BIOLOGÍA

MOLECULAR

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 TEMA 1: DNA, cromosomas y organización del genoma

1. THE QUEST OF SECRET LIFE.

Hay rasgos que pasan de generación a generación, estos rasgos se transmiten a través de un
manual de instrucciones que permite que la evolución ocurra y tiene que pasarse la información
durante generaciones. Este manual es el código genético.

• Tiene que permitir que ocurra la evolución

• Este manual de instrucciones tiene que pasar de una generación a otra

• Darwin: teoría de la evolución natural. Los organismos más adaptados al ambiente son
aquellos que van a tener más probable de sobrevivir, reproducirse y pasar sus rasgos a
la siguiente generación.

• Mendel: estudio una serie de características de los guisantes y observo como se

transmitía de generación en generación esas características. Estableció las leyes de
Mendel en las cuales se determinó que los rasgos provenían de los factores
hereditarios. Esto se determinó mediante el experimento de los guisantes.

• Miescher: descubrió los ácidos nucleicos como una nueva sustancia. Cogió vendas de
pacientes aislando células blancas de la sangre y núcleos encontrando así una nueva
sustancia, los á.cidos nucleicos.

• Flemming, Boveri, Sutton: desarrollan la teoría cromosómica, proponiendo que éstos

son los que físicamente llevan la información. Describen como son estos, como se
mueven en la mitosis y su papel en la transmisión de los caracteres genéticos ya que
se descubrió que los factores hereditarios se encontraban en los cromosomas.

• Thomas Hunt Morgan: demostró la teoría cromosómica. Para ello estudiaban

alteraciones genéticas (mutaciones) identificando que algunos de los rasgos eran
diferentes (ej: los ojos de las moscas tenían manchas blancas: mutación recesiva en el
cromosoma X). Por ello cuando solo había un cromosoma X eran capaces de verlo.

Si los rasgos se heredaban de forma independiente es pq estaban en diferentes

cromosomas mientras que si se heredaban de forma conjunta estaban en el mismo
cromosomas.

• Griffith: aisló el material hereditario (transformación bacteriana: capacidad de

transformar un tipo de bacteria en otra). Habiendo 2 cepas, S (patogénica) y R (no
patogénica). Esto inyectado en ratones con la S se muere y con la R sigue vivo.
EXPERIMENTO 1.

EXPERIMENTO 2: A las bacterias patógenas (S) se les aplica calor lo que provoca que
estas pierdan la patogenicidad y se convirtieran en no patógenas y por tanto cuando
se inoculan al ratón no provocaría ningún efecto sobre esta.

EXPERIMENTO 3: si las bacterias no patógenas (S) producidas por el contacto con el

calor se juntas con bacterias no patógenas (R) al inoculárselas al ratón provocaría su
muerte.

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• O. Avery, C. Macleod, M. Mcarty: tenía que haber una sustancia que pasase de la S a
la R: ¿proteinas o DNA?
Finalmente estos 3 científicos demostraron que el DNA era el responsable de la
transformación bacteriana.

Para ello se volvió a una cepa inactiva y se creó un extracto (todos los elementos cell
no están dentro de las cell). Cogiendo este extracto se trató con proteasas que
destruían proteínas y se mezcla con la cepa no patogénica (R :roug). Esto sigue
manteniendo la capacidad de transformación y las cepas R pasan a la S y matan el
ratón

Mientras que si se destruye el DNA con DNAasas no hay capacidad de transformación

de cepas. Por ello se demostró que el DNA lleva la inf para que unas cepas pasen de no
patogénicas a patogénicas.

• Hershey y Chase: demuestran lo mismo trabajando con bateriofagos. Para ello

marcaron con radiactividad las proteínas o el DNA, una de las cuales era lo que
transmitía el bacteriófago a las bacterias.

Para distinguir donde están cada uno de ellos (virus y

bacteria) aplicaron centrifugación en un tubo
separando los bacteriófagos por arriba.
Esto permitió distinguir si el material que se trasmitía
era el DNA o proteínas.

Estando la radiactividad en el caso de las proteínas en

el sobrenadante (donde quedaban los virus ya que
pesan menos que las bacterias) y en el DNA en el
pellet (donde estaban las bacterias).

De tal manera pudieron concluir que, al encontrarse el DNA marcado radiactivamente

en el pellet, el bacteriófago inyectaba el DNA dentro de la bacteria y que por tanto es
lo que se transmitía.

• Chargaff: estudió la cantidad de bases nitrogenadas demostrando que la proporción

de A era la misma que la T y la de G la misma que la C. Para ello cogió DNA de
difierentes organismos viendo esto.

• Rosalind Franklin: consiguió la fotografía de difracción de rayos X del DNA.

Posteriormente, Maurice Wilkins compartió esta fotografía sin el permiso de Franklin a
Watson and Crick, los cuales fueron capaces de interpretar los resultados de la imagen
y propusieron el modelo de la estructura del DNA en 1953. Estos últimos tres reciben
el premio nobel de medicina en 1962.

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2. ESTRUCTURA DEL DNA.

• Tiene que permitir la evolución. Ocurre cuando hay mutaciones que cambian la
secuencia.
• La inf tiene que pasar de generación en generación.

La descripción del DNA transformo la ciencia y medicina (prevención, diagnóstico y

tratamiento) y la sociedad.

ESTRUCTURA

El DNA es una doble hélice formada por un esqueleto de azúcar y

fosfato y en la parte interior tenemos las bases nitrogenadas unidas
con puentes de hidrogeno. Las hebras están formadas por nucleótidos.

Cada una de las subunidades de una hebra es conocido como

nucleótido (base + azúcar + fosfato).

Nucleotido: el enlace entre la pentosa y la base n es conocido como enlace N-

glucosídico. Con 1 (nucleósido monofosfato, difosfato..) o 2 grupos fosfatos. En el
caso del fosfato la unión es de tipo externa.

Nucleósido: cuando no presenta fosfatos.

• Bases nitrogenadas
◼ Purinas: adenina, guanina
◼ Pirimidinas: citosina y timina (se
sustituye en el RNA por uracilo)
• Pentosas
◼ DNA: desoxirribosa
◼ RNA: ribosa (con un hidroxilo)

Unión de nucleótidos: mediante un enlace fosfodiéster mediante el OH del C3 y el

grupo fosfato del C5. Permite la unión de los 2 nucleótidos. Esta forma de unirse
permite que las hebras del DNA tengan polaridad. Presenta 2 extremos libres (5’-3’).
Presenta 2 hebras que se unirán mediante la complementación de las bases
nitrogenadas. Una de las hebras será 5’-3’ y la otra al revés
- Regla de Chargaff: las A se emparejan con las T (mediante 2 puentes de H) y
las C y G (por 3; necesita más energía). Gracias a esta distribución el ancho de
la hebra es siempre el mismo (ya que se va a tener purinas y pirimidinas 1 y 1).

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 La doble hélice se encuentra formada por 2 esqueletos de zúcar fosforilados y
enrorrados sobre sí mismo, dando 1 vuelta cada 10 bases (10,4 nucleótidos). La
distancia entre un nucleótido y otro es de 0,34 nm. La anchura de la hebra es de 2nm.
Debido al enrollamiento dextrógiro se van a formar un surco mayor y otro menor.

FUNCIONES:

• Pasar la información de generación en generación: la doble hebra va a ser el molde que

nos permite hacer más copia mediante la separación de las 2 hebras (gracias a que las
uniones de puentes de H se van a rompen más fácilmente que las uniones entre
nucleótidos al ser estas covalentes). Esto nos permite separar la doble hebra y copiarla
(replicación semiconservativa). En esta una de los moldes sirve para hacer uan nueva copia

Experimento: utilizaron cell de E. colli haciendo un extracto y colocándolo en un

gradiente de cloruro de cesio permitiendo colocar el DNA en función de su peso. Esto
se lleva a cabo con N14. Si esto se lleva a cabo con N15 la molécula de DNA va más
abajo.

Una vez en el medio con N15 pasan a un isótopo ligero (N14). De tal manera que una
de las hebras será la antigua (que habrá crecido con N15) y la nueva se habrá
sintetizado con isótopo ligero N14 encontrándose entre un peso intermedio entre
ambos.

Para separar la doble hélice se separan por desnaturalización por calor que hace que se rompan los
puentes de H. En el caso de una PCR utilizamos oligonucleótidos (moléculas de DNA de una cadena) que
cuando desnaturalizamos después son capaces de encontrar su complementaria.

Visualización del DNA: mediante la utilización de luz violeta que al estar cargado negativamente se
puede separar (debido a que el compuesto, RedSafe que emite luz ultravioleta es capaz de unirse al
DNA).. Gracias a esta carga de los fosfatos se puede incorporar el DNA en geles de agarosa y aplicando
una corriente se podrá separar fragmentos del DNA que migrará al polo positivo (ánodo).

Los fragmentos de más tamaño tienen una mayor dificultad de movimiento y por ello se añade un
compuesto químico.

3. INFORMACIÓN DEL DNA

La información del DNA se puede almacenar. Esta información viene dada por la combinación
de 4 monómeros (bases nitrogenadas). La combinación de ellas es lo que da lugar al código
genético. Esta información se va copiando y transmitiendo. Además esta información puede ser
leída por otros organismo (ej: producción de insulina).

La información del DNA se organiza en genes (estructura esencial y funcional del DNA).

Un gen-un enzima: utilizando neurospora crassa que es capaz de crecer en un medio sin
suplemento y se irradian (con rayos X) sus esporas, produciéndose alteraciones en las
moléculas del DNA.

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 Después crecen en un medio con suplemento y se
separan las esporas. Para ello utilizan 2 tubos;
uno con un medio suplementado y otro en un
medio mínimo. Lo que vieron es que tenía que
estar alterada alguna ruta metabólica ya que
salvo que se le introdujeran complementos morían.

Si se le añaden vitaminas y crecen presentan un déficit de

vitaminas. Para saber que vitaminas estaban afectadas se
pusieron en diferentes vitaminas hasta observar que con el
ácido pantoténico crecía. De tal manera que la irradiación había
afectado a alguna ruta metabólica que producía la vitamina.

Si se produce un cambio en el DNA, se produce un cambio en el RNA, después en la proteína y

por ello en la función.

Dogma central de la biología molecular: la información del DNA

fluye a RNA y de este a proteína, que el DNA se puede hacer
copias a si mismo, que del RNA se puede pasar a DNA mediante
una retrotranscriptasa. Pero que nunca desde las proteínas a
RNA/DNA.

La información de la molécula de DNA se organiza alrededor de 4 bases

(atgc) mientras qye las proteínas con 20. El paso se lleva a cbo mediante el
código genético.

Anemia falciforme: el cambio de un único nucleótido

4. ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACION: GENOMA Y CROMOSOMAS

La información completa de un organismo es el genoma que da lugar al RNA y proteínas. Lo

que no se encuentre en el genoma no se puede sintetizar. En 2021 se publicó la secuencia
definitiva del genoma.

La información se organiza en el núcleo celular, en el cual la cromatina puede estar más

concentrada (heterocromatina) o no (eucromatina).

Las diferencias en el tamaño del DNA entre eucariotas se deben a la existencia del DNA no
codificante (intrones) más que el que codifica para proteínas (exones). De toda la información
que hay de 3200 km, solo una parte presentara la información codificante (30m). Los intrones
se eliminan mediante el splicing.

La cantidad de DNA no muestra la complejidad del organismo y el tamaño del genoma no está
relacionado con los números de genes.
De la tabla solo aprenderse las cifras del humano:

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El coste de secuenciar el genoma humano a disminuido lo que permite que pueda ser utilizado
de manera más sencilla para observar diferentes enfermedades.

El DNA contiene los genes, que son las unidades básicas de información.

DESCUBRIMIENTO DE LOS INTRONES.

[Link] y Phillip A. Sharp descubieron los

intrones.

Para ello utilizaron el adenovirus 2. Este puede

infectar a células y generar a partir de su DNA
viral un RNA viral en la célula. Mezclaron el DNA
viral con el mensajero y obtuvieron imágenes en
las que vieron que en determinadas zonas había
híbridos de DNA y RNA, habiendo zonas en las
que coinciden al ser complementarias (exones) y
otras zonas en las que el DNA viral no codificaba
nada (intrones).
Más del 90% de los genes humanos son intrones.

Los exones incluyen regiones y los extremos del RNAm de tal

manera que no tienen la información para sintetizar
proteína. Estas regiones de los extremos son conocidas como
regiones UTR y se dan tanto en el extremo 5’ (5’ UTR) como
en el 3’ (3’UTR).

ANATOMÍA DE UN GEN:

En los genes, además de intrones y exones existen regiones reguladoras que se encuentran por
delante de la zona codificante y son los que indican cuando el gen debe de expresarse y cuando
no.

Los genes se encuentran formados por tanto por un promotor y varios exones e intrones que
tras la transcripción dan lugar a pre-mRNA. Esta molécula sufre un proceso de maduración
conocido como splicing en el cual se eliminan los intrones y se identifican las regiones UTR de
los exones marcadas por el codón de inicio y el de parada.

Un gen presenta aproximadamente 10 exones (4300 pares de bases) con secuencias

codificantes de 1700 pares de bases e intrones de 52000 pares de bases. Es decir, la mayoría
del gen no contiene información codificante. En el gen existen elementos reguladores que
controlan la transcripción.

La estructura del DNA esta en un estado que aparenta bastante caos.

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 ORGANIZACIONES DEL GENOMA

BACTERIAS VIRUS CÉLULAS EUCARIOTAS

Única molécula de DNA Material genético de DNA o Hay diferentes moléculas de
circular RNA de una hebra o doble DNA organizada en
hebra cromosomas que se
Con plásmidos: moléculas de Necesita utilizar la encuentran en el núcleo
DNA circulares libres y maquinaria de la célula para
aislados que son utilizados replicarse Es importante que la
en ingeniería genética. información se empaquete

En orgánulos como
mitocondrias o
cloroplasmtos tb tienen DNA

Cariotipo: nº y aspecto de los cromosomas de un organismo. Los humanos tenemos 22 pares

de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales. Se utilizan diferentes técnicas
como la de Giemsa para que puedan ser obervados por el microscopio.

Ténica FISH (fluorescence in situ hybridazation) : permite coger secuencias específicas de DNA y
cogemos sondas y através de hibridación las sondas permiten marcan mediante fluorescencia
la zona del cromosoma donde se localiza el gen.

Cada cromosoma presenta un color diferente (cariotipo espectral).

Cromosoma metafásico: se encuentra en mayor compactación con 2 cromátidas hermanas

La organización de cromosomas no tiene que ver con el nº de genes o el genoma.

Tbla: recordar el humano de nº de cormosomas

Los cromosomas son la subunidad estructural de la información genética por lo que deben ser
copiados y separados. Para la replicación existen los orígenes de replicación y telómeros
mientras que para la segregación (separación) los centrómeros.

Durante la interfase hay diferentes zonas distribuidas a lo largo del cromosoma. En la

replicación se forman las burbujas de replicación que se forman y se van moviendo en sentidos
opuestos hasta replicar el cromosoma.

5. ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA ORGANIZACIÓN DEL GENOMA.

• Hapolides (normal): los humanos tenemos 23 pares de cromosomas.

• Poliploides: se multiplica el número haploide, lo que da lugar a diploide, triploide,
tetraploide…
• Aneuploidías: se generan cuando hay un nº irregular de cromosomas (aneuploidía).
De tal manera que a una de las células hija le va a faltar un cromosoma la otra va a
tener uno de más (trisomías)
- Síndrome de Down: trisomía en el cromosoma 21. Genera diferentes
características físicas y retraso mental
- Síndrome de Patau: trisomía en el cromosoma 13. Disminuye la capacidad
intelectual y se generan anormalidades físicas en diferentes pares del cuerpo
- Síndrome de Edward: trisomía en el 18. Lo mismo que la anterior.

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 También se pueden generar delecciones (se pierde parte de la inf), duplicación (el mismo trozo
aparece 2 veces), inversión (se le da la vuelta), sustitución (la inf de un cromosoma pasa a otro
cromosoma), translocación (se intercambia la inf de 2 cromsomas; pueden darse fusión de
proteínas que da lugar a una nueva y causa una enfermedad).

Un ejemplo de translocación es el cromosoma philadelphia, en el que se genera un

intercambio de información entre el cromosoma 9 y el 22 dando lugar a una fusión de los
fragmentos bcr y abl de los cromosomas que genera una actividad irregular de quinasa que es
lo que causa una enfermedad (leucemia mieloide crónica). Si se amplifica el gen Her2 produce
un cambio en el mecanismo de la tirosina quinasa del receptor EGF lo que genera un carcinoma
de ovario y pecho.

Los estudios de estos cromosomas tanto para estudiar cambios en el nº como cambios en la
estructura son importantes para la prevención, diagnóstico y tratamiento.

6. EMPAQUETAMIENTO DEL DNA.

La doble hebra del DNA tiene que empaquetarse (debido a los 2m que
ocupa el DNA) gracias a diferentes estructuras para dar lugar finalmente
al cromosoma metafásico (condensación máxima).

EJ: CROMOSOMA 22.

Si lo estiramos mide 1,5 cm mientras que en forma metafásico mide 2

micrómetros. Para conseguir este empaquetamiento presenta proteínas
especializadas que dan lugar a rondas consecutivas que permiten el
empaquetamiento de la cromatina (DNA nuclear + proteínas histonas/
no histonas).

La cromatina se encuentra formada por DNA del núcleo, histonas y proteínas no histónicas.
Las histonas son las encargadas del empaquetamiento más básico de la cromatina, mientras
que las no histónicas llevan a cabo funciones como la replicación o la expresión de genes.

1) Collar de 10 nm: se lleva a cabo gracias a los nucleosomas, que son la unidad básica de la
estructura de un cromosoma eucariota.

El nucleosoma está formado por una parte proteíca

(histonas) y se encuentra rodeado por DNA (incluye
aproximadamente 200 pares de nucleótidos). El
DNA se enrolla alrededor del nucleosoma y separa
un nucleosoma y otro.

Si se coje una cell en interfase, se trata y se pone la muestra en un MET podemos ver la 1º
estructura de empaquetamiento (collar de 10 nm).

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 Si esta estructura de 10 nm la tratamos con nucleasas (digieren el DNA) nos quedamos con los
nucleosomas de 11 nm de diámetro. Si tratamos los nucleosomas con una concentración alta
en sal, nos permite disociar el DNA de las histonas. Las histonas obtenidas si las disociamos
obtenemos las 4 tipo de histonas que forman el nucleosoma en forma de un octámero de
histonas (H2A, H2B, H3y H4).

Estas proteínas son pequeñas y básicas (cargadas positivamente) de

entre 102 a 135 aa que han sido conservadas a lo largo de la
evolución. Presentan las mismas estructuras: 3 alfa hélices conectadas
entre ellas por lazos. 1/5 de los aa que forman las histonas son
Lisina/Arginina que tienen carga + y son capaces de interaccionar con
el esqueleto del DNA (al tener este carga negativa).

La zona del histone fold es la estructura común que presentan entre

ellas y está implicada en la interacción con otras histonas para formar el nucleosoma y se
encuentran implicadas en el enrrollamiento del DNA.

La mayoría de ellas presenta una cola C-terminal mas o menos amplia. En el caso de la cola N-
terminal sale por fuera del nucleosoma y son diferentes entre sí. Este N-terminal permite la
interacción/regulación de la expresión génica del DNA: si son acetiladas se relaja la
compactación y se facilita la transcripción.

2) Fibras de 30 nm:

El siguiente orden de empaquetamiento (x50) son las fibras de 30 nm.. Los

nucleosomas tienen que interaccionar entre ellos para dar vueltas y que se
compacten. En este apilamiento, las colas de las histonas son muy
importantes, especialmente la cola de la H4 (facilita la interacción de las
histonas). Hay una histona diferente que es la H1 que contribuye al
empaquetamiento, que es capaz de interaccionar con el DNA tanto con las
otras histonas del nucleosoma. Esta histona es más grande que el resto.

Este compactamiento se reconoce mediante el M.E mediante la heterocromatina.

En este punto se forman bucles de 300 nm que se condensan hasta los cromosomas (700nm)
alcanzando la máxima compactación durante la metafase (1400nm).

7. CENTRÓMEROS Y TELÓMEROS

Centrómeros: zonas especializadas que van a promover la separación de las cromátidas

hermanas (segregación) durante la mitosis. A partir de esta secuencia del centrómero se va a
ensamblar el cinetocoro que va a ser capaz de interaccionar con los microtúbulos del huso
mitótico.

Experimento: se descubrió en la levadura S. Cerevisae una secuencia especial que le

indica a la célula donde localizar el centrómero y ensamblar el cinetocoro.

Se usó un plásmido que tenía un marcador específico que le permitía a las células
crecer en un medio sin leucina, mientras que las que no lo tenían no eran capaces de
sobrevivir. Esto es debido a que en el momento de la división, al no tener una secuencia
específica, los plásmidos no se distribuían de manera homogénea por lo que las células
que no heredaban el plásmido acababan muriendo.

Así se asumió que algo debía de existir en los cromosomas para garantizar una
distribución homogénea.

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 Por ello introdujeron una secuencia que actuaba como un centrómero para repartir el
plásmido de manera equitativa y vieron que todas las células sobrevivían, concluyendo
finalmente que el centrómero era esencial para el correcto reparto de la información
genética.

El centrómero presenta una variante de la histona H3, que se conoce como CENP-A
que hace que el nucleosoma se ensable con un cinetocoro. El cinétocoro va a estar
arragado al cromosoma y es donde engancha el microtbúlo lo que le va a permitir
separar la inf genética.
Cuando el DNA cromosómico se replica, el nucleosoma padre se distribuye a las hebras
progenitora haciendo que parte vayan con una hebra y parte con otra. Es entonces
donde la CENP-A se va incluyendo en las hebras hijas transmitiendo los centrómeros
(herencia epigenética)

Telómeros: se sitúan al final de los cromosomas. Importantes para la replicación.

CARACTERÍSTICAS
- Similares en todos los organismos eucariotas
- Las secuencias teloméricas se repiten cientos y miles de veces
- Contiene secuencias de G en una única hebra de DNA
- El final es un 3’ con una única hebra (overhang). El 3’overhang esta suelto y
no tiene secuencia complementaria.
- Cuando las hebras son de una única cadena pueden intentar complementarse
y generar inestabilidad genómica. Por ello las células tienen que desarrollar
un mecanismo para q el 3’ overhang no este suelto

Hay unos complejos de proteínas (senterinas)

que forman un lazo y se aseguran de que el 3’
overhang está metido dentro de la doble
hebra y que no va a formar ninguna
estructura que dañe el DNA.

- Se requiere de una polimerasa especial para replicarlos que es la telomerasa

La regulación de la biología de los telomeros es muy importante debido a que la desrregulacion

de la polimerasa se encuentra activa en muchos tipos de cáncer.

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 TEMA 2: replicación, reparación y recombinación del DNA

1. REPLICACIÓN DEL DNA

La información pasa de generación en generación gracias al DNA. Esta transmisión de la

información genética se tiene que dar de una forma fiable, ya que si no comprometeríamos la
viabilidad y se generarían mutaciones.

Las células van a copiar la inf genética, sólo una única vez (ya que si no generar inestabilidad
genómica), y esta copia tiene que ser precisa. Aunque la copia tiene que ser fiable, solo hasta
cierto punto, ya que la evolución viene determinada por diferentes cambios genéticos (como
mutaciones y reordenamientos genéticos)

La enzima principal en el caso de la replicación del DNA es la DNA polimerasa (se encarga de la
copia del DNA tanto en eucariotas como en procariotas). Las células tienen 2 maquinarias

• Copiar para la replicación del DNA

• Fiabilidad para la reparación del DNA

La replicación es semiconservativa (cada hebra forma un molde para sintetizar la nueva)

En el caso de las eucariotas tiene 3 tipos de polimerasas que se utilizan durante la replicación:
polimerasa epsilón, alfa primasa y delta (asociado el PCNA)

CARACTERÍSTICAS DE LAS DNA POLIMERASAS:

• Las polimerasas sintetizan el DNA en dirección 5’-3’

• La DNA polimerasa va a añadir nuevos dNTPs (desoxinucleótidos) a un primer que está
unida a la hebra molde a través de puentes de H.
• Son incapaces de sintetizar DNA solo con dNTPs sin un primer
• A diferencia de las DNA polimerasas, las RNA polimerasas si pueden iniciar la síntesis de
novo en la ausencia de un primer.
• En el template (molde) queda libre el hidroxilo que se une al DNTPs liberándose fosfato y
energía

*DNTp: cuando se une libera el PPi

La síntesis se lleva a cabo en dirección 5’-3’, mientras que el

molde se copia en dirección 3’-5’. Se añade dNTPs al primer y
este tiene que estar unido por puentes de H a la hebra molde.

La energía que se necesita para la polimerización se produce a

partir de la hidrólisis del grupo 5’ trifosfato del dNTP libre que
se añade al grupo -OH 3’ libre de la cadena.

Estas 2 características son esenciales para la copia del DNA.

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INICIO DE LA REPLICACIÓN

La replicación (síntesis de DNA) comienza en ciertos puntos de los cromosomas conocidas como
orígenes de replicación, los cuales se van a abrir para formar las horquillas de replicación
ensamblando una maquinaria de replicación que va a copiar en direcciones opuestas.

Si la hebra de arriba es 5’-3’, la de abajo va al contrario (3’-5’). Por ello esta última hebra no se
puede copiar debido a que las polimerasas copian en sentido 5’-3’ y en ese caso tendría que ser
al revés Por ello al no poderse llevar a cabo la replicación de 3’-5’, en esa parte se sintetiza
pequeños fragmentos en sentido contrario (5’-3’) conocidos como fragmentos de Okazaki

La forma 5’-3’ (azul) que sintetiza la cadena de forma continua es conocida como leading (hebra
continua), mientras que la que no la sintetiza de forma continua se conoce como lagging (hebra
retardada) y está formada por fragmentos de Okazaki

Experimento: hicieron crecer las E- colli en presencia de timidina

radiactiva para permitir la visualización de la nueva hebra de DNA. Se
pueden observar las horquillas de replicación.

Los fragmentos cortos son conocidos como fragmentos de Okazaki que

finalmente se acaban uniendo entre si

Las DNA polimerasas son incapaces de llevar a cabo la síntesis de DNA de novo sólo con dNTPs
(sin primer). Por ello se sintetiza un primer (3-10 nucleótidos) de RNA gracias a una RNA
polimerasa (primasa).

En el caso de la leading ocurre al principio y una vez (ya que la síntesis es continua) y en el caso
de de la hebra tardía (lagging) va a ocurrir cada vez que se forme un fragmento de Okazaki.

• Eucariotas: Tras esto obtenemos una molécula híbrida de

RNA y DNA. Entonces una RNAasa H (con actividad
exonucleasa), retira los primers en sentido 5’-3’, dejando un
hueco en las nuevas hebras (entre los fragmentos de
Okazaki conocido como espacio de Nick). Por último la
DNA polimerasa (delta) rellena los huecos con nucleótidos
de DNA y la ligasa une todos los segmentos. Como
resultado obtenemos la hebra de DNA.

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 • Bacterias: En este caso se lleva a cabo con una DNA polimerasa I (con actividad
exonucleasa) que va a ser capaz de retirar los primers y sintetizar DNA, enganchando
el 3’ del fragmento de Okazaki anterior. El hueco que queda entre los 2 fragmentos de
Okazaki se unen mediante una DNA ligasa.

Las células eucariotas usan 3 tipos diferentes de polimerasas durante la

replicación:

• Polimerasa Ɛ (exilon): responsable de síntesis de la leading

• Polimerasa δ (delta): responsable de la lagging y remplaza los
primers
• Polimerasa alfa: crea un complejo junto con una primasa. Sintetiza
pequeños fragmentos de RNA/DNA en la lagging y en el origen de
replicación

La polimerasa alfa no tiene actividad exonucleasa 3’-5’ por lo que no es capaz de detectar
errores en las cadenas de DNA recién sintetizadas y su síntesis es limitada

BACTERIAS EUCARIOTAS
Leading strand Es sintetizada por la Es sintetizada por la polimerasa
polimerasa III Ɛ
Lagging strand Primasa y después por la Pol a/Polimerasa: no tienen
polimerasa III que continua actividad 3’-5’ exonucleasa que
con la replicación les permitiría corregir errores.
Fragmentos iniciales.
Después su acción se continua
con la pol δ que realiza la copia
del DNA

Al contrario que la polimerasa alfa, las pol δ y pol ε sí presentan actividad exonucleasa 3’-5’ y
por tanto pueden corregir errores.

Las polimerasas no son suficientes para poder llevar acabo la replicación:

• Enganche deslizante (PCNA; sliding-clamp proteín PCNA): anillo que es capaz

de colocar la polimerasa en el sitio donde está el primer y mantener la
asociación de la polimerasa con el DNA de forma estable. Para cargar la PCN
necesitamos la RFC

• Proteína de enganche de carga (RFC; clanp-loading proteín RFC): sirve para

cargar el PCNA. Reconoce la unión entre el molde y el primer y recluta la
PCNA usando ATP.

La PCNA se va a unir la RFC (gracias al ATP) y va a llevar a la PCNA al sitio adecuado

donde está el primer. Abre el anillo y lo engancha al DNA gracias al ATP. Después se va a
libera el RCF (se necesita ATP). La PCNA va a atraer a la polimerasa.

El agujero de la PCNA tiene que ser más grande que el tamaño del DNA ya que este
tiene que pasar por ahí.

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Para poder llevar a cabo la replicación semiconservativa se tienen que separar las dos
hebras. Esto lo lleva a cabo una helicasa que es capaz de abirla mediante la ruptura de los
puentes de H. Va al frente de la horquilla de la replicación que va abriendo el DNA que
después se va copiando.

Cuando hay 2 oligos de diferentes tamaños, la helicasa se une a uno de los extremos y
gracias al consumo de ATP va a desplazar una cadena de la otra de tal manera que al final
las [Link] la energía en forma de ATP para abrir ambas hebras.

La DNA helicasas se encuentran formadas por un anillo hexamérico (por 6 proteínas) formado por 2
complejos (cada uno formado por 6 subunidades).

Una vez conseguido una hebra sencilla, esta es muy inestable

y tiende a formar estructuras secundarias que dificultan la
replicación. Existen proteínas que se unen a las cadenas
sencillas (SSB “single strand DNA binding proteins” en
procariotas y en eucariotas RPA), que interaccionan con el
esqueleto de azúcar y fosfato y estabilizan las estructuras
para que no se creen estructuras secundarias

Otro de los problemas de la replicación es que la helicasa (que abre el DNA) causa que al abrir el
DNA todo el DNA que esta por delante se retuerza (genere tensión). Esto se soluciona mediante las
topoisomerasas, que catalizan rupturas específicas e irreversibles en el DNA, de tal manera que el
DNA va a tener la capacidad de girar y liberar esa tensión.

Para ello las topoisomerasas dan un corte por

delante de la horquilla de replicación para permitir
el giro de la molécula y que pierdan la tensión

TIPOS DE TOPOISOMERASAS:

• Tipo I: que rompe una única hebra y no requiere ATP. Presenta una tirosina que va a atacar
al esqueleto de azúcar de tal manera que va a romper el enlace fosfodiéster, permite a la
molécula girar y liberar la tensión.

• Tipo II: rompe las dos hebras y requiere ATP. Se utiliza para desenroscar las
moléculas DNA para replicarlas, para la condensación de los cromosomas y
para la separación de las cromátidas hijas si se han enredado.

Genera una ruptura de doble cadena. Cada molécula (roja y naranja) es una
doble cadena. De tal manera que corta la cadena naranja en 2 agarrando
ambos extremos, separa la roja y vuelve a fusionar los extremos de la
naranja.

15
Inhibidores de la topoisomerasa bloquean el crecimiento y la producción de cell cancerígenas. Esto es
debido a que estos inhiben el paso de la unión de los trozos de la doble hebra de tal manera que los
trozos de la naranja quedan separados.

En el caso de las bacterias son conocidas como DNAgirasas y se utilizan como antibióticos.

Entre estos procesos tiene que haber coordinación:

Las helicasas van a ir abriendo las dos hebras y a medida que se

abre, la DNA polimerasa avanza y sintetiza la leading strand

Cada vez que se crea un fragmento de Okazaki se genera un giro al

que se unen las single strand DNA binding proteins (SSB) que
permiten estabilizar la hebra. El fragmento se sintetiza a partir de
la DNA polimerasa.

El sliding clamp loader va a abrir el PCNA para engancharlo en la lagging strand (hebra retardada). Una
vez sinetiado el fragmento de Okazaki, la PCNA se suelta del DNA.

SÍNTESIS DE NUCLEOSOMAS

El DNA se encuentra asociado a los nucleosomas. La replicación de los cromosomas implica la síntesis y
ensamblaje de los nucleosomas. Las células tienen la capacidad de desensamblar éstos de tal manera
que avanza la horquilla de replicación y permite la desestructuración de los nucleosomas dejando 600
pares de nucleótidos de DNA no nucleosomal libre.

Existen los tetrámeros H3-H4 que parten se desensamblan y parte no, mientras que las H2A-H2B se
desplazan.

Una vez replicado, la célula tiene que sintetizar y empaquetar

los nucleosomas para que el DNA que acaba de ser replicado
se empaquete

En este proceso existen unas proteínas llamadas chaperonas

de histonas que ayudan al ensamblaje del nucleosoma para
que las células puedan empaquetar el DNA.

La ratio de mutación es de 1·10^9. Cuando se comienza la replicación se pueden producir errores y si

estos no se corrigen se distribuirán a la siguiente generación. Para evitar esto, hay diferentes tipos de
mecanismos que evita la acumulación de mutaciones.

Se pueden dar errores que impiden la complementariedad de bases, lo que hace que se generen
errores, habiendo una base incorrecta por cada 10^2 bases correctas. Para evitar esto están las
polimerasas.

• Cuando se une el dNTP correcto se produce un cambio conformacional de la DNA

polimerasa que lleva a la incorporación del nucleótido. Esto hace que aumente la
fidelidad ya que solo reconoce al correcto.

• La polimerasa también tiene la capacidad de leer si hay algo que está mal y corregirlo
(proofreading) debido a su actividad exonucleasa. Si identifica que ha colocado un
dNTP incorrecto lo quita. En el caso de eucariotas está la exilon y la delta, mientras
que en bacterias pol 3.

16
 Esto lo lleva a cabo gracias a su capacidad exonucleasa 3’-5’. De tal manera que si se
equivoca colocando un nucleótido va hacia atrás en sentido 3’-5’ gracias a su actividad
exonucleasa y retira el nucleótido erróneo colocando el correcto.

Para disminuir aún más las mutaciones existen mecanismos de reparación del DNA
(estudiados más adelante).

2. ORIGENES DE REPLICACIÓN

BACTERIAS: presentan un genoma circular de tal manera que el origen se sitúan en un punto
específico (ori: secuencias de 245 pares de bases, bp) y que va a indicar a la célula el sitio donde
se va a comenzar la replicación. Para ello hay una proteína llamada initiator que reconoce la
zona y se une al origen de replicación.

Esto después va a generar que proteínas como las

helicasas se ensamblen y empiecen a desenrollar el
DNA. Además, se unen la single-strand DNA binding
proteins, SSB que finalmente permite replicar el DNA
circular.
Dura unos 30 min.

EUCARIOTAS: si las células humanas tuvieran un único origen como las bacterias, la replicación
tardaría 3 semanas. Por ello necesitamos otros mecanismos. La velocidad con la que se replica
un genoma de bacteria es mucho mayor que la velocidad de replicación de un único
cromosoma humano.

Además, si sólo hubiera un único origen, las horquillas de replicación tendría que viajar
muchísimo para replicar todo el cromosoma, lo que haría que hubiera una mayor cantidad de
errores generando mutaciones. Para evitar esto tenemos múltiples orígenes de replicación
consiguiendo que el genoma se replique en varias horas.

La distancia que hay entre orígenes varia (50-300

Kb) y en una cell humana hay en torno a 30000
orígenes de replicación.

Cuando se inicia la replicación los orígenes se

abren y comienzan la síntesis viajando en
extremos opuestos hasta que finalmente se
encuentran y completan la replicación de todo el
cromosoma

Existen regiones de más o menos 100 pares de bases que se denominan secuencia de
replicación autonómica (ARS- autonomously replicating sequences) y entre unas y otras hay 40
bases. Esto sirve a la célula para indicar el origen al que se une el complejo ORC.

Para comenzar la replicación:

• Se conocen las secuencias en el caso de eucariotas unicelulares y en estas existen

secuencias de 200 pares de bases repartidas.

17
 Experimeto: para identificar las ARS (identificación desecuencias de replicación) se
llevó a cabo un experimento en el cual las células (S. Cerevisae) que presentan el
plásmido (con el gen leu 2) eran capaces de crecer en un medio sin leucina, mientras
que el resto no.

Este plásmido no presentaba ninguna información de tal manera que cuando la célula
se divide, como el plásmido no tiene capacidad de dividirse, hay células que no
presentaban plásmido.

Hay veces en el cual el plásmido se copia, pero con poca frecuencia. Esto ocurre si se
integra en el genoma.

En el experimento, incorporaron en el plásmido fragmentos de DNA (del ARS) para ver

si se creaban colonias que crecían pq se estaba heredando el plásmido (con leucina).
De tal manera que vieron que este gen incorporado al plásmido era el ARS.
Esta secuencia tenía fragmentos que le indicaban a la célula que había un origen de
replicación.

Hay un complejo de replicación de los orígenes (ORC) que reconocen esta secuencia y se
ensambla. Con esto la célula consigue señalizar el origen de replicación.

Uno del os primeros pasos de la replicación son las helicasas (formado por
proteinass mcm que son 6 y que da lugar a la estructura de la helicasa que
presenta un agujero por donde va el DNA).

En eucariotas unicelulares:

• En la fase G1: cuando el origen ya es reconocido por el complejo ORC, hay 2 proteínas
llamadas factores de carga (CDT1 Y 6) que son capaces de reconocer las ORC, facilitando
que la MCM DNA helicasa se ensamblen y que se forme el complejo pre-replicativo.

18
 • Más adelante se produce el ensamblaje de otros
factores (cdc45 y sld3) que al final de la fase G1/
comienzo de la S y por fosforilación se produce la
activación de todo el complejo gracias a la CDK. Se
ensamblan más proteínas como el complejo de
proteínas GINS.

• Fase S: Finalmente se forma el replisoma (complejo

enzimático de todas las enzimas que interviene en la
replicación) al que se añaden el resto de polimerasas.
Se ensamblan las horquillas de replicación en la que la
helicasa va abriendo la hebra y las polimerasas que
permite la replicación de los cromosomas.

En eucariotas superiores no existe una secuencia específica y se asume que es la estructura de la

cromatina es la que indica a la célula que tiene que ensamblar el ORC en el origen. Sin embargo, el
mecanismo sigue siendo el mismo.

Además de entender cómo se lleva a cabo la replicación, la replicación de proteínas se utiliza como
biomarcadores para la detección de diferentes cánceres, como es el casp de la mmCm 5

3. REPLICACIÓN TELOMÉRICA

Los telómeros son los extremos de los cromosomas, siendo similares en eucariotas, que se
repiten entre 100-y 1000, contiene grupos de G en una hebra y tienen la característica de
terminar en un 3’-overhang.

La característica del telómero es este extremo 3’-overhang de cadena

única y sin complementario. En el caso de humanos está formado por
150-200 bases.

En los telómeros existe un problema, ya que cuando se acaba la

replicación en el extremo 5’ queda un primer de RNA. Esto tiene que desaparecer de tal
manera que la célula la elimina y queda un hueco.

Como las células no puede extender 5’-3’ ya que no hay un

3’ -OH disponible para que una polimerasa pueda
completarlo debido a que el RNA final se ha eliminado y no
puede ser reemplazado por la RNA polimerasa.

Para la replicación de los telómeros necesitamos la

telomerasa, que es una transcriptasa reversa, capaz de
convertir RNA en DNA. Esta telomerasa tiene su propio
molde de RNA que es complementario a las secuencias
repetitivas de los telómeros. Este es el caso de la
tetrahymena que presenta un molde de 259 nucleótidos
que incluye una secuencia (3’AACCCCAACC-5’) que es
complementaria con la secuencia telomérica.

19
 Cuando se crea el molde hay un extremo 3’ que permite
sintetizarlo y alargar el telómero.

Tras alargar el telómero tenemos que copiar la hebra

complementaria. Finalmente, el primer que hemos puesto
se va. De tal manera que el 3’-overhango no podemos
evitarlo.

La mayoría de células somáticas son incapaces de mantener la longitud de los telómeros de

forma indefinida. La vida de un cromosoma poco a poco va a ir acortando los telómeros,
incluso con el mecanismo de la telomerasa.

Este acortamiento va a llevar a 2 procesos: muerte celular o senescencia. Esto ocurre porque la
mayoría de células somáticas no tienen suficiente nivel de telomerasa.

Esto es algo positivo ya que es una forma de controlar la vida de las células para evitar que
estas se dividan de forma indefinida.

Alrededor de entre 100-200 nucleótidos es lo que se acorta cada vez que se divide un telómero.
Llega un momento en el que la longitud del telómero es tan pequeña que se activa un
mecanismo de respuesta del DNA dando lugar a la muerte celular o senescencia.

Si las célulasl no son capaces de parar se va a producir células genéticamente inestables que va
a generar cáncer.

Por ello es importante el equilibrio: un descenso de la actividad da lugar a síndromes de

envejecimiento prematuro (solo una de las copias del mode del RNA no es funcional para la
telomerasa.)

Hay mutaciones que resultan en una expresión incrementada del telomerasa lo que da lugar al
cáncer (debido a la gran actividad de la telomerasa)

4. REPARACIÓN DEL DNA

Todos los organismos para sobrevivir necesitan estabilidad genética que se consigue gracias a la
precisión de la replicación del DNA y gracias a que las células son capaces de reparar muchas
lesiones del DNA.

EL DNA es una molécula muy estable y compleja que va a sufrir cambios no esperados que dan
lugar a mutaciones. Estos daños pueden repercutir tanto en la replicación como en la
transcripción. Si no se reparar las mutaciones estas van a interferir con estos procesos y
estamos favoreciendo que se acumulen las mutaciones

Una célula tiene alrededor de 100000 lesiones por día, debido a que se le rompe una de las
hebras o bien por perdidas espontaneas de bases, además de otro tipos de daños.

Un incremento de las lesiones puede ser debido a la luz UV generando un gran daño al DNA.

Si hay daños en el DNA, va a haber daños en la información, dando lugar a mutaciones

puntuales

20
 • Sustituciones:

◼ Silenciosas: si se produce una sustitución silenciosa, cambia la información

de uno de los nucleótidos pero el aminoácido va a seguir siendo el mismo,
teniendo la misma información.
◼ Missens-conservativa: cambio en aminoácido (que era con carga +) que da
lugar a otro aminoácido cargado positivamente
◼ Missens-no conservativa: al cambiar uno de los nucleótidos se genera un aa
que tiene carga contraria al que se generaría si no hubiese mutado.
◼ Nonsense: provoca la parada en la lectura por un codón de parada. Se
genera una truncación que puede alterar la función de la proteína.

Este tipo de mutaciones pueden afectar a la funcionalidad de proteína. Un

ejemplo es la anemia falciforme, el cambio de un nucleótido provoca las
sustitución del glutamato por una valina, este genera unos eritrocitos con una
morfología anormal, los cuales no pueden ser funcionales.

• Inserción: se inserta un nucleótido de tal manera que los aminoácods cambian o se puede
generar un codón de parada debido a que se ha corrido el marco de lectura y se genera
una cadena polipeptídica diferente.

• Delecciones: quitar un nucleótido que va a cambiar el marco de lectura (frameshift).

La célula tiene que saber si hay algún problema. Si no hay ningún

problema se continua. Sin embargo, si existe un problema se va a parar el
ciclo celular para resolverlo. Si lo resuelve se continua, si no, es un
problema para el organismo de tal manera que sufre muerte celular o
senescencia.

Existen cambios en las secuencias conocidos como SNP (polimorfismos

de un solo nucleórido), que son alteraciones por cambios en un solo
nucleótido de la secuencia del genoma que se encuentran en más del 1%
de la población.

El DNA se puede dañar por lesiones endógenas, exposición a químicos del ambiente (como la radiación
UV) o la exposición de metabolitos producidos por la célula (formas reactivas del O2).

LESIONES ENDÓGENAS:

• Depurinación: hay una purina (como la guanina/adenina) en

la cual el enlace N-glucosídico se hidroliza y la purina (ya sea
guanina o adenina) se pierde creándose un sitio conocido
como AP que es apirimidinico/puridico, debido a la falta de
guanina.
Esto crea un problema en la información, debido a que en la
hebra en la que falta el nucleótido se genera un cambia en la lectura
(delección), mientras que en la otra hebra no pasaría nada.

21
 • Deaminación de citosinas: la citosina presenta un
grupo amino que al perderlo se convierte al
uracilo. Esto es problema ya que mientras que la C
complementa con la G, la U, no de tal manera que
al no ser complementario, en la replicación
semiconservativa la hebra donde se encuentra el
U genera una mutación.

Esto también se puede generar con la adenina (A) cuando pierde el grupo amino y se
convierte en una hipoxantina que es similar a la guanina. De tal manera que se
complementará con la citosina en vez de con la timina (que le correspondería a la adenina)

DAÑOS POR LA EXPOSICIÓN A QUÍMICOS

• Radiación uv: induce la formación de un enlace covalente entre bases

pirimidínicas que están al lado produciéndose un anillo de ciclobutano
entre 2 timinas dando lugar a un dímero de timina, generando un
problema que distorsiona la secuencia del DNA.

• Alquilación (adición de grupos etilos o metilos): un

ejemplo es la introducción de un grupo metilo en la
guanina, lo que hace que mientras que la G
complementa con la citosina, con el metilo lo hace con
una timina, lo que genera un cambio en la hebra donde
está el metilo.

• Daños químicos carcinogénicos: el humo del tabaco presenta diferentes compuestos

químicos que alteran el DNA. Un benzopireno se puede unir a la base N generando un
grupo más voluminoso que interrumpe la complementariedad y distorsiona la doble hélice.
Esto genera el 90% de los cánceres de pulmón.

El DNA va a estar expuesto a todos estos cambios, acumulando las mutaciones. Por ello es esencial que
para la supervivencia del organismo se mantenga la estabilidad genómica. Para ello hay 2 mecanismos:
que la replicación es muy fiable y la reparación del DNA.

Existen diferentes efectos asociados a la maquinaria de replicación que causa diferentes síndromes
debido a que estos errores no se pueden reparar:

• Síndrome de Bloom: ciertas DNA helicasas imp para la replicación están alteradas,
generando un problema en el crecimiento y una predisposición a sufrir canceres.
• Síndrome de Werners: envejecimiento acelerado debido a que las exonucleasas y las
helicasas se encuentran alteradas.

El DNA contiene su propio “back-up”, es decir una copia. Si se estropea una de las secuencias, siempre
va a tener la otra para poder repararla. La mayoría de los genomas son de doble cadena, lo que hace
que la copia se encuentre en la propia cadena (en la hebra no dañada)

22
FORMAS DE REPARACIÓN

• Reversión directa del daño: mecanismo eficiente capaz de reparar el daño en el DNA que
ocurren frecuentemente.

➢ Fotorreactivación (inversión directa): mecanismo que

no tienen los mamíferos con placenta. La irradiación
del sol puede generar un dímero de tiamina. Esto
genera una distorsión en el DNA que genera problemas
en la transcripción y replicación. Por ello se tiene que
reparar.

Este mecanismo, con luz, va a ser capaz de activar una

enzima especial (fotoliasa) que permite la ruptura del
dímero (del anillo).

➢ Reparación de la O6 metilguanina (alquilación): se repara mediante la

O6metilguanina metiltransferasa que es capaz de coger grupos metilos y
transparasarlos, eliminando el metilo de la guanina.

• Reparación por escisión: se saca la zona dañada. Mecanismos más importantes de

reparación

➢ Escisión de una base: en el caso por ejemplo de un uracilo:

- Se incorpora un uracilo en vez de una timina durante la síntesis de DNA.
- Deaminación de una citosina: el uracilo se incorpora cambiando una G
por una A (al ser la complementaria de la [Link] ello se tiene que quitar.
Para ello se elimina mediante las DNA glicosilasas que va a romper el
enlace N-glicosísido que va a generar un sitio AP (sin base N).

Las DNA glicosilasas son una familia de enzimas que son capaces de
reconocer las bases mal colocadas y quitarlas. Hay diferentes N-
glicosilasas para eliminar otros tipos de cambios: para la hipoxantina
(formada por la aminación de adenina), purinas con grupos alquilos o
bases dañadas por la oxidación de la radiación ionizante.

Para quitar el sitio AP hay 2 enzimas que van a quitar el esqueleto de

azúcar y fosfato , la AP endonucleasa corta en el sitio 5’ y la fosfodiésterasa
en el 3’. La DNA polimerasa se encarga de añadir el nucleórido correcto.
Finalmente la DNA ligasa une ambos fragmentos.

➢ Escisión de nucleótidos: ej: dímeros de timina.

23
 La célula va reconocer este daño e incorpora helicasas para abrir la doble
hebra del DNA. Un poco antes y después del daño va a cortar y sacar el
oligonucleótido dañado y lo va a reparar.

Este tipo de enfermedades se provocan debido a una alteración del DNA,

que generar una alteración de la proteína y por ello también en su función.

▪ XP (xeroderma pigmentosum): enfermedad genética que generar

una extrema sensibilidad a la luz UV y desarrolla diferentes tipos
de cánceres de piel.

Esto es debido a que se genera una mutación de un dímero de

timina. Para eliminarlo se reconocer el daño gracias a una
proteína (XPC) que reconoce la alteración en la
complementariedad de las bases.
Después viene una XPA y una RPA (capaz de unirse a la hebra
sencilla durante la replicación para evitar estructuras
secundarias). Después aparece un factor de tanscripción con
difernetes subunidades (complejo TFIIH). Dos de estas
subunidades son las xpb Y xpd.

Estas dos son helicasas que va a ser capaces de abrir una burbuja
del DNA (25 pares de bases). Después aparecer las endonucleasas
como la XPF y la ERCC1 que van a cortar el extremo 5’ y 3’,
permitiendo la retirada del nucleótido. Una vez eliminada la DNA
polimerasa y la DNA ligasa finalizan con la reparación

▪ Reparación asociada a la transcripción:

-Síndrome de Cockayne: problemas en el crecimiento (cabeza

pequeña), no son capaces de ganar gran peso… Sensibilidad a la
luz solar.
Esto es debido a que se generar dímeros de timina que impiden a
la RNA polimerasa realizar la transcripción. Para la reparación,
existe unas enzimas llamada CSB que reconoce a la RNA
polimerasa. Esta enzima recluta a una serie de proteínas
CSA,XPA…. Que abren la burbuja del DNA que permiten cortar
Enel extremo 5’ y 3’.

➢ Reparación no complementaria (mismatch repair): las células van a tener

que identificar la hebra vieja y la nueva. Durante la replicación la
polimerasa va a ser capaz de quitar los errores. Sin embargo, hay veces que
los errores se incorporan.

Este mecanismo escanea el DNA en busca del error. Para ello las células
tienen que reconocer la hebra mutada.

Para ello la hebra vieja tiene la adenina metilada. Una vez identificado el
problema, hay un complejo formado por ciertas proteínas (MutS,L,H). La S
identifica el problema, mientras que la H corta la hebra no metilada (la
nueva). Por ello necesita acceso a la hebra. La L y la S, junto con una
exonucleasa y helicasa provocan la escisión del DNA hasta llevarse la zona
que tiene un problema. Finalmente, la DNA ligasa lo une.

24
 Mientras que en bacterias se conocen MutS y Mut L, en eucariotas son
conocidas como MSH y MLH, ambas homologas a las de las bacterias. A
diferencia de las bacterias, las eucariotas no presentan un homólogo para
MutH

En el caso de las bacterias identifican la hebra vieja por metilación,

mientras que en eucariotas es por la presencia de hebras de cadena
sencilla. .

En el caso de eucariotas, la hebra nueva se identifica por la presencia de

roturas en el DNA. Como al final de la leadig hay una hebra sencilla va a ir
desde ese punto hasta donde está el problema, mientras que en los
fragmentos de Okazaki tb identifica el momento en el cual solo hay una
hebra y se va a comer la hebra replicada hasta donde esta el problema.

Estas proteínas son muy importantes y sus mutaciones causa un cáncer

colorrectal. Por ello es necesario la prevención (diagnóstico prenatal),
diagnóstico (detección temprana de las mutaciones) y tratamiento.

El objetivo de todo esto es impedir la presencia de mutaciones en las siguientes

mutaciones. Sin embargo, hay veces que estos mecanismos fallan, de tal manera
que la celula tiene que tener otra manera de repararlo aunque no sea lo ideal.

En el caso de la E. Colli, quita la polimerasa estándar y pone una especial (pol5) que
se induce cuando las células están expuestas a radiación UV. Esta polimerasa es
capaz de seguir saltando el dímero. Tras esto se recupera la normal que es capaz
de continuar y se lleva a cabo una escisión para recuperar el dímero.

Esto genera un problema, debido a que este tipo de polimerasas son poco fiables,
de tal manera que pueden incorporar ciertas mutaciones. No presentan actividad
proofreading para arreglar mutaciones que hayan incluido

En el caso de las eucariotas tb presentan polimerasas especializadas para llevar a cabo este salto.

- Reparación de las roturas de doble cadena: esto se puede producir de forma natural, por la
ionización de rayos X, o por químicos. Hay 2 formas de repararlos: necesitan acceder a un back-
up.

25
➢ Recombinación no homóloga (NHEJ): las células tienen que ser
capaces de pegar los 2 fragmentos. Este mecanismo
promueve la incorporación de errores. Se produce una
deleccion de bases alrededor del sitio donde se produce el
daño.

Cuando es defectuoso, las células si presentan la doble

cadena rota la tienen que solucionar. Esto genera que se
produzcan translocaciones y fusión de telómeros (desarrollo
de cánceres)

➢ Recombinación homóloga: a diferencia de la anterior, aquí se repara de una forma

precisa y no se incorporan daños. No solo son capaces de utilizar este mecanismo
para la reparación sino para la replicación.

Como necesitamos tener un back-up (copia de seguridad) del que sacar la

información, este se obtiene solo después de la replicación. Tras esta, las 2
cromátidas hermanas van a permanecer unidas y organizadas gracias a la cohesinas
(estructuras proteicas).

Tras la ruptura las células van a digerir (por

nucleasas con actividad 5’-3’) los extremos para que
queden un 3’-overhang. Este al ser muy reactivo van
a tender a buscar una zona complementaria. Esta
zona de hebra única es reconocida por proteínas
especiales (en bacterias RecAd y en eucariotas
Rad51) que van a formar filamentos alrededor del
3’-overhang promoviendo el intercambio de
información entre secuencias homólogas.

El filamento de proteínas es capaz de buscar la

complementaria del 3’-overhang (rojo),
reconocer la hebra complementaria de otra
cromátida hermana (naranja en el otro dibujo el
verde) y desplaza a la hebra de la cromátida que
no es complementaria.

La información para reparar la hebra rota

de DNA se va a sacar de la otra cromátida
hermada (naranja).

Tras sintetizar las hebras gracias a las

cromátidas hermas llega una DNA ligasa que
las une.
Tras esto se tienen que pegar un corte
debido a la unión (holiday junction) que se
genera entre cromátidas para dar finalmente
a 2 cromátidas.

26
Hay otra forma, en la que no se crea el holiday j. de tal manera que la hebra de arriba
se repara mientras que la otra sigue intacta.

Tras producirse el corte, la exonucleasas genera el 3’ overhang.

La hebra invadde la a cormátida herma, copiando la zona donde
estaba la rotura y vuelve a su posición.

Existe otra proteína llamada BRCA2, que interviene en el

reclutamiento del Rad 53 a los 3’ overhang. Cuando se produce
una mutación en el gen de BRCCA2 se produce un proble en la
reparación de la doble hebra, produciéndose una acumulación
de mutaciones, tanto en oncogenes como en genes supresosres
de tumores de tal manera que se genera canceres de pecho.

Por ello es importante identificar este tip ode mutación para la

prevención, diagnóstico y tratamiento

RESUMEN DE LOS
MECANISMOS DE
REPARACIÓN:

5. REPARACION DEL DNA EN LA VIDA

Las mutaciones suelen ser negativas para los individuos sin embargo pueden contribuir a la
evolución. Por ello tiene que haber un balance en el cual la reparación del DNA tiene que ser
adecuada para prevenir la incorporación de mutaciones. Sin embargo, sino no hay ningún error
en la reparación no permite la evolución.

27
 6. RECOMBINACIÓN DE HOMÓLOGOS

En determinados momentos de la mitosis se produce una ruptura en el DNA previa a

que llegue la horquilla de replicación generando una inestabilidad genómica.

Cuando se produce un corte (Nick), cuando la horquilla llega es incapaz de continuar.

Por ello la célulal tiene que tener un mecanismo para solucionarlo.

Para ello cortamos la hebra de arriba dejando en la de abajo el 3’-overhang. La hebra

complementaria a la del 3’-overhang salta arriba para permitir la copia y que
enganche con la que tenía anteriormente.
Tras esto la hebra que había saltado baja y continua.
Una vez que la leading incorpora la polimerasa cuando se abre los orígenes de
replicacion, sin embargo la lagging incorpora constantemente.

En la meiosis se genera un intercambio de información

entre cromosomas homólogos. Aquí nosotros provocamos
el corte para que se produzca el intercambio
(recombinación). Esto se lleva a avo en el caso de la S.
Cerevisiae gracias a la Spo11, que provoca la ruptura de la
doble hebra. Tras esto una nucleasa (Mre11) es capaz de
generar el 3’-overhang

Este ataca otra molécula de DNA que es capaz de copiarlo.

Se hace igual que en el caso de holiday junction.

Hay otros tipso de eventos:

• Reordenamientos de DNA: se produce intercambio de información para generar todas las

variedades de anticuerpos
• Amplificaciones: en determinados momentos se van a producir copias del gen para que se
produzca una mayor expresión o un incremento programado.

28
 TEMA 3: TRANSCRIPCIÓN

1. TIPOS FUNCIONALES DE RNA

La información es la misma, sin embargo, cambia la expresión de los genes y como se

lee.

Transcripción: paso de DNA a RNA primer paso en la

expresión génica y primer punto en el cual se encuentra
regulada. Mientras que el DNA es el soporte del material
genético, el RNA tiene otras funciones

Las RNA polimerasas tiene 2 propiedades fundamentales:

sintetizan en dirección 5’-3’ y son capaces de comenzar
la síntesis a partir de NTPs (en ausencia de primer, al
contrario que las DNA polimerasas).

La transcripción comienza en puntos específicos al comienzo de los genes. Una de las hebras va
actuar de molde (template). La cadena que no se copia es conocida como inactiva, mientras que
la de abajo (en dirección 3’-5’) es la que se compia y es conocida como DNA template strand.
Se copia en dirección 5-3 gracias a la polimerasa que va a abrir la hebra (entre 3-14 pbp)
generandsose una burbuja que permite copiar la hebra molde.

RNA POLIMERASAS:

• Síntesis en dirección 5’-3’ de NTPs.

• Usa una hebra de DNA como molde
• Empieza en puntos específicos
• No requiere primer
• Los RNAs son moléculas sencillas y van a adquirir una conformación tridimensional
característica de cada DNA.

Esto se produce por interacciones de pares de bases

convencionales o por interacciones no convencionales en
el que los mismos pares de bases son capaces de
interaccionar utilizando varios puntos y que permite
adquirir la conformación tridimensional características
de los RNA.

29
A medida que se avanza en el gen se van produciendo
moléculas de RNA mensajero (lo que sale en forma de
árbol)

RNA POLIMERASA:
• Procariotas: En el caso de las procariotas presenta 5 tipos de subunidades: 2 alfa, 1
beta, 1, beta’, 1 omega y 1 sigma. El núcleo de la RNA polimerasa (core) son las 2 alfa,
2 beta y omega.

Las subunidades grandes forman una especie de pinza que permite

agarrar el DNA para que se pueda leer. La subunidad sigma no forma
parte del núcleo y se encarga de encontrar el inicio de la transcripción
mediante el escaneo del DNA. Hay diferentes tipos de sigma que van a
encontrar diferentes tipos de inicio. Esta subunidad no se necesita para
la actividad catalítica de la polimerasa.

Para que las células encuentren el sitio correcto de iniciación se requieren

promotores; secuencia a la que la RNA polimerasa se une para comenzar la
transcripción. Para que sigma lo reconozca en los promotores tiene que haber algo.

Experimento: para saberlo cogieron 300 promotores y los leyeron. Vieron que
tanto en diferentes promotores, tanto la secuencia en la posición -35 como la
de la posición -10 eran muy parecidas. Por ello se establecieron secuencias
consenso

Estas secuencias son las que reconoce sigma para que se active la polimerasa y que
comience la transcripción.

Cuando sigma lleva a la polimerasa

hacia ese promotor, se produce la
unión en los sitios de -35 y -10
secuencias. En este momento el
DNA está en conformación cerrada
ya que no se ha abierto conoce.

Después de esta se genera una

burbuja (12-14 bp) que permite que
se lea y que se comience la
transcripción.

Una vez reconocido donde se tiene que comenzar a sintetizar, tras la unión de 10
nucleótidos, se expulsa sigma.

30
 Cuando comienza a sintetizar el RNA, éste
va saliendo. El hibrido de DNA se produce
entre 8 y 9 bases. La RNA polimerasa
finalmente termina.

Existen antibióticos específicos que bloquean la actividad de la RNA polimerasa. Estos

antibióticos tienen baja afinidad por la RNA polimerasa de mamíferos, sin embargo no
por la de bacterias (siendo esta lo suficientemente diferente para que la inactive) de
tal manera que afecta a bacterias que acaban muriendo y no a mamíferos.

• Eucariotas: hay 3 RNA polimerasas: la I, II y III. Necesitan otro tipos de proteína para
regular la transcripción. Además, en el caso de los eucariotas la transcripción ocurre
en la cromatina, lo que hace que esta estructura sea muy importante para regular la
expresión génica

Estas 3 polimerasas nucleares son complejos de enzimas formados por entre 12-17
subunidades, 9 conservadas entre ellas y 5 relacionadas con las RNA polimerasas de
bacterias.

• RNA polimerasa II: va a ser capaz de leer y producir los RNAm y también tiene un
papel muy importante en la transcripción de RNAs.

• RNA polimerasa III: va a transcribir RNA transferente y el ribosoma 5S

• RNApol I: transcribir ribosomas RNA ribosomal 28,18 ,5,8 S

Tanto la RNA polimerasa II como la III se encargan de transcribir RNAs citoplasmático y

nuclear.

2. MEDIACIÓN DE LA RNA POLIMERASA II EN LA TRANCRIPCIÓN.

Para la transcripción se necesitan factores generales para la transcripción, esenciales

para que funcione la polimerasa II.

Además, se necesitan factores específicos de genes, que van a inducir la expresión

individual de los genes y son responsables de la regulación. Alrededor del 10% del
genoma humano codifica para factores de transcripción.

Como en cualquier proceso biológico necesitamos una maquinaria que sea capaz de
leer el DNA. Por ello este DNA tiene que tener unas marcas que le indica donde tiene
que empezar la transcripción.

En el caso de las bacterias con los -10 y -35. También presentan una caja TATAA que
actúa como señal para comenzar como transcripción un poco después de este (25-30
nucleótidos). Otra señal es el BRE que esta 35 antes que la señal.

31
En el punto donde comienza la transcripción tenemos factores de iniciación y otros
elementos como DCE,MTE, DPE.. El conjunto de todo esto va a facilitar que los factores
de transcripción se unan y se replique la célula

FORMACION DEL COMPLEJO DE LA POLIMERASA II IN VITRO

En el caso de eucariotas tener polimerasa y DNA no es suficiente, sino que se necesita

de una maquinaria.

Para la formación de este complejo pre-replicativo se necesitan factores de

trasncripción específicos para la RNA polimerasa II (TFFII_). Hay de diferentes tipos (EJ:
TFIID, TFIIB….)

1) En el primer paso necesitamos un complejo

TFIID de proteínas que contiene diferentes
subunidades. Contiene una subunidad TBP y
otras asociadas a factores (TAFs) que contiene
entre 13-14 polipéptidos.

El TBP reconoce y se une a la TATAA y

asociado está el TAF. Estas subunidades TAFs se unen a las secuencias del factor de
iniciación, DCE, MTE y DPE.

2) Tras esto actúa un segundo factor de

transcripción, el TFIIB, que reconoce el TBP y
se une tanto a este como a la secuencia BRE.

3) Después actúa la TFIIF que va a atraer

también a la polimerasa II porque el TBP
actúa de puente para que se añada la
polimerasa y la F.

La combinación de la TBP, TFIIB y TFFIF

atrae a la polimerasa

32
4) Tras esto aparece el TFIIE y la H, que permite
formar el complejo entero. Una vez que entra la
H, ésta presenta 2 helicasas (XPB y XPD) que
van a desenrollar el DNA. Esto permite generar
una burbuja dentro de la polimerasa para que
sea capaz de transcribir la hebra molde.

Además en la 2H una de las subunidades es una

proteína quinasa que es capaz de fosforilar a
una cola que es el C terminal de la
polimerasa, CTD (aa repetidos en tándem).
Con esta fosforilación conseguimos la
liberación de la polimerasa que esta
asociada con el resto del complejo y que le permite
andar y transcribir la hebra.

Estos factores de transcripción van a estar envueltos por un complejo proteico llamado
mediator, que interacciona con los factores generales de transcripción y la RNA
polimerasa. Gracias a este mediator se estimula la transcripción basal (mínimo de
trancripción).

A diferencia de en procariotas, los eucariotas van a tener que lidiar con la

cromatina (empaquetado). Por ello la cola de CDT va a tener factores de
remodelación de la cromatina que van a desplazar de forma temporal a
los nucleosomas para que la RNA polimerasa no se encuentre con
tanto impedimento estérico.

En esta cola van a estar también las proteínas que van facilitando que la maquinaria
sea capaz de leer la cromatina y para procesar el RNAm que está saliendo de la
polimerasa.

La amanita phalloides contiene la alfa-amanitin que es capaz de bloquear la RNA

polimerasa II. Por ello si queremos matar de forma específica ciertas células las
dirigimos hacia estas de tal manera que se bloquea la RNA polimerasa II y se bloquea
la trnacripcion. Esto se hace gracias a anticuerpos específicos a las que se acoplan la
alfa-amanitin que va a las células concretamente

33
3. PROCESAMIENTO DEL RNA Y TURNOVER

3.1. PROCESAMIENTO DEL RNAm.

- Los procariotas tan pronto como se produce la transcripción, los ribosomas tienen acceso
directo al RNAm que se ha producido y se genera la traducción

- En eucariotas va a estar separado de forma espacial por la presencia del núcleo. Los RNAm se
van a producir en el núcleo y se van a transportar al citoplasma para la traducción.

El pre-RNAm (que se modifica fuera del núcleo) tiene que salir del núcleo. Para ello se va a
asociar con ribonucleoproteínas (mRNPs) que permiten el transporte hasta el citoplasma, para
el procesamiento que tiene q sufrir para la trascripción y también para su degradación.

Para modificar el mRNA se modifica el inicio, parte medial y final. La maquinaria de

modificación va a estar sentada en la cola y a medida que se va produciendo RNAm se va
procesando El dominio C-terminal de la polimerasa II (CDT) juega un papel muy importante en
la coordinación. Modificaciones:

◼ En el extremo 5’ se añade una caperuza

◼ Adición de una cola de poliA en el extremo 3’
◼ Splicing: eliminación de los intrones (no codificantes)

IMP: las RNA polimerasas I y III no presentan la cola de CDT y por ello sus transcritos no se
procesan de la misma forma que para la II

PROCESOS DE LA RNA POLIMERASA II

• Capping: en el extremo 5’ y tan pronto como el RNAm sale de la polimerasa se le une una
caperuza de guanosina trifosfato-GTP que se le va a añadir al extremo 5’ mediante un enlace 5’-
5’ al pre-RNAm.

A la guanosina se le van a añadir grupos metilos (a su N7) y a las ribosas (en el C2). De tal
manera la célula esta añadiendo el Cap que permite estabilizar el RNA (sin esta la vida media
del RNA seria menor) y también para alinear el mensajero en el ribosoma cuando empieza la
traducción.

Estass enzimas del capping se encuentran “sentadas” y tan pronto como se sintetiza el RNAm
se añade la caperuza. Son reclutadas por la CTD.

• Poliadenilación: el mensajero debe tener señales

que le indique a la maquinaria de la cel lqeu es lo
que tiene que hacer. Hay una secuencia de 10
nucleótidos que le indica a la cell que cerca tiene que
añadir la cola de poli A. Tras esta presenta otra señal
que es donde corta una endonucleasa.
Tras el corta el DNA, una poliApolimerasa añade A
para formar la cola de poli A. Esto permite dar
estabilidad al RNAm y para controlar la traducción del
mensajero.

Si lascolas de poliA alc comienzo del desaorrollo son muy cortas, los mensajerons no se
producen de tal manera que se genera una señal y entonces ya si se pueden añadir

• Splicing: eliminación de intrones.

34
Experimento de descubrimiento de factores de
splicing: construyeron un plásmido Enel que
colicaron un exón, un intron y otro exón, además del
promotor de un bacteriófago al que se puede unir la
RNA polimerasa. Existen endonucleasa que
reconocen los sitios para cortal elDNA. Por ello al
cortarlo se genera una molécula lineal. Esto es leído
por la RNA polimerasa que genera un pre-RNAm.

Vieron como al añadir extractos nucleares se

eliminaban los intrones.

Dentro de un intrón hay 3 zonas importantes: el sitio de splicing 5’, el del 3’

y el Branch point.

Inicialmente temeos el pre-RNAm que se corta en el 5’ SS. Después se va a

producir un lazo (loop) en el que el extremo 5’ del GU va a atacar a la A del
brach point.
Este lazo genera que un grupo OH de la A ataque al sitio del splincing 5’. Al
unirse esta la lariat se queda libre un 3’ del OH que permite eliminar el
intrón (lariat) y que se junten ambos exones.

Tras esto se ligan ambos exones y el lariat se va a linealizar y se degrada.

Los pre-RNAm comparten secuencias consenso para que la maquinaria de

splicing reconozca. Esta maquinaria es conocida como spliceosome que está formado
por proteínas y RNAs. En este caso presenta 5 tipos de RNAs pequeños (U1,2,4,5,6)
que contienen entre 50 hasta 200 nucleótidos. Estos RNAs se van a unir a las proteínas.

La U2 y U5 van a formar ellas solas, mientras que la 4 y6 van a formar parte de la

misma proteína

En el sitio 5’ splice side se une la partícula U1 (RNA + proteína). Quien se va a guiar a la

U1 a esa zona es la RNA ya que en su cola presenta una zona complementaria a la del
intrón.

En el caso del U2 reconoce por complementación al brach point. Tras esto se

incorporan la particular U4/6 y luego la 5, que permiten formar el lariat

La U1 la U4 se van ya que no son necesarias y pro ultimo el lariat se corta y es

degradado. Estas proteínas tienen capacidad catalítica aportada por el RNAm.

Además, estas partículas existen otras proteínas, SR, que marcan la zona de los exones
uniéndose a estos en secuencias específicas y permite que la partícula del U1 se
localice ahí. En el caso de la zona del a 3’ es similar pero además de la SR y la U
correspondiente (U2) se encuentra la U2AF.

35
Estas proteínas van a marcar donde se tiene que cortar tanto en la zona 3’ como en la
5’

La cola de la RNA polimerasa es importante ya que presenta la maquinaria de splicing y

según va saliendo el RNAm se eliminan los intrones

3.2. SPLICING ALTERNATIVO

La célula es capaz de combinar los exones de diferentes formas. Se

pueden eliminar algunos de los exones pero no alterar el orden de
éstos. Gracias a un único pre-mRNA y mediante a combinación de los
exones se pueden obtener muchas proteínas. Un gen humano gracias al
splicing va a dar lugar a 6 proteínas diferentes.

Esto se produce para dar especificidad a los tejidos, señales externas que dice que se
produzca una proteína o no. Esto se encuentra regulado en el desarrollo.

• Drosophila: el alternative splicing determina el sexo. Esto se lleva a cabo

mediate la prteina tra. La proteína U2AF reconoce la parte 3’ del exón
eliminándose el intrón y se incorpora un codón de parada (UAG). Esto hace
que la proteína no sea funcional debido a que esta truncada

En el caso de las hembras existe una

proteína que se une al RNA llamada SXL
y se expresa solo en las hembras (pq
está determinada por la presencia del
cormosoma X).

Esta proteína se una al 3’ splice-side y

bloquea la unión del U2AF al exón en el
cual se genera el codón de parada
(azul). De tal manera que el exón se
considera como un intrón y no se transcribe, permitiendo que esa proteína
(llamada tra), al no tener el exón con el codón de parada sea funcional.

• Proteína Dscam: proteína que se sitúa en la superficie celular y que está

implicada en la conexión de las neuronas. Presenta 4 exones con diferentes
alternativas. Con un solo RNAm hay una gran cantidad de combinaciones
posibles.

• Distrofina: une los f. de actina con las proteínas de membrana que

interacciona con la MEC. Cuando se generar defectos se generan
enfermedades como la distrofia muscular (proteína ausente) o el
Becker(proteína anormal). Ligado al cromosoma X.

Se genera una deleción de los exones 48 a 50 por un defecto en el splicing de

tal manera que cuando entra el exón 51 hay un codón de parada.

El conocimiento de esto dio lugar a una terapia. En este caso son

oligonucleótidos antisense (van a complementar). De tal manera que se van a
encontrar en el sitio de splicing y permite el paso del exón 47 a 52. Esto

36
 permite que al pasar el codón de parada se genere una proteína que es
parcialmente funcional.

3.2. EDICION DEL RNA

Las células tienen la capacidad de cambiar la información genética

a nivel del RNA debido a que van a cambiar una base y va a dar
lugar a un cambio final de la proteína. Esto ocurre con la
apolipoproteína B. Se genera una deaminacion, pasando la C a U.

En el caso del hígado (liver) no se evita el RNA mensajero de tal manera que la traducción llega
al final y de lugar a la apo-b100. Mientras que en el intestino se produce la deaminacion de C a
U generándose una UUA que es un codón de parada de tal manera que cuando se traduce la
proteína va a llegar a ese punto dando lugar a la Apo-b48.

3.3. DEGRADACION DEL RNAm

El equilibrio entre la síntesis y degradación va a dar el nivel del RNA que tiene las células.
Cuando las células quieren apagar la producción de una determinada proteína una de las
posibilidades es degradar su RNA.

En el caso de los lariat los intrones que se forman en el splicing son reconocidos, se linealizan y
se degradan. Estos se degradan en el núcleo gracias a enzimas específicas que reconocen las
uniones 2’-5’ que se forman en el Branch point.

Para que haya un balance entre la síntesis de degradación, la vida media de un RNAm es
diferente según el organismo.

En el caso de bacterias su vida es muy corta ya que al ser unicelular debe tener la capacidad de
adaptarse rápidamente. Mientras que en los mamíferos va de 30 a 20 horas. Este horario va a
depender del tipo de proteínas, siendo menor en el caso de proteínas reguladoras.

Mientras que hay otras proteínas como enzimas metábólicas o proteínas estructurales que se
necesitan siempre.

Las células le ponen las caperuzas a los mensajeros para evitar que se degrade. EN el extremo
3’ se puede producir el acortamiento de las colas de poliA gracias a una nucleasa que en el
extremo 3’ va a degradar en dirección 3’-5’ mientras que en el caso del extremo 5’ va en
dirección 5’-3’

4. TRANSCRIPCIÓN DE LA RNA POLMERASA I

Es capaz de transcribir el 28,5,8 y 18 S que se produce en un

único trascrito y es capaz de madurar dando lugar a cada
uno.
El promotor especifico presenta 150 pares de bases. A este
se unen fatores de transcripción (UBF y SL1). Esto recluta la
polimerasa I. Se forma el complejo de transcripción que
transcribe en un único precursor.

5. TRANSCRIPCION DE LA RNA POLIMERASA III

Trancribe los RNA de transferencia y el 5S. Además, la polimerasa III transcribe los sRNA
citoplasmáticos

37
• En el caso del 5S hay promotores en la que la señal esta después del inicio de la transcripción.
Inicial mente se localiza el TFIIIA que se une a las secuencias de los promotores. Después se une
la C, después la B y por último l polimerasa (no tiene cola).

• En el caso del RNAt: primero se une el factor de

transcripción C, luego el B y asi se recluta a la
polimerasa III. Estos RNAt se necesitan que sean
procesados (madure). Para ello las células van a
cortan en el extremo 5’ y 3’. Esto lo lleva a cabo
una ribozima RNAaseP (lo corta RNA, no una
proteína).

Para saber que en la ribozima lo que corta es el RNA y no la proteína, utilizamos proteasas y
nucleasas al igual que loque se hacía con el DNA y proteínas para saber quién era la que llevaba
la información.

Esta ribozima actúa en el 5’ mientras que en el 3’ actúa una RNA asa convencional

El RNAt teien que ser procesado. Para ello se añade en el sitio de unión del aa un CCA en el 3’.
Finalmente se modifican las bases en diferentes puntos del RNAt (ej: cambio de uridina por
pseudouridina).

La polimerasa III produce RNA tanto citoplasmático como

nuclear.
En este caso SNAP recluta al B y este a la polimerasa.

38
 TEMA 4: CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y LA EPIGENÉTICA

1. SECUENCIAS REGULADORAS

En el caso de eucariotas el DNA va a estar empaquetado (en cromatina) y por ello su acceso en
la transcripción está limitado. Esto afecta a la habilidad con la que los factores de transcripción
y la RNA polimerasa pueden acceder al molde de DNA para transcribir.

Las modificaciones que se puedan generar en la cromatina son importantes para la

transcripción y control de la expresión génica.

Existen elementos reguladores en posición cis conocidos

como cajas (cis-acting: boxes). A través de diferentes
estudios se estudió cual eran las zonas capaces de regular.
Vieron que además de zonas como la TATAA había otras
cajas como la CG o la CGAT. Estas cajas se localizan antes
del sitio de incio del a trancripción.

En zomas más alejadas de las secuencias de los

promotores existen secuencias reguladoras
llamadas enhancers (primero se identificaron en
eucariotas, pero luego tb se encontraron en
bacterias) que se encuentran miles de kilobases lejos del sitio de iniciación. Esto proviene de un
virus (SV40, en este caso con 72 bp). Si esto se pone delante de un
promotor permite a las células que aumenten la trascripción.

Cuando se le pone un enhancer conseguimos que toda la maquinaria

de la trascripción vaya a leer más veces ese gen y que esto se traduzca
en una mayor cantidad de esa proteína.
La actividad de este es espcífica para un cierto promotor y correspomde
a un gen.

La actividad es independiente de donde o en que orientación (forward: mirando hacia el punto de

transcripción o backward) se coloque el enhancer, de tal manera que siempre se consigue lo mismo,
aumentando de forma considerable la transcripción.

Esto se permite gracias al DNA looping de tal manera que al

ser el DNA flexible puede formar un ovillo y permitir que
diferentes partes se acerquen.

Gracias al DNA looping el enhancer es capaz de interaccionar

con proteínas. El anillo de cohesinas tiene un papel esencial en
la organización de la información genética de los cromosomas

Los enhancer son las señales que le dicen a la células que ahí
tienen que unirse proteínas esenciales para regular la
transcripción y a su vez estas están regulados por hormonas o
factores de crecimiento.

39
 EJ: expresión de la Ig con la cadena pesada. Dentro del enhanser hay 9 secuencias
diferentes que van a ser capaces de unirse a las proteínas reguladoras y la combinación
de esto va a dar lugar a una proteína o a otra.

DNA LOOPING

Permite organizar los cromosomas en dominios. Para

ello hay unas secuencias llamadas insulators que van a
dividir los cromosomas en dominios independientes de
tal manera que dentro del “barrio del cromsoma (TAD:
topoligically associating domains)” los enhancers van
a interaccionar con los promotores, pero solo con aquellos que están dentro del TAD (es menos
frecuente que interaccionen con otros promotores si estos están en diferentes dominios, pero
no imposible).

La marca que le dice a la célula donde empieza/termina

un TAD es conocido como insulator y se encuentra tanto
antes como después de TAD y se encuentran de este
entre 100-1000 Kb.

El insulator define la secuencia a la que se une una

proteína llamada CTCF, importante en la organización del
genoma en vertebrados (bolas en amarillo).

Tras esto se unen unas cohesinas que son capaces de

definir el TAD y además agarra el cromosoma para que
forme el loop. Hay cohesinas a lo largo de los
insulators.

Además está la TFIIIC y contribuye junto con las otras

dos a establecer los límites de los TAD y así se
determina que los factores de transcripción sean
capaces de interaccionar con la maquinaria de
factores (de la polimerasa etc…)

Esto es importante en la clínica. Existe una técnica conocida como 3C que indica los puntos de
interacción entre 2 sitios del genoma, habiendo una
mayor interacción en los puntos más oscuros. La
distribución de los genes en TADs (representados en
las pirámides) permite bloquear interacciones no
deseadas entre enhancers y promotores.

Interaccionan las zonas de unión de CTCF formando

los TADs y permitiendo que la expresión de los genes se de en un tejido y las de otros en otros.

Si se rompe la estructura y se quita las zonas de los

insulators que van a macar a los TADs en vez de varios
TADs tenemos un único TAD habiendo interacción
entre genes de un TAD y el enhancer de otro
produciéndose una expresión aberrante en el sitio no
adecuado.

40
 Estudios genómicos en los que se estudia la secuencia del genoma asociado a un fenotipo
/enfermedad (GWAS) han establecido que la mayoría de enfermades vienen producidos por
cambios en los genes que no producen proteínas (no codificantes), dando lugar a
enhanceropatías (porque está provocado por no regulación nen los enhancers)

Ej: betatalasemia (altera el gen de la globina), polidactilia (aparece un dedo más) y leucemias.

2. ACTIVADORES TRANCRIPCIONALES

Experimento de cómo se aislaron estos factores activadores de la transcripción:

1) Eelectrophoretic-mobility shift assay: si tenemos un

DNA que se marca con radiactividad y se corre en un
gel, éste migra a una determinada altura. Si se cogen
proteínas que creemos que se pueden unir a zonas
reguladoras del DNA y se corren, como esto tienen un
peso superior corren de forma más lenta de tal manera
que se genera una banda por la interacción del DNA-
proteína que queda más arriba debido al peso y otra
banda de DNA libre.

2) Inmunoprecipitación de cromatina: para detectar las

uniones se utiliza formaldehido (agente crosslinker) que
provoca uniones entre proteína-proteína o proteína-DNA.
Para identificar la proteina que actúa como activador de
trancripción desarrollamos anticuerpos con los factores de
trancripción de interés y los añadimos.
Estos anticuerpos se unirán a la proteina para la cual
es específica y que está unida al DNA y mediante
mediante PCR (si son secuencias que conocemos) o,
métodos de sencuenciacion masiva (si no lo
conocemos) podemos conocer todos los fragmentos de
DNA que están implicados en la interacción de
proteína.

3) Cromatografía de afinidad por el DNA:

Si conocemos la zona del DNA que es importante para la unión que permiten aislar
proteínas, las cajas CG se unen a unas bolas de agarosa y se forma una columna
de cromatografía. Cogemos una mezcla de proteínas (que buscamos como factores
de transcripción) y la pasamos por la columna. Si alguna proteína es capaz de
reconocer la columna de DNA (a las CG boxes) se quedara pegada a la columna
mientras las que no saldrán de la columna. De tal manera que tras un tampón
salino se produce la disociación de proteína-DNA y permite reconocer los factores
de transcripción

41
 Ej: la SP1 se une a una caja CG. Tras esto se utiliza sal alta que permite la
disociación y se aísla la proteína.

Los factores de la activación de la transcripción tienen 2 dominios: uno que se une a la secuencia
específica del DNA y otro que sirve para interaccionar con otras proteínas (con mediator o factores
generales de trascripción). Si estos factores son capaces de promover la transcripción se unirá con
proteínas que participan en la trascripción como el mediator.

Hay diferentes tipos de dominios que se unen al DNA :

• Dominios de dedos de cinc (zinc fingers): la conformación de factores

de transcripción forma una especie de dedos. Cys e His son capaces
de unirse a iones de zinc dando lugar a una conformación de dedos
de cinc que es capaz de unirse al DNA.
Ej: receptores de hormonas esteroideas que contienen estos
factores de cinc.

• Dominios hélice- vuelta-helice (hélix-turn-helix): 3 alfa hélices:

1,2 y 3. La 3 establece contacto con el DNA y la 1 y 2 lo
estabilizan. Están contenidos en proteínas que contienen
homeodominios y que controlan la expresión en el desarrollo
embrionario. 2 polipéptidos.

• Dominios de cremallera de leucina(leucine zipper): 2 polipéptidos que

son capaces de interaccionar entre ellos porque tienen entre 4-5
leucinas separadas ente si por 7 aminoácido (debido a que tienen que
estar todas seguidas en la vuelta de la hélice) y como son hidrofóbicas
van a ser capaces de interaccionar y que se formen estas estructuras.
En el otro extremo está el dominio de interacción con el DNA rico en
aminoácidos de Lys y Arg que son capaces de unirse al DNA.

• Dominios hélice-lazo-hélice (hélix-loop-helix): 1 polipéptido con una alfa hélice, un lazo y

otra alfa hélice. Son capaces de interaccionar entre ellas y de diferente forma de tal
manera que incrementa las posibilidades de dimerizar. Similar a la cremallera de leucina
pero como dímeros.

Ej: Myc y MAX. Si MAX interacciona con otra proteína llamada MAD es capaz de
disminuir la transcripción (represor). la transcripción mientras que con MYC lo
promueve (activador)

La interacción de la parte del dominio activo junto con la maquinaria de replicación (ya sea con
el mediator o la subunidad B o D) promueve la transcripción. Estos activadores son capaces de
actuar con coactivadores que son capaces de actuar con la estructura de la cromatina.

42
3. REPRESORES

Se encargan de bloquear la transcripción. Son capaces de unirse a

la secuencia de DNA específica bloqueando que el factor de
actividad transcripcional pueda reconocerla y unirse a esta.
Puede competir por la secuencia específica con activadores
bloqueando la maquinaria de transcripción.

4. REGULACION DE LA ELONGACION

La transcripción puede empezar y tan pronto como empieza puede pararse por la modulación
directa de la RNA polimerasa o por los efectos de la estructura de la cromatina (debido a los
nucleosomas).

Esto va a estar controlado por señales extracelulares que le digan a la célula los genes que
tienen que transcribir. Este control es fundamental en procesos como el desarrollo y la
diferenciación.

El factor de transcripción II H (TFIIH) (con muchas subunidades)

presentaba una quinasa que era capaz de fosforilar la CDT (con
secuencias repetidas) de la quinasa II. Esta fosforilación ocurre
en la serina 5, lo que permite reclutar factores de
procesamiento.

Tras la iniciación de la transcripción hay factores que regulan

de forma negativa la elongación. Uno de ellos es el NELF
(negative elongation factor) y el DSIF, y mientras estos estén unidos
a la polimerasa ésta es incapaz de continuar. La unión de estos
ocurre cuando se han sintetizado unos 50 nucleótidos.

Para que la elongación continue tiene que haber una señal positiva
que es el P-TEFb (positive transcription-elongation factor-b), una
quinasa capaz de fosforilar a elementos que están regulando
negativamente, el NELF al cual desplaza y el DSIF de tal manera que
se libera a la polimerasa del bloqueo.

Este factor positivo también es capaz de fosforilar de nuevo a la cola de la polimerasa II,
fosforilando otra serina que permite reclutar factores de elongación que permiten que
continue el proceso de la transcripción.

Esto es importante para la clínica:

El factor de transcripción c-MYC interacción y recluta a la quinasa (P-TEFb) que es

capaz de activar la elongación de tal manera que la señal que controla la elongación es
MYC. Este es un regulador de la proliferación de tal manera que si este está
desregulado, la proliferación tb lo está. PRESENTACIÓN. Esto hace que la proliferación
al estar descontrolada pueda generar un proceso tumoral

También es importante para una serie de patologías.

43
5. EPIGENÉTICA

HAMBRUNA HOLANDESA: en Holanda los trabajadores estaban sometidos a una hambruna.

Esto hizo que se convirtiera un efecto de epigenética ya que los efectos no solo los sufrieron
estos sino también los de la siguiente y de la siguiente generación. Esto es debido a que con la
hambruna había un problema en el factor de crecimiento de insulina II que se encontraba
elevado dando lugar al desarrollo de obesidad.

GUERRA DE SECESION: los hijos de las personas que había sufrido traumas durante esta guerra,
habían desarrollado problemas psicológicos por los traumas que habían vivido los padres.

Epigenoma: información que no viene en la secuencia de DNA si no que se añade. Esta

modulada por factores ambientales que afecta a diferentes generaciones a través de la línea
germinal

La transmisión de esto es posible debido a cambios en la cromatina producidos por la

modificación de histonas que son capaces de regular genes de eucariotas. Estas modificaciones
se transmitirán a células hijas.

Las colas N-terminal de las histonas son fundamentales en la epigenética. Esto es debido a que
tienen carga positiva y son capaces de interaccionar con el DNA. Son susceptibles de acetilación
llevada a cabo por enzimas modificadoras de las histonas, regulando su estructura. Esta
acetilación que produce una histona acetil transferasa (HAT), al añadir el grupo acetilo,
neutraliza la carga e impide que se lleve a cabo la unión del DNA a las histonas permitiendo que
se relaje la cromatina y que se produzca la transcripción.

Este proceso es reversible permitiendo que se quite este tipo de caperuza que permite
bloquear la carga gracias a una histona deacetilasa (HDAC), devolviendo la carga a las Lys lo que
hace que se forme la cromatina y se bloquea la transcripción

Estas dos no funcionan solas sino que interaccionar con otras

proteínas. Las HAT son coactivadores de activadores
trancripcionales, mientras que la HDAC, correpresor de los
represores transcripcionales. En el caso del activador es capaz
dei interaccionar con factores generales de la transcripción
como TFIID.

Con estas modificaciones se consigue alterar las propiedades de la cromatina (condensada o

descondensada) y se consigue crear sitios de unión para otras proteínas que puede activar o
reprimir.

La acetilación es una de las más importantes, pero no la única, habiendo metilación (en lisinas
y argininas), fosforilación (en serinas) y se pueden añadir pequeños péptidos (ubiquitina).

Todo esto permite activar la cromatina. Estas enzimas están controladas por diferentes tipos de
señales.

Las señales no solo son para activar, sino que hay para inactivar como la
metilación (de lisina en la histona 4, provocando la represión y
condensación de la cromatina y crea un sitio de unión para otras
proteínas que van a ser capaces de reprimir la transcripción).

Los promotores y enhancer tienen que estar libres de nucleosomas. En

el caso del promotor permite que acceda toda la maquinaria de
transcripción y en el caso de los enhancers que los factores de
transcripción también tengan esta posibilidad.

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Los sitios de modificación al no tener nucleosomas son hipersensibles a DNAasas. En el caso de
los promotores las histonas tienen una modificación en la que se incorporan 3 grupos metilos
que bloquean la carga positiva de la lisina 4 en la H3, mientras que en los enhancers ocurre con
un único grupo metilo que se añade a la lisina 4 en la H3. De esta forman la célula está
marcando el enhancer y el promotor.

FACTORES DE REMODELACIÓN DE LA CROMATINA

Utilizan energía en forma de ATP para funcionar. La hidrólisis de éste permite:

• Reposicionar los nucleosomas: permitiendo que las histonas (nucleosomas) se

muevan a lo largo del DNA para que la maquinaria de transcripción pueda acoplarse.
• Cambio en la conformación de los nucleosomas: afectando a la capacidad de
secuencias específicas del DNA para interaccionar con proteínas que regulan la
transcripción. Pueden hacer que las interacciones de las histonas con el DNA sean más
débiles o fuertes.
• Desorganizacion/eliminación de nucleosomas para dejarlo desnudo

Todo esto altera la interacción del DNA con las histonas alterando la estructura de los
nucleosomas y permite la accesibilidad de las secuencias específicas de DNA por parte de
los factores de transcripción.

Tanto los promotores como los enhancers no presentan

nucleosomas debido a que los factores de remodelación de la
cromatina los han retirado.

Cuando la secuencia de cormatina a la cual queremos eliminar

los nucleosomas es reconocida tras esto llega un activador
transcripcional que por su dominio activo se une al DNA e
interacciona con factores remodeladores de cromatina que
permiten apartar a los nucleosomas y que la maquinaria de
transcripción sea capaz de ensamblarse.

Tanto las enzimas modificadoras de histonas como los factores remodeladores de la

cromatina tienen un efecto en el inicio de la transcripción, pero también en la elongación.

Después de la iniciación de la elongación, la RNA polimerasa

necesitaba avanzar por la cromatina. Esto se pueden llevar a cabo
gracias a que la cola de la polimerasa II se fosforilaba (por la
quinasa de la H) y atraía a factores de remodelación de la
cromatina que permite desplazar a los nucleosomas por delante
de la maquinaria de la transcripción

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 Las modificaciones en las histonas se convierten en sitios de unión que
atraen a una nueva proteína que tiene la capacidad de introducir nuevas
modificaciones en las histonas de alrededor, permitiendo la metilación y
consiguiendo que toda la zona esté metilada. Esto se lleva a cabo gracias
a que las modificaciones en histonas pueden inducir modificaciones en
las histonas próximas.

Las células pueden heredar la información genética, que es la

depositada en la molécula de DNA, pero también pueden heredar
la información depositada en los nucleosomas.

La cromatina parental tiene una serie de modificaciones y se

distribuyen en los cromosomas. Las histonas se distribuyen entre
las cromátidas que se han copiado. Al igual que se copia el DNA ,
también se incorporan nuevos nucleosomas a la zona que le
corresponde y los nucleosomas vecinos (viejos, morados) van a
desatar la señal para introducir las modificaciones en los
nucleosomas nuevos (naranjas)

Pero, ¿pueden heredar la información depositada en los nucleosomas? Las señales que
tienen las histonas “viejas” van a servir para introducir las modificaciones en las nuevas
histonas recién sintetizadas tras la replicación. De esta forma se consigue que estas
modificaciones pasen a las células hijas.

Existe una modificación represora (la inf del gen que se está controlando no se va a
expresar). Esta modificación se da en la lisina 27 de la H3 (represora). Esta lisina cuando
esta metilada crea un sitio de unión que permite que una proteína sea capaz de unirse a
esa modificación y todos los nucleosomas de alrededor van a incorporar la señal
represora.

La modificación de histonas es un mecanismo hereditario epigenético en el que la

información no contenida en la molécula del DNA es heredada por las células hijas. De tal
manera que tenemos la información contenida en la propia molécula del DNA y la
información que tiene la modificación de la cromatina.

Estos mecanismos son muy importantes durante el desarrollo y la diferenciación en

organismos multicelulares. La introducción de cambios en la cromatina genera la
modificación de histonas que regula la expresión en los genes eucariotas. Esto a su vez se
transmite a células hijas durante la mitosis.

MODIFICACIÓN DEL DNA

La cromatina también está formada por DNA por ello podemos controlar modificación del DNA
para controlar la expresión.

• Metilación: La metilación del DNA se hace específicamente en una citosina a la cual se

añade un grupo metilo que se encuentra antes de una guanosina (CG). Se produce en
el C5 dando lugar a una 5-metilcitosina. Esta señal le indica a la célula que el gen no se
puede expresar (represión en la transcripción)

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 Si tenemos un DNA parental, durante la replicación no se puede
incorporar esta modificación si no que después en aquellos
sitios en la que la célula detecta una modificación de estas
características y cuando está unido por puentes de H, una
metilasa añade un grupo metilo a la nueva hebra.

Estas metilasas solo son capaces de reconocer estos puntos

si las bases están unidas por puentes de H. Por ello la
metilación no se puede llevar a cabo hasta que termine la
replicación.
Esto garantiza que después de la división celular, aquellos genes que estaban
reprimidos sigan así en las células hijas.

La metilación del DNA juega también un papel importante en un proceso denominado

genomic imprinting. La expresión de un gen particular depende de si este procede de
la madre o del padre.

EJ 1: El gen H19 esta metilado en el caso de los machos. De tal

manera que al estar metilado la copia del padre está apagada
mientras que la de la madre al no estar metilada, esta encendida.
Esta señal se mantiene durante todo el desarrollo embrionario y
somático. Este H19 codifica para un long nonconding RNA (IncRNA)
que controla la expresión de otros genes asociados al fenómeno de
genomic imprinting.

EJ 2:Las moléculas de non-coding RNA modulan la expresión. A

este le reconoce una proteína llamada PCR2 que va a ser capaz
de metilar a las colas de los nucleosomas que tiene alrededor.
La metilación de la lisina 27 es represora y apaga la expresión
de los genes.

EJ3: interviene en la inactivación del cromosoma X. En este caso el

reconocimiento de la zona que se tiene que inactivar se produce por una
proteína. A esta se une un non-coding RNA llamado Xist. Esta proteína a
su vez reconoce a la secuencia y trae consigo 3 tipos de proteínas. Una de
ellas es capaz de metilar (represora para para la expresión) además
de ser capaz de atraer a la DNMT (DNA metilasa que va a
metilar en los CG) y en otro brazo trae la histona deacetilasa
(HDAC) que va a ser capaz de quitarle los grupos acetilos de tal
manera que los nucleosomas se van a agarrar más al DNA y
van a reprimir la transcripción.

DIAPOSITIVA QUE QEUDO SIN EXPLICAR:

Es importante la expresión debido a que aumenta o disminuye, importante para el control de la

trancripcion y asociado con femonemos tumerogénicos.

Uno del os frenos que es capaz de bloquear el ciclo celular genera la metilacion del promotor como
mecanismo tumerogénico de tal manera que la proteína es incapaz de para el ciclo celular cuando si
debería de pararlo de tal mner que se produce un crecimiento descontrolado

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