dimetilsulfóxido.
• La concentración depende del dilutor, método de
refrigeración y la [Link] ser un equilibrio entre
los efectos protectores y tóxicos (capacidad
fertilizante).
• FUNCIÓN BUFFER
• Sino existe un mecanismo de
remoción de los iones, la
Semen actividad del espermatozoide,
resulta en un gran incremento
de iones hidrógeno, lo que
Congel alteraría el pH de la solución.
Esto ocasionaría una reducción
ado en la longevidad y fertilidad del
espermatozoide.
• Yema de huevo, TRIS
• Yema de Huevo
• Tiene componentes fosfolípidos,
que protegen a las membranas
celulares del shock frío
Semen • Azúcares
• Fuentes de energía,
Congel componentes osmóticos y agentes
crioprotectores.
ado • Glucosa. Fructosa, manosa –
energía
• Lactosa, rafinosa -
crioprotectores
Semen Congelado
• DILUCIÓN
• REFRIGERACION
• CONGELACIÓN
• DESCONGELACIÓN
• DILUCIÓN
• REFRIGERACION
Semen • Puede durar varias horas, se
desarrolla la máxima resistencia
Congel contra los efectos del
congelamiento.
• En toro la motilidad y fertilidad
ado es más alta con mayor tiempo de
refrigeración. Permitiría cambios
en la membrana, que la harían
más resistente a la congelación.
• Si la tasa de refrigeración es
lenta, la célula se deshidrata
lentamente, y pueden resistir
al descongelamiento.
• Si la tasa de refrigeración es
muy rápida el fluido
intracelular no se moviliza tan
rápido, se forman cristales de
hielo intracelulares y la célula
muere.
• CONGELACIÓN
• En ampollas o pajillas en
vapores de nitrógeno.
Semen • Se puede controlar la tasa de
congelación variando la altura de
Congel del semen con respecto al nivel de
N2.
• El método va a depender del
ado dilutor , del envase y
concentración de glicerol.
• Una tasa pronedio se considera
de –10 a -100°C por minuto
• DESCONGELACIÓN
Semen • Ovino, vacuno, equino ;
descongelación en agua
Congel • 75°C por 5-6 seg.
ado • 37-40°C por un minuto
(integridad de acrosoma)
Evaluación de espermatozoides post
descongelamiento
Integridad funcional de membrana
(Test Hipooosmótico)
Evaluación de espermatozoides
post descongelamiento
Vitalidad/integridad acrosomal
Vivo-acrosoma Muerto-acrosoma Vivo - sin Muerto-sin
íntegro íntegro acrosoma acrosoma
CONGELAMIENTO
DE SEMEN CANINO
• El líquido prostático afecta la sobrevivencia
espermática, por lo que debe separarse mediante
centrifugación.
• Puede variar entre 5 a 10 minutos a 180g – 720 g (
2500 rpm Laboratorio Favez).
• Una vez obtenido el pellet, reconstituir
inmediatamente con dilutor
Centrifugación
Criterios para la toma de
muestra:
• Volumen ≥ 2.0 ml
• Concentración espermática
PROTOCOLO DE > 200 millones de
CONGELAMIENTO espermatozoides/ml
DE SEMEN • Motilidad espermática
mínima del 70% y 80%
• Morfológicamente
normales
Metodología:
• Colectar el semen, es recomendable separar
las 3 fracciones (pre-espermática, espermática
y prostática), en caso no se logre, tratar de
separar la fracción prostática de las otras dos
fracciones.
• Evaluar el semen al microscopio
– Morfología (% normales)
– Motilidad progresiva (%)
– Concentración espermática
• Centrifugar a 2500 por 10 minutos
• Recolectar el sobrenadante y evaluarlo para
ver si se encuentra presencia de
espermatozoides.
• Agregar el dilutor TRILADYL según lo calculado
dependiendo de la concentración espermática,
que se encuentra a baño maría (37°C)
IMPORTANTE: COLOCAR DILUTOR AL SEMEN
(NO VICEVERSA) y homogenizar suavemente.
• Colocar en un recipiente con agua fresca (25-
28 °C) el tubo del semen más el dilutor, y
enviarlo a refrigeración por 4 horas a una
temperatura de 4°C. Evaluar cada media hora
la motilidad (%) de los espermatozoides hasta
cumplirse las 4 horas. IMPORTANTE: EVITAR
EN TODO MOMENTO EL INGRESO DE AGUA AL
TUBO CON LA MUESTRA Y NO RETIRAR EL
TUBO CON LA MUESTRA DE LA
REFRIGERACIÓN PARA EVITAR SHOCK
TÉRMICO.
• Colocar la muestra en las pajillas de 0.5 ml,
dejando espacio de aire y sellarlos antes de
ingresarlos al tanque de nitrógeno.
CONGELAMIENTO
• Se debe de tener en cuenta la distancia de
7cm de la base superior y la canastilla donde
se colocaran las pajillas.
• Se seguirá el siguiente manejo con la canastilla
para el congelamiento del semen:
– 7 cm – 2 minutos
– 13 cm – 2 minutos
– 20 cm – 1 minutos
• Finalizado se ingresa la canastilla con las
pajillas completamente dentro del nitrógeno
líquido.
Tasas de congelamiento:
• + 5°C - 8°C 11°C/min
• - 8°C - 15°C 3.5°C/min
• -15 °C - 100°C 26.5 °C/min
Descongelamiento
• Colocar la pajilla en agua a 37°C por 60
segundos.
• Evaluar:
– Motilidad
– Morfología
¿Cuanto dilutor voy a usar?
• En cada pajilla de 0.5ml debe haber 100 - 150
millones de espermatozoides motiles.
• Si tenemos un 60% de motilidad multiplico el
total de espermatozoides por 0.6. Así se
cuantos ezp tengo para distribuir en pajillas.
• La cantidad total de dilutor a usar en ml,
equivale al numero de pajillas por 0.5. Con ese
volumen suspendo los ezp centrifugados y
luego lo divido en pajillas.
METODO MINITUBE
• PREPARAR DILUTOR 5 PARTES DE DILUTOR POR 1 DE YEMA (20%
MINITUBE)
• CENTRIFUGAR (700 G / 10 MIN)
• AGREGAR DILUTOR DE CONGELAMIENTO (temperado 37°C gota a
gota)
• ENPAJILLAR
• PONER PAJILLAS DIRECTAMENTE EN REFRIGERADOR A 4°C POR 2
HORAS
• COLOCAR PAJILLAS PARA QUE SE CONGELEN EN VAPOR DE
NITROGENO: 5CM DE NITROGENO Y PAJILLAS A 5 CM DE SUPERFICIE
DE NITROGENO. USAR CAJA DE TECNOPOR. DEJAR EN VAPOR POR 15
MIN (-120°C)
• PONER PAJILLAS EN TANQUE DE NITROGENO A -196°C
DESCONGELAMIENTO Y PREPARACION PARA
INSEMINACION
• Descongelar a baño maría 37°C por un min.
• Vaciar las pajillas necesarias para completar una dosis de
200 millones de espermatozoides MOVILES!
• VOLUMEN TCI: Perras pequeñas 2 a 3ml. Perras medianas
y grandes: 3 a 4ml
• Si necesito pocas pajillas necesito completar volumen:
agrego dilutor de refrigeración o de mejoramiento
• Si necesito muchas pajillas debo centrifugar todo el
volumen y resuspenderlo hasta 3ml con dilutor de
refrigeración o de mejoramiento
• Si insemino en vagina debo duplicar la dosis de TCI
CONGELAMIENTO
DE SEMEN
BOVINO
PASOS GENERALES PARA LA
CRIOPRESERVACIÓN
• COLECCIÓN DE SEMEN
• DILUCIÓN
• EQUILIBRACIÓN
• CONGELAMIENTO
DILUTORES
• AGREGAR LENTAMENTE AL SEMEN
EQUILIBRACIÓN
• DE TEMPERATURA AMBIENTE A 4-5°C
• > 90 MIN
• REQUIERE YEMA DE HUEVO Y GLICEROL
(TOXICIDAD)
CONGELAMIENTO
• POR VAPORES DE NITROGENO:
5CM SOBRE EL NITROGENO LIQUIDO POR 10
MIN
• POR CONGELADOR CONTROLADOR DE LA
TASA DE CONGELACIÓN
• PAJILLAS DE 0.25 ML SE CONGELAN MEJOR
QUE LAS DE 0.5 ML. PERO TIENEN MAS
RIESGO DE DAÑO CELULAR ANTE CAMBIOS DE
TEMPERATURA.
