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Protocolo de PCR: Reactivos y Etapas

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para amplificar segmentos de ADN. Requiere ADN molde, ADN polimerasa termoestable, cebadores, nucleótidos, iones divalentes y una solución tampón. El proceso implica ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación usando un termociclador. Se usa para detectar patógenos como Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium y Helicobacter pylori mediante marcadores específicos y controles positivos y negativos.

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Sammir Chapa chayan
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Protocolo de PCR: Reactivos y Etapas

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para amplificar segmentos de ADN. Requiere ADN molde, ADN polimerasa termoestable, cebadores, nucleótidos, iones divalentes y una solución tampón. El proceso implica ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación usando un termociclador. Se usa para detectar patógenos como Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium y Helicobacter pylori mediante marcadores específicos y controles positivos y negativos.

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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

REACTIVOS:
• ADN molde.
• ADN polimerasa (Taq). -> Enzima termoestable, extraído de una bacteria (G-, aerobia y heter.)
• Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers). -> se hibridan a la cadena molde para
iniciar la elongación.
• dNTP. (desoxirribonucleótidos) -> dATP ,dTTP, dCTP, dGTP, dUTP (solo para ARN).
• Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), (Mn2+) -> mayormente MgCl2 que es
cofactor de la ADN - polimerasa.
• Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la
ADN polimerasa.
• Termociclador -> realiza ciclos a To específicas.
EQUIPOS:
• Termociclador -> EFECTO PELTIER (Crea una gradiente de To invirtiendo la corriente
eléctrica).
• Cabina de flujo laminar.
• Micropipetas.
• Tips libres de nucleasas.
• Tubos estériles.
• Agua destilada libre de nucleasas. (Las nucleasas degradan el ADN)
Taq POLIMERASA Debe ser almacenada de -30o C a -10o C
PRINCIPALES ETAPAS DEL PCR:
- Desnaturalización: T de 94o por lo general, para poder romper los puentes de
hidrógeno de las BN y así separar la doble cadena de ADN.
- Hibridación: Los cebadores de hibridan en las cadenas. Y la To va depender del tipo
de cebador.
- Elongación: Por lo general a una T de 72o C taq polimerasa añade los dNTPs
conforme corresponda para generar los amplicones.
OTRAS ETAPAS:
- Desnaturalización Inicial: Se da a 94o – 96º debido a que la taq Polimerasa realiza
una amplificación específica. (ya que posee un anticuerpo acoplada a la enzima, la
cual se separa a esas To).
- Elongación Final: Etapa que sirve para terminar de amplificar todo aquello que no
se amplificó en la etapa de elongación.

- Conservación: Etapa final, ya no hay reacción y solo es para conservar las muestras
a T de 4o- 15o por lo general.
Efecto Plateau: No se generan amplicones ya que los reactivos llegaron a su límite.
PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN DE ADN:
Mycobacterium tuberculosis.
•Marcador ISS6110, IS ¾, (ARNr 16S)
•Procedimiento :
•M1: control negativo -> No contiene ADN, sirve para verificar si tus
reactivos están contaminados con fragmentos de ADN.
•M2:…………………….
•M3:…………………….
•M4:…………………….
•M5: control positivo -> Contiene ADN, sirve para verificar si los reactivos
funcionan correctamente.

El control positivo sale (-)


junto a las demás muestras,
eso significa que los
reactivos no funcionan bien.

El control positivo sale (-) menos las demás muestras, eso significa que el
control positivo no funcionó bien, o el ADN de este control se degradó.
Plasmodium -> PCR de tipo anidada (2 PCR consecutivas)
•Marcador: rPLU5+6 (gen para detectar género); rFAL1+2; rVIV 1+2 (gen para
detectar especies).
•Procedimiento:
•M1:control positivo
•M2: control negativo
•M3:…………………….
•M4:…………………….
•M5:……………………..
•M6:…………………….
•M7:……………………..
Helicobacter pylori
• Marcador: GlmM (gen glucosamin mutasa), UreA (gen ureasa A).
• Procedimiento:
• M1:control positivo
• M2: control negativo
• M3:…………………….
• M4:…………………….
• M5:……………………..

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