INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL

Nombre:

Boleta:
Semestre:
Grupo:
Carrera:
Sección:

Profesor de teoría:

Profesores de laboratorio:
 ÍNDICE

INDICACIONES GENERALES 1

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE ENSEÑANZA DE BIOQUÍMICA 3

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA

AMINO LIBRE POR EL MÉTODO DE SANGER 7

REACCIONES DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS 15

PRECIPITACIÓN, SEPARACIÓN Y PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS

24

CURVAS DE TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS (TITULACIONES

POTENCIOMÉTRICAS) 33

CINÉTICA ENZIMÁTICA 40

CURVA DE CALIBRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES 43

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD

DE REACCIÓN 45

EFECTO DEL PH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN 49

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN 53

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA

VELOCIDAD DE LA REACCIÓN 57

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA 62

REACCIONES DE CARBOHIDRATOS 68

OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO DE RATA Y SU

CARACTERIZACIÓN QUÍMICA 81

SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

87
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN LA YEMA DE HUEVO 93

REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO

DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL 98

REACCIONES ENZIMÁTICAS DE ÓXIDO-REDUCCIÓN 106

AISLAMIENTO DEL DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN

ESPECTROFOTÓMETRICA 118

HIDRÓLISIS DE RNA Y DNA E IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y

PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 126

AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO 131

 INDICACIONES GENERALES
El curso práctico de Bioquímica General está dividido en cuatro ciclos, cada uno de
ellos constituido por varias sesiones prácticas. Al inicio de cada ciclo estará a la
vista la programación y distribución de las prácticas, la cual deberá ser
rigurosamente respetada.

El trabajo en el laboratorio requiere la colaboración de profesores y alumnos. Es

indispensable comunicar al profesor responsable de la practica cualquier
irregularidad en el laboratorio (respecto al material, equipo, reactivos, horario,
asistencia, etc.) para que este a su vez comunique al coordinador de laboratorio.

Se recuerda que en cada sesión de laboratorio se deberá cubrir:

1. Pase de lista.

2. Distribución de material y equipo.

3. Desarrollo de la práctica.

4. Explicación de técnicas y fundamento de la misma.

5. Trabajo práctico, el cual deberá ser realizado en su totalidad por cada equipo de
alumnos, bajo la continua supervisión del profesor responsable.

6. Discusión y conclusión al finalizar la práctica.

7. Devolución del material (limpio) y el equipo utilizado.

1
2
 REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE ENSEÑANZA DE
BIOQUÍMICA

1. Para quedar inscrito en el curso de laboratorio, es requisito indispensable

aparecer en las listas del SAES. En el caso de los estudiantes que no puedan ser
inscritos por encontrarse en espera de dictamen de la comisión de escolaridad, se
requiere que presenten una copia de su solicitud de dictamen. Asimismo se
deberá entregar al momento en que lo reciban, una copia del dictamen emitido
por la comisión de escolaridad en donde se especifique que la UDA puede ser
inscrita en el semestre. En caso de que en el dictamen no se autorice la inscripción
al curso no se podrá acreditar la parte que ya se hubiera cursado del mismo,
teniendo que someterse el alumno a lo dictaminado por la comisión de
escolaridad.

2. El curso de Bioquímica General es teórico y práctico, por lo que se deberá cursar

durante todo el semestre el laboratorio de forma simultánea con el curso teórico.

3. En la primera semana del curso cada alumno deberá entregar una fotografía
tamaño infantil para su hoja de control de asistencia.

4. Los cursos de laboratorio son para que los alumnos adquieran práctica y habilidad
para desarrollar trabajo experimental; por lo tanto, la asistencia es obligatoria.

5. El alumno que falte a una sesión de laboratorio tendrá una calificación de cero en
la sesión correspondiente. En el caso de que el estudiante falte por problemas de
salud, deberá entregar el justificante medico a más tardar a los 8 días naturales
posteriores a la fecha de la sesión, y esta será justificada por el profesor
responsable de la práctica.

6. Las prácticas se iniciarán y se pasará lista a la hora indicada en los horarios, con
una tolerancia de 15 minutos a la entrada; no habrá retardos y se pondrá falta a
quien no llegue puntualmente. El alumno que no esté presente al momento del pase
de lista, deberá notificar su llegada al profesor responsable.

7. Todos los datos e información referente a las prácticas que se desarrollarán en

el curso están contenidas en el instructivo de laboratorio, por lo que el alumno
deberá traerlo a cada sesión de práctica.

8. Para el trabajo de laboratorio es indispensable traer bata, y por equipo: un lienzo

de franela, un marcador indeleble, papel higiénico, escobillón para tubos de ensaye,

3
detergente, cerillos, lápiz, regla, tijeras para papel, propipeta o bulbo, seis pares de
guantes y "masking-tape".

9. Los laboratorios son un lugar de trabajo, por lo que se recomienda guardar el

comportamiento adecuado.

10. Durante el desarrollo de la práctica, queda estrictamente prohibida la entrada de

personas ajenas al grupo.

11. Queda estrictamente prohibido sentarse en las mesas de trabajo. Por razones
de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer o beber dentro del
laboratorio.

12. El material de laboratorio roto, deteriorado o extraviado por los alumnos, deberá
reponerse, sin excusa, por el responsable directo o por el equipo de personas que
efectúen la práctica.

[Link] evaluación de cada práctica se hará tomando en cuenta el trabajo realizado

la sesión de laboratorio, la discusión de los resultados obtenidos, un informe
(descrito en el siguiente punto) y un examen de cada práctica efectuado en una sola
sesión al final del ciclo correspondiente. No se promediarán las evaluaciones
parciales si no se cumple con examen de ciclo y/o informe de práctica.

Ponderación de evaluación:
Rubro Valor en puntos
Examen de inicio 1.0
Bitácora 1.0
Trabajo 1.0
Discusión 1.0
Informe 1.0
Examen de ciclo 5.0

[Link] informe de las prácticas de laboratorio deberá realizarse por equipo, en un

formato similar al de los resúmenes que se solicitan para trabajos de congreso, en
hojas tamaño carta, en una o máximo dos cuartillas, a doble columna, que incluya
el nombre de la práctica, el grupo y el nombre de los integrantes del equipo como
encabezado, una breve introducción, el objetivo general de la práctica, una breve
descripción de la metodología, los resultados obtenidos y la discusión de los
mismos, conclusiones y referencias bibliográficas utilizadas.

4
15. Los informes se entregarán en la segunda sesión (una semana después)
posterior a la cual se terminó el trabajo práctico y al momento de pasar lista. Se
deberá entregar el original del reporte y en una copia de este, el profesor deberá
firmar de recibido dicho informe con la fecha correspondiente. De no ser entregada
en tiempo y forma este tendrá una calificación de “0” cero. Si NO entrega, se
consignara como (NE) no entregado, por lo tanto se tendrá una calificación de “0”
en la sesión correspondiente.

16. De acuerdo con el reglamento vigente, para aprobar el curso de laboratorio se

requiere haber asistido al 80% de las sesiones y obtener un promedio mínimo de
6.0 en las prácticas efectuadas. Para la evaluación final de la Unidad la parte
teórica tendrá un valor de 60% y la parte práctica un 40%, sin embargo, para
poder sumar estos valores es indispensable haber aprobado ambas partes, lo
que equivale a sacar 6.0 en ambos rubros.

17. Al final del curso, se extenderá una boleta como comprobante de la calificación
final obtenida.

18. El período de validez de su boleta de laboratorio es de 2 semestres siempre y

cuando su promedio en el laboratorio haya sido de 8.0, deberán presentar su boleta
de laboratorio al inicio del curso, tanto al profesor coordinador del grupo de
laboratorio como al profesor de teoría, para que se les haga la revalidación
correspondiente. Asimismo, en caso de que el alumno presente Examen a Título de
Suficiencia (ETS) por haber reprobado la parte teórica, deberá validar su aprobación
de laboratorio presentando su boleta el día del examen.

19.- En el caso de que el alumno obtenga un promedio menor de 8, deberá cursar

nuevamente el laboratorio.

5
6
 PRÁCTICA No 1
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO
ALFA AMINO LIBRE POR EL MÉTODO DE SANGER

INTRODUCCIÓN

La secuenciación de proteínas es el proceso práctico de determinar el orden de los

aminoácidos de una proteína, la secuencia es esencial para determinar la función
biológica de la proteína. En 1958 Sanger recibió el premio Nobel de química por sus
contribuciones al conocimiento de la estructura de las proteínas.

El reactivo 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) fue introducido por Frederick

Sanger, para determinar la secuencia de aminoácidos en las dos cadenas de la
insulina. El DNFB es un compuesto de color amarillo muy reactivo que en
condiciones ligeramente alcalinas reacciona con los grupos amino libres mediante
una sustitución nucleofílica aromática formando un péptido o proteína con grupo
amino N-terminal marcado con un grupo 2,4 dinitrofenilo (DNP).

Cuando un péptido o una proteína marcada con el reactivo de Sanger se hidroliza

con HCl 6N aplicando temperatura y presión, todos los enlaces peptídicos se
rompen, sin embargo, la unión entre el dinitrofenilo y el grupo amino permanece
estable, por lo tanto, el hidrolizado va a contener aminoácidos libres y los derivados
dinitrofenilo. Estos últimos pueden extraerse del hidrolizado con éter e identificarse
por medio de cromatografía en papel.

El DNFB, además de reaccionar con los grupos alfa-amino libres, reacciona con los
grupos imidazol, fenólicos y épsilon-amino, por lo que también se obtendrán los
DNP derivados de la histidina, tirosina y lisina. Estos derivados se separan
fácilmente al extraer con éter el hidrolizado, ya que los DNP-aminoácidos terminales
son no polares y quedan en la fase etérea, mientras que los aminoácidos que no
reaccionaron con el DNFB y los DNP derivados no terminales, son polares con
carga (DNP-Tyr, DNP-Lys y DNP-His) y quedan en la fase acuosa.

En general, la determinación del aminoácido N-terminal consiste en cuatro etapas:

1) Dinitrofenilación del aminoácido N-terminal de la proteína.

2) Eliminación del DNFB que no reaccionó.
3) Hidrólisis de la DNP-proteína.
4) Identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel.

7
Figura 1. Estructura de la hemoglobina. Tomado y adaptado de PDB DOI:
10.2210/pdb1BZ0/pdb

Figura 2. Reacción de Sanger.

8
9
OBJETIVO

Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la hemoglobina

mediante el método de Sanger.

MATERIAL

Propipeta Lápiz, regla y tijeras

Gradilla Papel estraza
Tubos con tapón de rosca Baño maría
Pipetas de 5 mL, 2 mL, 1 mL y 20 mL Autoclave
Pipetas pasteur con bulbo Placa de calentamiento
Vasos de precipitados de 100 mL Centrifuga
Papel pH Secadora
Papel Whatman Cámara de cromatografía
Capilares Frascos de desechos etéreos

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Hemoglobina humana Ácido cítrico 0.1 M

Bicarbonato de sodio al 4.2% Citrato de sodio 0.1 M
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) al Derivados dinitrofenilados de Val, Asp y
0.9% en alcohol etílico Phe
FeSO4 al 0.6% Acetona
Éter Amoniaco concentrado
HCl 3 N Éter saturado con sulfato ferroso
HCl 6 N

OBSERVACIONES

Antes de empezar la práctica lea con atención las dos notas siguientes:

I. Este experimento se va a desarrollar en dos sesiones de laboratorio, la primera

sesión incluye hasta la hidrólisis de la hemoglobina, en la segunda sesión se
efectuará la cromatografía en papel del hidrolizado obtenido.

II. El 1 fluoro-dinitrobenceno produce irritaciones muy serias en la piel, al medirlo

use una propipeta y no haga succión con la boca.

PROCEDIMIENTO

A. PREPARACIÓN DEL DERIVADO DINITROFENILADO DE LA

HEMOGLOBINA.

a) Pesar 30 mg de hemoglobina y colocar en un tubo con tapón de rosca,

adicionar 2,4 mL de bicarbonato de sodio al 4.2% y disolver la proteína.

10
b) Añadir 2 mL de la solución de DNFB al 1% (utilice una propipeta) y agitar
fuertemente la suspensión durante una hora, manteniendo el pH entre 8 y 9.
En caso necesario adicione bicarbonato de sodio al 4.2%. Verifique el pH con
papel indicador, si observa mucho precipitado es señal de que el pH está por
debajo del necesario.

c) Al terminar la dinitrofenilación, ajustar el pH abajo de 3 con aproximadamente

12 gotas de HCl 3N.

d) Realizar 4 extracciones de la suspensión en el tubo con 5 ml de éter saturado

con solución acuosa de FeSO4 en cada extracción agitando moderadamente.
Desechar los extractos etéreos en los recipientes designados para tal
efecto.

e) Colocar el tubo que contiene la proteína dinitrofenilada en baño maría y agitar

hasta evaporar los residuos de éter que pudieran haber quedado.

f) Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos. Eliminar el sobrenadante. (Este

paso puede ser omitido)

g) Añadir al tubo 5 mL de HCl 6 N. Marcar el tubo y calentar en autoclave durante

3 horas a 15 libras de presión. (Este paso se realiza extra clase).

h) Agregar al contenido del tubo 5 mL de H2O destilada.

i) Realizar 3 lavados con 5 mL de éter cada vez y colocar las fases etéreas en
un vaso de precipitado. Al finalizar, desechar la fase acuosa.

j) Calentar los extractos etéreos en una parrilla casi a sequedad, enfriar y

disolver el residuo en 0.5 mL de acetona o alcohol absoluto.

k) Realizar la cromatografía en papel del derivado dinitrofenilado de la

hemoglobina.

B. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DE LOS AMINOÁCIDOS DINITROFENILADOS

TIPO Y LA MUESTRA PROBLEMA.

a) Cortar una tira de papel Whatman No. 1 de 22 x 50 cm y trazar con lápiz, a lo

ancho del papel, tres líneas paralelas a 2.5, 6.0 y 8.0 cm en total a partir de
uno de los extremos. Doblar sobre la primera línea hacia el frente y la
segunda línea hacia atrás.

b) Sobre la línea de 8.0 cm (línea de aplicación) marcar con lápiz 5 puntos

equidistantes y un círculo de 5 mm de diámetro sobre cada punto.

11
c) Realizar las aplicaciones correspondientes secando entre cada una como se
explica a continuación:

• En los primeros 4 puntos colocar de 7 a 9 aplicaciones de los derivados

dinitrofenilados de los aminoácidos tipo: DNP-Phe, DNP- Asp, DNP-Val y
DNFB respectivamente (los aminoácidos dinitrofenilados pueden variar
dependiendo de la disponibilidad).

• En el 5 punto colocar de 40 a 50 aplicaciones de la muestra problema

• NOTA: Evite la contaminación de los capilares

d) Colocar el cromatograma en una cámara previamente saturada con el

solvente de ácido cítrico y citrato de sodio 0.1 M a pH de 6.4 y dejarlo saturar
mínimo 2 horas.

e) Desarrollar en forma descendente con el mismo solvente (ácido cítrico-citrato

de sodio) por un tiempo de 4.5 a 5 horas, aproximadamente.

f) Sacar los cromatogramas de la cámara e inmediatamente marcar con lápiz

el frente del solvente y dejarlos secar.

g) Circunscribir el lugar donde se encuentran las manchas de los derivados

dinitrofenilados tipo, del DNFB y de la muestra problema. Para intensificar el
color amarillo de los derivados dinitrofenilados se puede someter la hoja a
vapores de amoníaco.

h) Medir las distancias correspondientes para calcular los valores de Rf.

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Interpretación de cada paso efectuado en la preparación del derivado
dinitrofenilado.
4. Esquema a escala 1:2 del cromatograma obtenido y su interpretación. Escribir
las condiciones del cromatograma.
5. Resultados de los valores de Rf obtenidos, en forma de tabla.
6. Discusión.
7. Conclusiones.
8. Bibliografía.
9. Preguntas extra.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1. Bicarbonato de sodio 4.2%.- Pesar 4.2 g de bicarbonato de sodio (anhidro) y

llevar a 100 mL con agua destilada.

2. Solución al 0.9% de fluorodinitrobenceno (DNFB).- En una campana de

12
extracción y con mucho cuidado, se adicionan 0.9 mL de fluorodinitrobenceno a
100 mL de etanol absoluto (usar propipeta).

3. Ácido clorhídrico 3 N.- Medir 249 mL de HCl concentrado (densidad 1.18 y

37% de pureza) y llevar a 1 litro con agua destilada en un matraz volumétrico.

4. Ácido clorhídrico 6 N.- Medir 498 mL de HCl concentrado (densidad 1.18 y

37% de pureza) y llevar a 1 litro con agua destilada en un matraz volumétrico.

5. Sulfato ferroso 0.6%.- Disolver 0.6 g de FeSO4 en 100 mL de agua.

6. Éter saturado con sulfato ferroso 0.6%.- Adicionar 1 mL de FeSO4 0.6% a 100
mL de éter. Agitar fuertemente.

7. Solvente de desarrollo ácido cítrico-citrato 0.1 M:

• Solución de ácido cítrico 0.1 M (monohidratado). - Pesar 21.014 g de ácido

cítrico y llevar a un litro con agua destilada en un matraz volumétrico.

• Solución de citrato de sodio 0.1 M (dihidratado). - Pesar 29.411 g de citrato

de sodio y llevar a un litro con agua destilada en un matraz volumétrico.

• Mezclar por cada 94 mL de citrato, 6 mL de ácido cítrico, o hasta que

tenga un pH de 6.4. Si es necesario se ajusta con NaOH o HCl 0.1 N.

8) Soluciones tipo de aminoácidos.- Disolver 2 mg de los derivados

dinitrofenilados de los aminoácidos tipo en un mililitro de alcohol absoluto y
conservar en refrigeración.

BIBLIOGRAFÍA

1. Carey, F. A., Giuliano, R. M., Álvarez Manzo, R., & Doria Serrano M. d. C.,
“Química orgánica”, 9a. ed., Ed. McGraw-Hill, México D.F., pp. 1050 – 1056.
(2014)

2. Conn E.E., Stumpf P.K., Bruening G., Doi R.H. “Bioquímica Fundamental”,
4a. ed., Editorial. Limusa Wiley, pp. 89- 90. (2004)

3. McKee T. y McKee J. R. “Bioquímica” La Base Molecular de la Vida. 5a ed.,

Ed. McGraw-Hill-Interamericana, pp. 150- 153. (2013).

4. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger. Principios de Bioquímica”, 3a. ed.,

Editorial Omega, pp. 138,141,142. (2000)

5. Sanger F., “The free amino groups of insulin”, Biochem J. 1945;39(5):507-15.

doi: 10.1042/bj0390507. PMID: 16747948; PMCID: PMC1258275.

6. Voet, D., Pratt, C. W., & Voet, J. G.,” Fundamentos de bioquímica: La vida a
nivel molecular”, 4a. ed., Ed. Panamericana, México, pp. 108. (2016)

13
NOTAS Y CÁLCULOS

14
 PRÁCTICA No 2
REACCIONES DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN.

Las proteínas son polímeros de alto peso molecular, compuestos por

aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos, que en soluciones acuosas
se comportan como coloides. Presentan propiedades químicas y físicas que
dependen directamente de factores intrínsecos del propio polímero, como son su
estructura y composición de aminoácidos, o bien de factores extrínsecos, como
pueden ser el pH, la temperatura, la presencia de sales, etc.

Existen varios métodos para la identificación y cuantificación de las proteínas,

pero la mayoría tiene como principio alguna reacción química característica de
los grupos R de los diferentes aminoácidos.

Puede decirse que las proteínas reflejan las propiedades químicas de los
residuos de aminoácidos que contienen, por lo que la mayoría de las reacciones
coloridas de identificación dependen de la existencia de un aminoácido
específico en ellas.

OBJETIVO

Identificar la presencia de aminoácidos con grupos R específicos que constituyen

a una proteína a través de reacciones coloridas.

MATERIAL

Gradilla Baño maría

Tubos de ensayo Agitador de vidrio
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Pinzas para tubo
Vaso de precipitados de 100 mL

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Hidróxido de sodio al 10% Ácido acético glacial

Acetato de plomo al 5% Reactivo de Biuret
Ninhidrina al 1% en butanol saturado con Gelatina al 5%
regulador de fosfatos 0.06 M, pH 7.4 Peptona al 5%
Ácido nítrico concentrado Tirosina al 1%
Hidróxido de amonio concentrado Triptófano al 1%
Oxido rojo de mercurio Fenilalanina al 1%
Nitrito de sodio Cisteína al 1%
Magnesio en polvo o en granallas Aspartame al 0.5%
Ácido oxálico (sol. saturada) Albúmina al 5%
15
1.- REACCIÓN DEL PLOMO PARA CISTEINA. -Es una reacción característica
para grupos sulfhídrilos.

Figura 1.- Reacción de plomo

PROCEDIMIENTO

a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se

adicionan 2 mL de NaOH al 10% y se calientan 1 minuto en baño maría.
Adicionar de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5% y calentar nuevamente hasta
ver la aparición de un precipitado negro.

b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla.

2. REACCIÓN DE LA NINHIDRINA.- Es una reacción característica para

grupos amino libres que se lleva a cabo a pH alcalino.

PROCEDIMIENTO

a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se

adicionan 5 gotas de la solución de ninhidrina en butanol. Observar a
temperatura ambiente la aparición de un color azul o violeta, que se debe a la
presencia de los grupos amino libres; si es necesario, los tubos en los que no
aparece el color, calentar en baño maría de 1 a 2 minutos.

b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla.

16
 3. REACCIÓN DE HOPKINS-COLE.-Esta reacción es característica del anillo
indol del triptófano, por ser éste el único aminoácido que contiene este grupo.

El reactivo contiene ácido glioxílico que se prepara por reducción del ácido
oxálico con magnesio en polvo o con amalgama de sodio. Numerosos aldehídos
pueden dar una reacción similar con triptófano. La naturaleza del compuesto
colorido formado no se conoce totalmente. Los cloratos, nitritos y cloruros
interfieren en la reacción.

PROCEDIMIENTO

a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se

adicionan 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole y se mezclan bien. Estratificar
cuidadosamente con 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, procurando que se
forme un límite bien definido entre ambos líquidos. La aparición de un anillo
violeta-rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia del triptófano.

b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones.

4. REACCIÓN DE MILLON.- El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos

y nitratos mercúricos en ácido nítrico concentrado. Debido a la presencia del
grupo fenólico se produce un compuesto de color rojo. El aminoácido tirosina da
positiva para esta prueba.

17
PROCEDIMIENTO

a) Adicionar a 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en

la tabla) de 2 a 5 gotas del reactivo de Millon y calentar en baño maría. La
aparición de un color rojo será una prueba positiva.

b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones

5. REACCIÓN XANTOPROTEICA.- Esta reacción es positiva tanto para

aminoácidos aromáticos activados como proteínas en solución, aunque es
mucho más sensible cuando éstas se encuentran perfectamente secas. Esta
reacción depende de la nitración de los anillos bencénicos activados
produciendo un color amarillo. La prueba resulta negativa para proteínas que no
contengan aminoácidos aromáticos activados.

Ciertos derivados del benceno, como el ácido pícrico, reaccionan formando el

nitro-derivado amarillo. Es positiva para tirosina y triptófano.

PROCEDIMIENTO

a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se

adicionan 1 ml de ácido nítrico concentrado, se calienta la mezcla y se enfría.
Estratificar cuidadosamente con 1 mL de hidróxido de amonio concentrado. La
aparición de un color amarillo o naranja en la interfase será prueba positiva.

b) Anotar en la tabla los resultados obtenidos.

6.- REACCIÓN DEL BIURET.- Esta es una prueba general para proteínas y
péptidos de cadena no menor de 3 unidades de aminoácidos. Esta reacción tiene
utilidad en seguir el proceso de una hidrólisis proteínica, ya que la reacción será
negativa cuando la hidrólisis sea completa.

18
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se
adicionan 2 mL de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas del reactivo del Biuret, mezclar
bien. La formación de un color violáceo o la precipitación de hidróxido cúprico será una
prueba positiva.
Si el color de la reacción del Biuret no se presenta inmediatamente, dejar reposar de 10
a 15 minutos.

b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones.

19
 Reacción para Reacción de la Reacción de Reacción de
Reacción Xantoproteíca Reacción de Biuret
grupos –SH Ninhidrina Hopkins-Cole Millón

Gelatina * * * * *
*
Peptona * * * * *
*
Albúmina * * * * *
*
Aspartame *
Tirosina * * * *

triptófano * * * *

Fenilalanina * * * * *
Cisteína *
Agua * * * * *
*
Interpretación

NOTA: Solo se realizarán para cada prueba las muestras marcadas con asterisco.

20
INFORME
1.- Introducción.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
4.- Fundamentos de las reacciones.
5.- Interpretación y conclusión de cada una de las reacciones.
6.- Discusión.
7.- Conclusiones generales.
8.- Bibliografía.
9.- Preguntas extra.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS
1.- Acetato de plomo al 5%.- Pesar 5 g de acetato de plomo y llevar a 100 mL
con agua destilada

2.- Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara añadiendo 60 g de óxido de

mercurio a una mezcla de 45 mL de HNO3 concentrado y 50 mL de H2O. Cuando
el óxido de mercurio se ha disuelto, se añaden 50 mL de una solución de nitrito
de sodio al 30%. El reactivo de Millon contiene nitritos y nitratos mercúricos.

3.- Reactivo de Hopkins-Cole.- Se prepara añadiendo 10 g de magnesio en polvo

en 20 mL de agua destilada. Agregar lentamente 250 mL de una solución fría y
saturada de ácido oxálico. La reacción se produce con gran rapidez,
desprendiendo tanto calor que debe enfriarse el matraz en la corriente de agua
mientras se añade el ácido. Cuando se ha terminado de añadir el ácido, agitar el
contenido y verterlo sobre un papel filtro para separar el oxalato de magnesio
insoluble. Se vierte un poco de agua sobre el filtro, se acidifica el filtrado con
ácido acético para evitar la precipitación parcial de magnesio al quedar largo
tiempo en reposo, y se lleva esta solución a un litro de agua destilada en un
matraz aforado. Esta solución contiene únicamente la sal magnésica del ácido
glioxílico.

4.- Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 mL con
agua destilada.

5.- Soluciones de aminoácidos al 1%.- Pesar 1g del aminoácido a preparar y

llevar a 100 mL con agua destilada. Si no se disuelve fácilmente, adicionar
algunas gotas de solución de NaOH o HCl para mejorar su solubilidad. Calentar
un poco si es necesario.

6.- Ninhidrina al 1% en etanol.- Pesar 1 g de ninhidrina y llevar a 100 mL con

etanol.

7.- Reactivo del Biuret.- Pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 mL con
agua destilada.

21
BIBLIOGRAFÍA

1. McKee T. y McKee J. R. “Bioquímica” La Base Molecular de la Vida. Ed.

McGraw-Hill- Interamericana, pp. 152- 154, (2003).

2. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger. Principios de Bioquímica” 3a. Ed. Omega.,
pp 113- 242, (2000)

3. Mertz E.T. “Bioquímica” Editorial Publicaciones Cultural, S.A. de C.V., pp 71-

85, 10ª Reimpresión (1992)

22
NOTAS Y CÁLCULOS

23
 PRÁCTICA No3
PRECIPITACIÓN, SEPARACIÓN Y PUNTO ISOELÉCTRICO DE
PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN

La solubilidad de la mayoría de las proteínas se debe a la interacción entre el

agua y los grupos ionizados en la superficie de las proteínas. Hay factores
fisicoquímicos extrínsecos e intrínsecos que afectan la solubilidad de estas
biomoléculas. Los factores extrínsecos son la fuerza iónica, el pH, la
temperatura y la constante dieléctrica del disolvente, mientras que los factores
intrínsecos están definidos principalmente por los aminoácidos presentes en la
superficie de la proteína. Si a una solución proteica heterogénea se le modifica
alguno de los factores extrínsecos, las proteínas que la constituyen se pueden
purificar gracias a su diferente solubilidad.

OBJETIVOS

Modificar algunos factores extrínsecos y analizar su efecto sobre la solubilidad

de las proteínas.

Determinar el punto isoeléctrico de la insulina, basándose en sus propiedades

de solubilidad a diferentes valores de pH.

MATERIAL

Gradilla Probeta de 100 mL

Tubos de ensayo Centrífuga
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Embudo de filtración
Jeringas para insulina Algodón
Vasos de precipitados de 100 mL Agitador de vidrio

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Reactivo del Biuret Solución saturada de sulfato de

Hidróxido de sodio al 40% amonio
Acetato de plomo al 5% Ácido clorhídrico 0.1 N
Cloruro de sodio al 5% Hidróxido de sodio 0.1 N
Cloruro de bario al 5% Insulina comercial
Nitrato de plata al 2% Ácido acético 0.2 M
Cloruro mercúrico al 5% Acetato de sodio 0.2 M
Regulador de acetatos 0.1 M, Etanol 96º
pH 4.7 Huevo (clara diluida 1:3)

24
I. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR PRECIPITACIÓN CON SALES
(SALTING OUT)

Las sales neutras con fuerzas iónicas muy altas disminuyen la solubilidad de las
proteínas, a este proceso se le conoce como precipitación salina o salting out.
Dicho proceso representa una competencia entre la proteína y los iones de la sal
por el agua. Al aumentar la concentración de sal, ésta desplaza al agua de
hidratación alrededor de los grupos cargados de la proteína y la transforma en
agua de hidratación alrededor de los iones cargados de la sal. Esto favorece la
formación de agregados proteínicos que se precipitan.

Figura 1. Esquema del proceso de precipitación por salting out.

PROCEDIMIENTO

a) Colocar en un tubo de ensayo 6 mL de solución fresca de clara de huevo

diluida 1:3 y agregar 6 mL de una solución saturada de sulfato de amonio. Agitar
vigorosamente

b) Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos o filtrar en una gasa

c) Guardar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 2 mL de agua

destilada y llevar a cabo la reacción de Biuret*.

d) Anotar los resultados en la tabla 1 (precipitado 1).

e) Tomar 1 mL del sobrenadante (de inciso c) o el filtrado y llevar a cabo la

25
reacción de Biuret*.

f) Anotar los resultados en la tabla 1 (sobrenadante 1).

g) Tomar el sobrenadante (de inciso c) o el filtrado y agregarle sulfato de amonio

sólido hasta saturación, agitando constantemente .

h) Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos o filtrar en una gasa.

i) Al precipitado y sobrenadante obtenidos en el inciso h realizarles nuevamente

la reacción del Biuret*.

j) Anotar los resultados en la tabla 1 (precipitado 2 y sobrenadante 2,

respectivamente).

*Procedimiento: A un mililitro de las soluciones problema, agregar dos mililitros

de NaOH al 40%** y de 3 a 5 gotas del reactivo de Biuret (CuSO 4 al 0.5%), y
mezclar bien.
** Generalmente se usa NaOH al 10%, pero en esta práctica se usará al 40%
debido a que el sulfato de amonio consume el álcali del reactivo y se forma
amoniaco.

TABLA 1. RESULTADOS DEL SALTING-OUT

Muestra Biuret Interpretación
Precipitado 1
Sobrenadante 1
Precipitado 2
Sobrenadante 2

II. PRECIPITACIÓN POR EFECTO DEL pH Y DE SOLVENTES

La mayoría de las proteínas presentan un mínimo de solubilidad a un pH

conocido como punto isoeléctrico (pI), que es el valor de pH en el cual la carga
neta de la proteína es cero y no migra en un campo eléctrico. Además la proteína
presenta su máxima viscosidad.

Figura 2. Efecto del pH sobre la

solubilidad de la proteína. pI: punto
isoléctrico.

26
Por otro lado, existen ciertas sustancias orgánicas como alcoholes, éteres y
cetonas que reducen la constante dieléctrica de las soluciones acuosas de
proteínas, disminuyendo así su afinidad por el solvente, lo cual hace a las
proteínas menos solubles.

Figura 3. Efecto de algunos disolventes sobre la solubilidad de la proteínas con

base en su constante dieléctrica.

PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la tabla 2

TABLA 2. PRECIPITACIÓN POR EFECTO DEL pH Y SOLVENTES

Tubo # 1 2 3 4

Clara de huevo filtrada y diluida 1:3 (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0

HCl 0.1 N (mL) 1.0 - - -

NaOH 0.1 N (mL) - 1.0 - -

Regulador de acetatos 0.1 M, pH 4.7 - - 1.0 -

(mL)

Agua (mL) - - - 1.0

Observaciones

Etanol 96º (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0

Observaciones

27
III. PRECIPITACIÓN POR METALES PESADOS

Las proteínas suelen precipitarse al añadir a sus soluciones sales de metales

pesados (sales de mercurio, plomo, etc.). Estos precipitados proteicos pueden
estar desnaturalizados, pero si la precipitación se lleva a cabo en condiciones
rigurosamente controladas, es posible obtener proteínas nativas en forma de
sales de metal pesado. Estas sales han sido muy útiles para el estudio
cristalográfico de las proteínas con rayos X

Figura 4. Efecto tóxico de los metales pesados. (Adaptado de Nowicka, 2022)

PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la tabla 3

TABLA 3. PRECIPITACIÓN POR METALES PESADOS

Tubo # 1 2 3 4 5 6

Clara de huevo filtrada y diluida 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1:3 (mL)
Cloruro mercúrico 5% (mL) 0.25 - - - - -

Nitrato de plata 2% (mL) - 0.25 - - - -

Acetato de plomo 5% (mL) - - 0.25 - - -

Cloruro de bario 5% (mL) - - - 0.25 - -

Cloruro de sodio 5% (mL) - - - - 0.25 -

Agua (mL) - - - - - 0.25

Observaciones

28
IV.- DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA INSULINA

El punto isoeléctrico de una proteína es el pH al cual la suma de la carga de

todos sus grupos ionizables (carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc.) es igual
a cero, por lo tanto la proteína presenta su menor solubilidad y su mayor
viscosidad.

PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de 5 tubos como se indica a en la tabla 4, haciendo las

mediciones de insulina con una jeringa

b) Anotar sus observaciones a los 5 y 10 minutos.

Importante: Calcular el pH a cada tubo e indicar cuál es el punto isoeléctrico

obtenido para la insulina. Nota: Recuerda utilizar la ecuación de Henderson-
Hasselbalch:
[𝐴− ]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
[𝐻𝐴]

TABLA 4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA INSULINA

Tubo # 1 2 3 4 5

Ácido acético 0.2 M (mL) 0.23 0.15 0.05 0.01 0.00

Acetato de sodio 0.2 M (mL) 0.02 0.10 0.20 0.24 0.25

Insulina 40 U/mL* 6U (0.06 6U 6U 6U 6U

mL) (0.06 (0.06 (0.06 (0.06
mL) mL) mL) mL)
pH

Observaciones a los 5 minutos

Observaciones a los 10
minutos

*Si la solución de insulina usada es de 80 U/mL, medir en la jeringa de aplicación

6 U (0.03 mL)

INFORME
1.- Introducción
2.- Objetivos
3.- Resultados obtenidos en forma de tabla para cada experimento
4.- Cálculos
5.- Discusión
6.- Conclusiones
7.- Bibliografía
8.- Preguntas extra

29
PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Reactivo de Biuret.- Pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 mL con

agua destilada.

2) Hidróxido de sodio (NaOH) al 40%.- Pesar 40 g de hidróxido de sodio y llevar

a 100 mL con agua destilada.

3) Acetato de plomo al 5%.- Pesar 5 g de acetato de plomo y llevar a 100 mL con

agua destilada.

4) Cloruro de sodio (NaCl) al 5%.- Pesar 5 g de cloruro de sodio y llevar a 100

mL con agua destilada.

5) Cloruro de bario (BaCl2) al 5%.- Pesar 5 g de cloruro de bario y llevar a 100

mL con agua destilada.

6) Nitrato de plata (AgNO3) al 2%.- Pesar 2 g de nitrato de plata y llevar a 100

mL con agua destilada.

7) Cloruro mercúrico (HgCl2) al 5%.- Pesar 5 g de cloruro mercúrico y llevar a

100 mL con agua destilada.

8) Solución fresca de clara de huevo.- Separar la clara de un huevo y diluir 1:3.

Filtrar la a través de gasa o algodón

9) Regulador de acetatos 0.1 M, pH 4.7.- Mezclar 1 litro de ácido acético 0.05 M

(2.88 mL de ácido acético glacial en 1 L de agua destilada), con 1 L de acetato
de sodio 0.05 M (6.8 g de acetato de sodio en 1 L de agua destilada). Verificar el
pH y ajustar si es necesario

10) Solución saturada de sulfato de amonio ((NH4) 2SO4).- Disolver sulfato de

amonio en agua destilada hasta saturación

11) Ácido clorhídrico (HCl) 0.1 M.- Medir 8.3 mL de HCl concentrado (37%) y
llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado

12) Ácido acético (CH3COOH) 0.2 M.- Medir 11.55 mL de ácido acético glacial y
llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado

13) Acetato de sodio 0.2 M.- Pesar 16.4 g de acetato de sodio anhidro o 27.2 g
de acetato de sodio trihidratado y llevar a un litro con agua destilada en un matraz
aforado

14) Solución comercial de insulina 40U/mL u 80U/mL- Mantener en refrigeración.

BIBLIOGRAFÍA

1. Clark, J. M., "Bioquímica Experimental"., Ed. Acribia, España (1966).

2. Daniels, L. J. y Neal A. L. "Laboratory Experiments in Biochemistry",

30
Academic Press Inc., N. Y., pp. 129-141 (1967).

3. Karp, G., "Biología Molecular"., Ed. McGraw-Hill, Inc., USA., (1987).

4. Lehninger, A. L., "Principles of Biochemistry", 2a. Ed. Worth Publishers, Inc.,

pp. 138-146 (1993).

5. Nowicka, B. Heavy metal–induced stress in eukaryotic algae—mechanisms

of heavy metal toxicity and tolerance with particular emphasis on oxidative
stress in exposed cells and the role of antioxidant response. Environ Sci Pollut
Res 29, 16860–16911 (2022). [Link]

31
NOTAS Y CÁLCULOS

32
 PRÁCTICA No 4
CURVAS DE TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS (TITULACIONES
POTENCIOMÉTRICAS)

INTRODUCCIÓN.

Según los conceptos de Brönsted y Lowry, un ácido es toda sustancia que puede
ceder protones, y una base es toda sustancia que puede aceptar protones.

La representación gráfica de la variación del pH de una solución por la adición

de diferentes volúmenes de solución valorante, se conoce como curva de
titulación.

Cuando se valora una solución de ácido fuerte (HCl) con una base fuerte (NaOH)
el valor de pH se mantiene casi constante hasta cerca del punto de equivalencia,
donde sube bruscamente hasta alcanzar un pH neutro; en el caso de un ácido
débil (ácido acético), al titularlo con una base fuerte (NaOH), la curva de titulación
muestra un cambio brusco al inicio y al final de la valoración, mientras que en la
parte media de la curva el pH casi no varía, por lo que en esta región se presenta
una buena capacidad amortiguadora de cambios de pH.

Una propiedad muy importante de los aminoácidos es su comportamiento como

electrolitos, propiedad que deriva del hecho de que poseen dos o más grupos
titulables.

Cuando se titula un aminoácido con HCl o NaOH se obtienen curvas de titulación

invertidas, debido a que el grupo amino en estado ionizado (-NH3+), se comporta
como ácido y el carboxilo en estado ionizado (-COO-) se comporta como base;
esto se comprueba al titular en presencia de formol el cual, al reaccionar con los
grupos amino, los convierte en grupos más ácidos, lo que origina una
modificación de la curva de titulación con NaOH.

OBJETIVO

Explicar el comportamiento de electrolitos débiles y fuertes, cuando éstos se

titulan con una base fuerte y comprobar el carácter anfotérico de los aminoácidos
y su estructura de ión dipolar, efectuando la titulación de los grupos amino por el
método de Sörensen.

MATERIAL

Potenciómetro Vasos de precipitados de 100 mL

Buretas Pipeta de 10 mL
Agitador magnético Pinza para bureta
Barrita magnética Pizeta

33
SOLUCIONES Y REACTIVOS

Ácido clorhídrico 0.1 N Formol neutro

Ácido acético 0.1 N Reguladores tipo de pH conocido
Hidróxido de sodio 0.1 N Fenolftaleína al 0.5 %
Glicina 0.1 N Biftalato de potasio desecado
Ácido glutámico (u otro aa) 0.1N

PROCEDIMIENTO

a) Poner en un vaso de precipitados de 100 mL una barrita magnética y 20 mL

de solución a titular (ácido acético, ácido clorhídrico, glicina, glicina con formol,
o ácido glutámico), medidos con exactitud usando una bureta, y colocarlo sobre
un agitador magnético cerca del potenciómetro. Introducir suavemente en el vaso
los electrodos del potenciómetro, cuidando no golpearlos contra el fondo o la
pared del vaso.

b) Llenar una bureta con la solución de NaOH o HCl, colocarla con la ayuda de
un soporte con pinza sobre el vaso, permitiendo libertad de movimiento a la llave
de la bureta y que la punta de ésta se encuentre exactamente sobre la boca del
vaso, sin que toque la pared.

c) Esperar, con el sistema ya preparado, las indicaciones de su profesor sobre

el manejo y ajuste del potenciómetro.

d) Medir el pH de la solución por titular antes y después de la adición de cada

una de las alícuotas de la solución titulante, hasta agregar el volumen total de
éste (20 mL).

e) Anotar en la siguiente tabla los valores de pH obtenidos para cada titulación.

34
TABLA 1. PROCEDIMIENTO DE TITULACIÓN POTENCIOMÉTRICA

Titular con 20 mL de Titular con 20 mL Titular con 20 mL

NaOH 0.1 N de HCl 0.1 N
de NaOH 0.1 N

Vol HCl 0.1 N Vol Acético Gly Gly Gly 0.1N Gly
Titulante 20 mL Titulante 0.1 N 20 0.1N 20 +formol 20 mL +formol
(mL) (mL) mL mL 2 mL 2 mL

pH pH pH pH pH pH

0 0

2 2

3 3

5 5

5 5

1 1

1 1

1 1

1 1

0.2 0.5

35
 0.3 0.5

**

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

**

** mostrar los resultados al profesor y añadir si es necesario el volumen

de titulante indicado por el profesor.

36
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Expresar los resultados obtenidos en la primera tabla en una misma
gráfica, en el eje las ordenadas se colocarán los valores de pH. En el eje
de las abscisas se representarán, a la izquierda las titulaciones hechas con
HCl y a la derecha, las titulaciones hechas con NaOH.
4. Indicar en las gráficas, dónde se encuentran los valores de pKa, el punto
de equivalencia y el pI.
5. Hacer una gráfica de la titulación del clorhidrato de ácido glutámico
poniendo en las ordenadas el pH y en las abscisas los mililitros de
hidróxido de sodio 0.1N. Marcar los valores de pKa, punto de equivalencia
y pI.
6. Reacción y fundamento de la titulación de un aminoácido con HCl o NaOH,
en presencia y ausencia de formol.
7. Discusión.
8. Conclusiones.
9. Bibliografía.
10. Preguntas extra.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Hidróxido de sodio 0.1 N.- Pesar 4 g de hidróxido de sodio y llevar a 1000

mL con agua destilada en un matraz aforado. (ajustar con biftalato de potasio
desecado, en solución 0.1 N).

2) Ácido clorhídrico 0.1 N.- Medir 8.3 ml de HCl concentrado (37 % de pureza)
y llevar a 1000 mL con agua destilada en un matraz aforado. (Ajustar con
NaOH ya valorado).

3) Ácido acético 0.1 N.- Medir 5.7 mL de ácido acético glacial y llevar a 1000
mL con agua destilada en un matraz aforado. (Ajustar con la solución de NaOH
ya valorada).

4) Glicina 0.1 N.- Pesar 7.5 g de glicina y llevar a 1000 mL con agua destilada
en un matraz aforado.

5) Formol neutro.- Adicionar a 30 mL de formol al 30%, 1 mL de la solución de

fenolftaleína y agregar NaOH 0.1 N hasta la aparición de un color rosa que
perdure un minuto. Calcular la cantidad de NaOH para neutralizar 1 litro.

6) Fenolftaleína al 0.5%.- Pesar 50 mg de fenolftaleína y disolver en 10 mL de

etanol 96º.

37
BIBLIOGRAFÍA

1. Conn, E,. Stumpf P. K.,Bruening, G., Doi, R.H.,”Bioquímica Fundamental”.

Ed. Limusa- S.A. de C.V. pp. 26- 36; 72- 73 (2004).

2. Rendina, G., "Técnicas de Bioquímica Aplicada". Ed. Interamericana. pp. 25-

26. (1974).

3. Boyer R., “Conceptos de Bioquímica” Editorial International Thomson

Editores. 1ª Ed. en Español pp. 78- 81 (2000)

4. Voet D., Voet J.G., “Biochemistry” Editorial John Wiley & Sons, Inc., 3a Ed.
pp 44- 48, 70- 71, (2004).

38
NOTAS Y CÁLCULOS

39
 PRÁCTICA No 5
CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones biológicas. Al igual que
otros catalizadores aumentan la velocidad a la que se alcanza el equilibrio, pero
no afectan el equilibrio final de la reacción. Facilitan la reacción proporcionando
una ruta con menor energía libre de activación para la transformación de sustrato
a producto que en la reacción no catalizada.

Las enzimas son altamente específicas y su actividad puede modificarse por

diferentes factores tales como temperatura, pH, concentración de enzima,
concentración de sustrato, inhibidores, etc.

La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad de las reacciones

catalizadas por enzimas y de las condiciones que las modifican, así como los
mecanismos de reacción.

Una de las enzimas más conocidas y más ampliamente estudiadas es la

sacarasa, -fructofuranosidasa o invertasa, que puede hidrolizar diferentes
sustratos, presentando una máxima actividad con la sacarosa.

La velocidad de la reacción de hidrólisis de la sacarosa puede medirse

observando el cambio de rotación óptica, o bien, valorando el poder reductor de
los productos formados en un tiempo definido.

OBJETIVO GENERAL

Analizar algunos factores que modifican la velocidad de la reacción catalizada

por la invertasa y caracterizar de esta manera a dicha enzima.

MATERIAL
Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 100 mL
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Cronómetro
Gradillas Baños maría a 37, 50, 75 y 92°C
Espectrofotómetro Baño de hielo
Celdas

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Sol. de glucosa 0.005 M-Fructosa 0.005 Regulador de citratos 0.2 M; pH 2.5,
M 3.5, 4.5, 5.0, 5.5, 6.5
Sacarosa 0.45 M Tartrato de sodio
Acetato de sodio 0.05 M 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 1%
Ácido acético 0.05 M Sol. de invertasa 10 μg/Ml [mL]
Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7 Regulador de fosfatos 0.2 M, a pH 7.5

40
 Ácido cítrico 0.2 M Citrato de sodio 0.2 M
Hidróxido de sodio 2 N

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LAS PRÁCTICAS DE CINÉTICA

ENZIMÁTICA

1.-PREPARACIÓN DE LOS TUBOS PROBLEMA

a) Etiquetar perfectamente los tubos como se indica en cada uno de los

parámetros a determinar.

b) Preparar la serie de tubos siguiendo las indicaciones del cuadro

correspondiente a cada experimento; adicionar cuidadosamente el sustrato, el
regulador y el agua.

c) Preincubar los tubos 5 minutos a la temperatura indicada en el cuadro.

d) Adicionar la enzima, agitar e incubar durante 5 minutos (medidos con

cronómetro). El tiempo de incubación se inicia al momento de adicionar la
enzima.

Hacer la adición de la enzima con exactitud y con intervalos de 30 segundos a

un minuto entre cada tubo. Limpiar la pipeta exteriormente antes de agregar la
solución enzimática.

e) Detener la reacción en el momento justo en que lleguen a término los 5

minutos de incubación, adicionando 1 mL de 3,5-DNS siguiendo el mismo orden
en que se adicionó la enzima. Sacar los tubos del baño de agua hirviendo y
pasarlos inmediatamente a un recipiente que contenga hielo.

f) Una vez reunida toda la serie de tubos, desarrollar color colocando los tubos
en un baño maría a 92°C durante 5 minutos contados a partir del momento en
que empiece la ebullición. Transcurrido este tiempo enfriar rápidamente los
tubos, sumergiéndolos en un baño con hielo.

g) Diluir cada tubo con 2 ml de agua destilada y mantenerlos en baño con hielo.

h) Leer todos los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm. Ajustando

previamente a cero con el tubo testigo.

2.-PREPARACIÓN DEL TUBO TESTIGO

a).-Etiquetar perfectamente un tubo como TESTIGO.

b).-Adicionar el sustrato, el regulador y el agua, siguiendo las indicaciones del

cuadro correspondiente.
41
c).-Preincubar e incubar el mismo tiempo y a la misma temperatura de los
problemas.

d).-Adicionar al tubo, sin sacar del baño, 0.5 mL de 3, 5-DNS y acto seguido,
adicionar la enzima y mezclar, evitando así la actividad enzimática.

e).-Reunir el tubo testigo con los tubos problema para desarrollar color como se
indica en el paso 1f.

f).-Usar este tubo para ajustar a cero el espectrofotómetro, a una longitud de

onda de 540 nm.

3.-CÁLCULO DE LA VELOCIDAD EN UNIDADES DE INVERTASA

Interpolar en la curva tipo los valores de absorbencia obtenidos en cada

experimento para conocer la cantidad correspondiente de micromoles de azúcar
reductor, y con este dato, calcular la actividad de la enzima en Unidades de
Invertasa o Unidades Internacionales (UI), considerando que: una unidad de
invertasa (UI) es la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un micromol de
sacarosa en un minuto.

Vo = actividad = moles sacarosa hidrolizados / min

La velocidad o actividad obtenida está dada en Unidades Internacionales o de

Invertasa (UI) en este caso.

42
 PRÁCTICA No 5.1
CURVA DE CALIBRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Una curva de calibración o curva tipo es la representación gráfica de valores de

absorbencia en función de concentraciones conocidas de un analito.
Este experimento tiene por objeto obtener una curva de calibración, mediante la
cual se puedan transformar las lecturas de absorbencia obtenidas en los
experimentos de cinética enzimática, en micromoles de azúcar reductor y así
obtener la actividad de la enzima invertasa en unidades Internacionales (UI).

PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:

NOTA: Antes de iniciar este experimento revise el procedimiento general

TABLA 1. CURVA TIPO DE AZÚCARES REDUCTORES

TUBO No. Problemas

T 1 2 3 4 5
Glucosa 0.005 M
Fructosa 0.005 M (mL) 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0
Sacarosa 0.2 M (mL)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Regulador de acetatos
0.05 M, pH 4.7 (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua (mL) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.2 0

3,5 DNS (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Desarrollo de color 5 minutos a 92º C (en baño maría)

Dilución Colocar en baño con hielo y diluir con 2 mL de agua destilada

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm.

Absorbencia

Azúcar reductor
(moles)/ 2.0 mL

43
 Figura 2. Reacción para identificar la formación de azúcares reductores

INFORME
1.- Introducción.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
4.- Cálculos.
5.- Gráfica de absorbencia contra concentración de azúcares reductores, en
moles/2.0 mL.
6.- Escriba la reacción química llevada a cabo, con fórmulas.
7.- Discusión.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografía.
10.-Preguntas extra.

44
 PRÁCTICA No 5.2
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA
VELOCIDAD DE REACCIÓN

INTRODUCCIÓN

La concentración de la enzima es, generalmente, la mayor diferencia significativa

entre las condiciones in vivo y los ensayos in vitro. Muchas enzimas
intracelulares están en concentraciones altas lo que puede generar interacciones
proteína-proteína que alteren su actividad enzimática alejándola de lo observado
en el laboratorio, tal es el caso de la fosfofructocinasa, una enzima clave de la
glicólisis. Sin embargo, despreciando este tipo de interacciones y bajo
condiciones controladas, se considera que dos moléculas de enzima actúan
independientemente en solución para transformar el doble de sustrato que una
sola molécula de enzima en un tiempo t. Por lo tanto, si la concentración de
sustrato se mantiene constante, la velocidad de reacción enzimática será de
primer orden con respecto a la concentración de la enzima, es decir, será
directamente proporcional a la concentración de enzima:
𝑉𝑜 = 𝑘[𝐸]

La gráfica típica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción enzimática

en función de la concentración de enzima, es una recta con pendiente positiva.

OBJETIVO.

Demostrar que la velocidad de la reacción enzimática es directamente

proporcional a la concentración de enzima.

PROCEDIMIENTO.

NOTA: Antes de iniciar este experimento revise el procedimiento general (pág.

42).

Preparar una serie de tubos de acuerdo con el siguiente cuadro:

45
TABLA 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA
VELOCIDAD DE REACCIÓN
TUBO No. Testigo Problemas

1 2 3 4 5
Sacarosa
0.2 M (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Regulador de acetatos 0.05 M

pH 4.7 (mL). 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua (mL) 0.5 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Preincubación 5 minutos a temperatura ambiente

Enzima 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

10 g/mL (mL)

Incubación. 5 minutos a temperatura ambiente

0.5 mL de
Inactivación. 3,5-DNS + 0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo
0.5 mL de
enzima
Desarrollo de color.
5 minutos a 92º C (en baño maría)

Dilución Enfriar en baño de helo y diluir con 2.0 mL de agua en cada tubo.

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm

Absorbencia

Azúcar reductor (moles)

Velocidad (unidades
internacionales)

Concentración de enzima
(g/2.0 mL)

46
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Resultados en forma de tabla.
4. Cálculos.
5. Gráfica de velocidad inicial en unidades de invertasa o unidades
internacionales (U.I.) contra concentración de enzima en microgramos/2.0
mL.
6. Escriba la reacción enzimática, con fórmulas.
7. Discusión.
8. Conclusiones.
9. Bibliografía.
10. Preguntas extra.
11. Calcule las concentraciones molares de sustratos y enzima para el tubo
5. Considere el peso molecular de la enzima E.C. [Link] extracelular de
270,000 Daltones.

47
NOTAS Y CÁLCULOS

48
 PRACTICA No 5.3
EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

INTRODUCCIÓN

Debido a que las proteínas contienen muchos grupos básicos y ácidos, la

actividad enzimática varia con los cambios de pH. Para muchas enzimas, la
gráfica de la velocidad contra el pH tiene una forma acampanada en la cual el
pH óptimo se encuentra a mitad y adquiere valores entre 6 y 9. Por lo anterior, a
valores de pH extremos las enzimas, en general, se desnaturalizan.

La forma acampanada del perfil gráfico de la

dependencia del pH en la actividad enzimática
resulta del hecho de que los residuos catalíticos con
grupos ionizables sean esenciales para la catálisis.
Es así como la sensibilidad al pH por parte de las
enzimas responde a los cambios en la ionización de
grupos catalíticos, a los cambios de ionización de
los grupos que participan directamente en la unión
al sustrato o de grupos que tienen influencia en la
conformación de la proteína. Como ejemplo de este
perfil, se muestra en la figura de la izquierda, la
influencia del pH sobre la actividad de dos enzimas: la quimiotripsina y una
hidrolasa lisosomal. La quimiotripsina, una serina proteasa pancreática,
evolucionó para funcionar en condiciones neutrales ligeramente básicas, por lo
que su pH óptimo se encuentra en valores alrededor de 8. Por otro lado, las
hidrolasas lisosomales se encuentran inactivas en el pH del citosol, que es
alrededor de 7, para poder limitar la actividad de las mismas al pH lisosomal que
es 4.8.

OBJETIVO

Analizar la importancia del pH del medio sobre la velocidad de una reacción

enzimática y su efecto sobre el carácter iónico de la enzima y del sustrato.

PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:

49
TABLA 3. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA INVERTASA

Tubo No. TESTIGO PROBLEMAS

1 2 3 4 5 6

Sacarosa 0.2 M (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH= 5 pH=3.0 pH= pH= pH= pH= pH=
Regulador de citratos 0.2M (mL) 4.0 4.5 5.0 6.5 7.5*

*Excepto pH de 7.5 que es 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Regulador de Fosfatos 0.2 M

Agua (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Preincubación 5 minutos a temperatura ambiente

Enzima 10 g/mL (mL) 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubación 5 minutos a temperatura ambiente

0.5 mL de
Inactivación 3,5-DNS + 0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo
0.5 mL
de enzima

Desarrollo de color 5 minutos a 92º C (en baño maría)

Dilución Colocar en baño con hielo y diluir con 2.0 mL de agua

destilada

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm

Absorbencia

Azúcar reductor (M)

Velocidad (unidades de invertasa)

pH

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Resultados en forma de tabla.
4. Cálculos.

50
5. Gráfica de velocidad inicial en unidades de invertasa o unidades
internacionales contra pH.
6. Indicar en la gráfica obtenida, el pH óptimo.
7. Discusión.
8. Conclusiones.
9. Bibliografía.
10. Preguntas extra.

51
NOTAS Y CÁLCULOS

52
 PRÁCTICA No 5.4
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE
REACCIÓN

INTRODUCCIÓN

Como en las reacciones químicas, la velocidad de una reacción catalizada por

una enzima aumenta al incrementarse la temperatura, hasta alcanzar una
temperatura crítica (que varía de enzima a enzima), denominada temperatura
“óptima”; sin embargo, después de esta temperatura la velocidad de la reacción
empieza a disminuir y a temperaturas más altas la enzima se inactiva por
completo, generalmente por desnaturalización.

El aumento de actividad enzimática a temperaturas moderadas está asociado

con un aumento en el número de colisiones efectivas entre la enzima y el
sustrato, ya que la temperatura proporciona la energía de activación suficiente
para que el sistema alcance el estado activado.

El parámetro usado más frecuentemente para describir el aumento de velocidad

con la temperatura es el Q10, el cual representa el número de veces que la
actividad enzimática se incrementa al aumentar 10º C la temperatura.

OBJETIVO.

Demostrar que las reacciones enzimáticas son afectadas por la temperatura y

calcular el valor de la energía de activación de la reacción catalizada por la
invertasa, así como el valor de Q10 para la misma reacción, a diferentes
intervalos.

PROCEDIMIENTO

NOTA: Para lograr el objetivo de esta práctica las temperaturas de

preincubación e incubación se deben mantener constantes durante el
experimento. Al agregar el 3,5-DNS, retirar inmediatamente el tubo de su
baño correspondiente y sumergirlo en hielo.

53
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.

TABLA 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD ENZIMÁTICA

TUBO Testigos Problemas

T1 T2 T3 T4 T5 T6 1 2 3 4 5 6

Sacarosa 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.2 M (mL)
Regulador de
acetatos 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.005 M,
pH 4.7 (mL)

Agua (mL) 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Preincubació 0 25 37 50 75 92 0 25 37 50 75 92
n (ºC)
5 min

Enzima 10 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
g/mL (mL) 5 5 5 5 5 5

Incubación 0 25 37 50 75 92 0 25 37 50 75 92
(ºC)
5 min

Inactivación 0.5 mL de 3,5-DNS + 0.25 mL de 0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo

enzima

Desarrollo de 5 minutos a 92ºC (en baño maría)

color

Dilución Enfriar en baño de hielo y diluir con 2.0 mL de agua en cada tubo

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm.

Absorbencia

Azúcar
reductor
( moles)

Velocidad
(unidades de
invertasa)

b) Terminado el experimento (una vez desarrollado el color), ajustar a cero el

espectrofotómetro con el testigo de 0ºC y leer la absorbencia del problema de
0°C. Ajustar a cero el espectrofotómetro con el testigo de la temperatura
siguiente y leer el problema correspondiente, y así sucesivamente.
54
c) Terminado el experimento (una vez desarrollado el color), ajustar a cero el
espectrofotómetro con el testigo de 25ºC y leer la absorbencia de los testigos
solamente. Notar la elevada absorbencia del testigo 6 con respecto a los demás
testigos. Explique a qué se debe esto.

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Resultados en forma de tabla.
4. Cálculos.
5. Gráfica de velocidad en unidades internacionales (velocidad inicial, v0),
contra la temperatura en grados centígrados. Indicar en la gráfica obtenida,
la temperatura óptima para la invertasa.
6. De acuerdo con la ecuación de Arrhenius

k = Ae-Ea/RT

Si se construye una gráfica colocando en las ordenadas el logaritmo natural de

la velocidad de la reacción y en las abscisas la inversa de la temperatura
absoluta, es posible calcular la energía de activación si se saca la pendiente de
la recta. (Para tener un mayor número de puntos, interpole en la gráfica de T
contra vo la temperatura de 5 en 5 grados hasta la temperatura óptima y
obtenga las velocidades correspondientes.)
7. Calcular la energía de activación del sistema invertasa-sacarosa, y el valor
de Q10 a varios intervalos.
8. Discusión.
9. Conclusiones.
10. Bibliografía.
11. Preguntas extra.

55
NOTAS Y CÁLCULOS

56
 PRÁCTICA No 5.5
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

INTRODUCCIÓN

La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima se conoce

como sustrato. El complejo enzima-sustrato tiene una relevancia en la acción de
las enzimas y es el inicio de los cálculos matemáticos que especifica el
comportamiento cinético de las reacciones catalizadas y también de las
particularidades teóricas de los mecanismos enzimáticos.
La reacción catalizada por una enzima es útil para introducir conceptos y
definiciones importantes. Se puede escribir una reacción enzimática sencilla de
la siguiente manera:

E + S ⇆ ES ⇆ E + P

Donde E (Enzima), S (Sustrato), (Complejo Enzima-Sustrato) y P (Producto).

Otra forma más real de representar la reacción enzimática es a través de

modelos bioinformáticos.

Enzima (cadenas laterales) + Sustrato (Esferas negras) Complejo

Imagen tomada y modificada de “Enzyme Structure” [Link]

Si la concentración de sustrato se aumenta y todas las demás condiciones

permanecen constantes, la velocidad aumenta hasta un máximo; incrementos
posteriores en la concentración del sustrato no producen efecto sobre la
velocidad de reacción.

A una concentración de sustrato baja la velocidad de la reacción es proporcional

a la concentración del sustrato, y la reacción, por tanto, es de primer orden. Sin
embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, deja de ser
proporcional a la concentración de sustrato, en esta zona el orden de reacción
es mixto. Con un aumento posterior de la concentración del sustrato, la velocidad
de la reacción llega a ser independiente de la concentración del sustrato y se
aproxima asintóticamente a una velocidad constante (Vmáx). En este intervalo
de concentración de sustrato la reacción es de orden cero y se dice que la enzima
se encuentra saturada con su sustrato.

57
Te recomendamos estos videos relacionados con enzimas, encontrarás
información interesante de las características de las enzimas, sustrato, sitio
activo, simulación de la formación del complejo y aparición de producto.

Cómo trabajan las enzimas.

RCSBProteinDataBank.
[Link]

Enzimas: Estructura,
Características y Funciones.
AcademiaVasquez.
[Link]

OBJETIVOS

Analizar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la

reacción enzimática.

Determinar la constante de Michaelis-Menten (Km) de forma gráfica por los

métodos de Michaelis- Menten y Lineweaver- Burk.

58
PROCEDIMIENTO.

Preparar una serie de tubos de acuerdo con el siguiente cuadro

TABLA 5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA

ACTIVIDAD DE LA INVERTASA
TUBO No. Testigo Problemas

1 2 3 4 5 6
Sacarosa
0.2 M (mL) 0.50 0.10 0.20 0.30 0.50 0.80 1.0

Regulador de acetatos 0.005 M,

pH 4.7 (mL) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

Agua (mL) 0.50 0.90 0.80 0.70 0.50 0.20 0

Preincubación 5 minutos a temperatura ambiente

Enzima 10 g/mL (mL) 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubación 5 minutos a temperatura ambiente

0.5 mL de
Inactivación 3,5- DNS + 0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo
0.5 mL de
enzima.

Desarrollo de color 5 minutos a 92ºC (en baño maría)

Dilución Colocar en baño con hielo y diluir con 2.0 mL de agua destilada en
cada tubo

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm.

Absorbencia

Azúcar reductor (moles)/2.0 mL

Velocidad (unidades de invertasa)

Concentración de sustrato
(moles/L = M)

59
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Resultados en forma de tabla.
4. Gráficas de velocidad en unidades de invertasa o internacionales contra
concentración de sustrato en moles/L.
5. Cálculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento gráfico de
Lineweaver-Burk.
6. Discusión.
7. Conclusiones.
8. Bibliografía.
9. Preguntas extra.

Información extra

Para ampliar tus conocimientos te presentamos la

siguiente página, es un simulador de cinética enzimática.
Podrás poner un experimento a prueba, incluso puedes
graficar tus datos obtenidos en laboratorio.
[Link]

60
NOTAS Y CÁLCULOS

61
 PRÁCTICA No 5.6
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Un inhibidor es una sustancia que interfiere la acción de una enzima y hace más
lenta una reacción. Se puede extraer mucha información de las reacciones
enzimáticas que se están llevando a cabo con la presencia de inhibidores. El
inihibidor se une al sitio activo de la enzima, reducen la compatibilidad del
sustrato y la enzima; esto conduce a la inhibición de la formación de complejos
enzima-sustrato, evitando la catálisis de reacciones y disminuyendo la cantidad
de producto producido por un reacción. Se puede decir que a medida que
aumenta la concentración de inhibidores enzimáticos, la tasa de actividad
enzimática disminuye y, por tanto, la cantidad de producto producido es
inversamente proporcional a la concentración de moléculas inhibidoras.

La mayoría de las enzimas pueden ser inhibidas por diversas sustancias

químicas. A partir del estudio de los inhibidores de las enzimas se ha obtenido
información valiosa acerca de la especificidad de las enzimas por sus sustratos
a partir de los grupos funcionales en el sitio activo y del mecanismo de la
actividad catalítica. Los inhibidores enzimáticos han sido también útiles para
dilucidar las rutas metabólicas en la célula.

La acción de las enzimas puede inhibirse de forma reversible o irreversible. La

inhibición irreversible implica la formación o la ruptura de enlaces covalentes en
la enzima. La inhibición reversible, alguna sustancia se une a la enzima y
posteriormente es liberada; se combinan en forma no covalente en la enzima
libre y/o al complejo enzima-sustrato disminuyendo la actividad catalítica de la
enzima.

Los inhibidores reversibles se dividen en: competitivos, no competitivos e

incompetitivos (acompetitivos).

Los inhibidores competitivos.- Estos inhibidores tienen una estructura química

similar a la del sustrato por lo cual pueden competir con el sustrato por unirse al
sitio activo, pero una vez unidos, no pueden ser transformados por la enzima.
Este tipo de inhibición puede ser revertida simplemente aumentando la
concentración del sustrato.

Inhibidores no competitivos.- Estos inhibidores se unen sólo a la enzima o al

complejo enzima-sustrato en un sitio diferente al sitio activo.
Inhibidores incompetitivos (acompetitivos).- Estos inhibidores se unen sólo al
complejo enzima-sustrato.

62
Reacción enzimática con inhibidores competitivo, no competitivo y acompetitivo. Imagen
modificada de Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of
Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

La mayoría de fármacos son inhibidores de enzimas, por lo que su investigación

es muy importante en las áreas de bioquímica y farmacología . Un inhibidor o
fármaco con carácter terapéutico debe tener especificidad (que no interfiera con
otras proteínas) y potencia (su constante de disociación, que indica la
concentración necesaria para inhibir). Una alta especificidad y potencia aseguran
que un medicamento tenga pocos efectos secundarios y baja toxicidad .

Te recomendamos estos videos relacionados con tipos de inhibidores y ejemplos

clásicos de cómo trabajan, el significado de Km, la elaboración de las gráficas
Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk.

Tipos de INHIBIDORES de las ENZIMAS

[Link]

CINÉTICA ENZIMATICA (ecuación de Michaelis

Km)
DR. CARLOS FUENTES.
[Link]

OBJETIVO

Determinar el tipo de inhibición producido por una sustancia (anilina) sobre la

actividad de la invertasa.

63
PROCEDIMIENTO

a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.

La solución de inhibidor (anilina 1.6 mM) será proporcionada por el profesor.

TABLA 6. INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

TUBO No. Testigo Problemas

1 2 3 4 5 6
Sacarosa
0.2 M (mL) 0.50 0.10 0.20 0.30 0.50 0.80 1.0

Inhibidor en Regulador de acetatos

0.005 M, pH 4.7 (mL) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

Agua (mL) 0.50 0.90 0.80 0.70 0.50 0.20 0

Preincubación 5 minutos a temperatura ambiente

Enzima 10 g/mL (mL) 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubación 5 minutos a temperatura ambiente

0.5 mL de
Inactivación 3,5- DNS + 0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo
0.5 mL de
enzima.

Desarrollo de color 5 minutos a 92ºC (en baño maría)

Dilución Colocar en baño con hielo y diluir con 2.0 mL de agua

destilada en cada tubo

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm.

Absorbencia

Azúcar reductor (moles)/2.0 mL

Velocidad (unidades de invertasa)

Concentración de sustrato
(moles/L = M)

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivo.
3. Resultados en forma de tabla.
4. Cálculos.
5. Gráficas de velocidad en unidades de invertasa contra concentración de
sustratos en presencia y ausencia del inhibidor.
6. Determinar gráficamente el valor de Km y el tipo de inhibición.
64
7. Discusión.
8. Conclusiones.
9. Bibliografía.
10. Preguntas extra.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Sacarosa 0.45 M.-Disolver 136.92 g de sacarosa y llevar a 1000 mL con agua

destilada.

2) Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7.- Mezclar 1 litro de ácido acético 0.05

M (2.88 mL de ácido acético glacial en 1000 mL de agua destilada), con 1 litro
de acetato de sodio 0.05 M (6.8 g de acetato de sodio en 1000 mL de agua
destilada), verificar el pH y ajustar si es necesario.

3) Reactivo de 3,5-dinitrosalicílico.- Disolver en caliente 5 g de ácido 3,5-

dinitrosalicílico en 100 mL de NaOH 2 N (8 g de NaOH en 100 mL de agua
destilada). Adicionar 150 gramos de tartrato de sodio a 250 mL de agua destilada
y calentar hasta disolución, mezclar las dos soluciones y ajustar el volumen final
a 500 mL con agua destilada.

4) Glucosa 0.005 M- Fructosa 0.005 M.- Pesar 0.9 g de glucosa y 0.9 g de

fructosa, mezclarlas y llevar a 1000 mL con agua destilada.

5) Solución de invertasa 10 g/ml.- Pesar 1 mg de invertasa y disolver en 100

mL de regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7

6) Regulador de citratos 0.2 M.- Pesar 58.8 g de citrato de sodio y llevar a 1000
mL con agua destilada. Pesar 42 g de ácido cítrico y llevar a 1000 mL con agua
destilada. Mezclar estas dos soluciones para obtener los reguladores de pH 2.5,
3.5, 4.5, 5.0, 5.5 y 6.5 (adicionar NaOH para ajustar el pH).

7) Regulador de fosfatos 0.2 M, pH 7.5.- Pesar 27.8 g NaH2PO4 y llevar a 1000

mL con agua destilada. Pesar 53.6 g de Na2HPO4.7H2O y llevar a 1000 mL con
agua destilada; mezclar 16.0 mL de solución A con 84 mL de solución B y ajustar
a 200 mL con agua destilada.

NOTA: Como alternativa se puede preparar la siguiente solución de citrato-

fosfato para utilizar la misma solución durante todo el experimento:

8) Solución reguladora de citratos-fosfatos (0.1 M).- Mezclar 18.15 mL de

solución de citratos 0.1 M y 81.85 mL de solución de fosfato disódico 2M para
obtener un pH=7.2 . Ajustar a pH= 2.5, 3.5, 4.5, 5.0, 5.5, 6.5 y 7.5.

9) Anilina 0.8 mM.- Pesar 0.0744 g de anilina y llevar a 1000 mL con regulador
de acetatos (pH 4.7). Agitar fuertemente para que se disuelva totalmente.

65
BIBLIOGRAFÍA

1. Segel, I. H., “Biochemical calculations” Second Edition. Ed. John Wiley and
Sons. pp. 208- 289 (1976)

2. Lehninger, A. L. "Principios de Bioquímica", 3a. ed., Ediciones Omega

S.A.,España, pp. 243- 292, (2000).

3. McKee, T., McKee J.R., “Bioquímica” 3a Edición, Ed. McGraw Hill-

Interamericana. pp. 161- 199 (2003)

4. Voet D., Voet J.G., “Biochemistry” Editorial John Wiley & Sons, Inc., 3a Ed. pp
465- 494, (2004).

Información extra

Si quieres saber más de los inicios de la cinética enzimática, te dejamos el

siguiente artículo de divulgación científica titulado “Los cuatro mosqueteros de
la cinética enzimática”.

[Link]
[Link]

66
NOTAS Y CÁLCULOS

67
 PRÁCTICA No 6
REACCIONES DE CARBOHIDRATOS
INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos se definen con bases químicas, como polihidroxialdehídos,

polihidroxicetonas o aquellos compuestos que por hidrólisis los producen.

Los carbohidratos se pueden clasificar, por el número de unidades en:

monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

Dependiendo del grupo funcional químico (aldosas y cetosas) los

monosacáridos, la unidad de carbohidrato, puede ser una aldosa
(polihidroxialdehído) o cetosa (polihidroxicetona) y éstas a su vez se clasifican
con base al número de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y tetrulosas,
pentosas y pentulosas, hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, para
finalmente reclasificarse cada una de ellas por el número de sus centros quirales.

Los oligosacáridos están constituidos de 2-10 monosacáridos unidos a través del

enlace glicosídico que puede ser hidrolizado por enzimas o por ácidos en ciertas
condiciones apropiadas

Los polisacáridos son carbohidratos que contienen un gran número de

monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos; son hidrocoloides o hidrogeles,
no forman soluciones químicas verdaderas, no tienen color, ni sabor y su peso
molecular puede llegar hasta varios millones. Los polisacáridos son biopolímeros
lineales o ramificados constituidos por un solo tipo de monosacáridos
(homopolisacáridos) o por dos o más diferentes monosacáridos
(heteropolisacáridos).

OBJETIVO

Identificar la presencia de diferentes tipos de carbohidratos, en una solución,

mediante reacciones dirigidas a sus grupos funcionales característicos.

MATERIAL
Tubos de ensayo Vaso de precipitados (100 mL)
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Cerillos
Gradilla Marcador
Baño maría a ebullición Masking tape

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Glucosa Sólida y al 2% Etanol al 96%

Arabinosa al 2% Ácido sulfúrico concentrado
Maltosa al 2% Floroglucinol

68
 Sacarosa sólida y al 2% HCl concentrado y diluido 1:3
Fructosa al 2% Resorcinol u orcinol
Glucógeno sólido y al 0.2% Sulfato de cobre
Almidón sólido y al 2% Hidróxido de potasio
Dextrina sólida y al 2% Tartrato de sodio
Amilosa al 0.2% Yodo elemental
-naftol Yoduro de potasio

PRUEBAS CUALITATIVAS:

1. ACCIÓN DE LOS ÁCIDOS Y REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN DE

CARBOHIDRATOS.

Los ácidos minerales fuertes e inorgánicos deshidratan a las hexosas formando

derivados furánicos como el hidroximetil-furfural, que puede posteriormente
descomponerse y formar otros compuestos como el ácido levulínico y el ácido
fórmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural.
Estas reacciones son la base de las pruebas de Molisch- Udransky, Seliwanoff,
Tollens y Bial para caracterizar a los carbohidratos, ya que, el producto
deshidratado del carbohidrato se condensa con el reactivo correspondiente
(Hidroxi - compuesto aromático, benceno hidroxilado, naftaleno o bifenilo
hidroxilado) produciendo compuestos coloridos característicos.

Figura 1. Formación de furfural e hidroximetilfurfural

2.- IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN GENERAL (ALDOSAS Y

CETOSAS). REACCIÓN DE MOLISCH-UDRANSKY

FUNDAMENTO. La prueba de Molisch- Udransky se basa en la formación de

furfural o derivados de éste a partir de los carbohidratos, que se condensan con
el alfa-naftol, dando un anillo violáceo en la interfase.
Es una reacción muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y
sacarosa al 0.0001% dan positiva la prueba.
Esta prueba también es positiva para aldehídos, cetonas y algunos ácidos como
fórmico, oxálico, láctico y cítrico.
69
 Figura 2. Reacción de Molish-Udransky.

PROCEDIMIENTO
1) Micrométodo.
a) En una placa de hemaglutinación colocar 100 L de las soluciones a ensayar
marcadas con asterisco en la tabla.

b) Adicionar 75 L del reactivo de Molish y mezclar suavemente.

c) Adicionar lentamente por la orilla del pozo 150 L de H2SO4, para la formación
de dos fases.
d) Una prueba positiva es un fondo violeta-morado.

2) Macrométodo.
a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 mL de las soluciones tipo a
probar marcadas con asterisco en la tabla 1.

b) Agregar 2 gotas del reactivo de Molisch y mezclar.

c) Estratificar cuidadosamente con 1 mL de H2SO4 concentrado, evitando no

agitar el tubo.

d) Una prueba positiva es un anillo color violeta en la interfase

70
b.- IDENTIFICACIÓN DE PENTOSAS. REACCIÓN DE TOLLENS
FUNDAMENTO. La prueba de Tollens es una reacción característica para
pentosas y está basada en la formación de furfural a partir de pentosas y su
posterior condensación con el floroglucinol dando un color rojo cereza., con otros
monosacáridos forman otro color.

Figura 3. Reacción de Tollens.

PROCEDIMIENTO
1) Micrométodo.

a) En una placa de hemaglutinación colocar 200 L de las soluciones a ensayar

marcadas con asterisco en la tabla.

b) Adicionar 125 L del reactivo de Tollens y mezclar suavemente.

c) Calentar en placa de 1-2 minutos.

d) Una prueba positiva es un color rojo cereza.

2) Macrométodo.

a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 0.5 mL de las soluciones a

probar marcadas con asterisco en la tabla 1

b) Agregar 1 mL del reactivo de Tollens y mezclar.

c) Calentar en baño María a ebullición por 3-4 minutos.

d) Una prueba positiva es un color rojo cereza. Anote los diferentes colores
obtenidos.

71
c.- DIFERENCIACIÓN ENTRE ALDOSAS Y CETOSAS. REACCIÓN DE
SELIWANOFF

FUNDAMENTO. La prueba de Seliwanoff es una reacción para diferenciar

cetosas de aldosas; aunque ambas dan la reacción, las cetosas la dan rápido y
las aldosas lento.

Esta reacción se basa en la formación de furfural o en un derivado de éste y su

posterior condensación con el resorcinol dando un color rojo fuego, antes de los
5 minutos en ebullición para cetosas y rosa para aldosas, después de 15 o más
minutos..

Figura 4. Reacción de Seliwanoff

72
PROCEDIMIENTO

1) Micrométodo.
a) En una placa de hemaglutinación colocar 300 L de las soluciones a ensayar
marcadas con asterisco en la tabla.

b) Adicionar 200 L del reactivo de Seliwanoff y mezclar suavemente.

c) Calentar en placa de calentamiento y leer cada minuto durante los primeros 3

min, después observe cada dos minutos.

d) Un color rojo fuego es prueba positiva para cetosas y un color rosa es una
prueba positiva para aldosas.

2) Macrométodo.
a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 mL de las soluciones a probar
marcadas con asterisco en la tabla.

b) Agregar 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y mezclar.

c) Calentar en baño maría a ebullición.

d) Tomar lecturas de la coloración a intervalos de 1 minuto durante los primeros

5 minutos.

e) Después de los primeros 5 min saque los tubos que ya tengan color rojo y deje
los demás en el baño maría a ebullición por alrededor de 25 min adicionales.

f) Un color rojo fuego es una prueba positiva para cetosas y un color rosa es una
prueba positiva para aldosas.

2. ACCIÓN DE LOS ÁLCALIS Y PODER REDUCTOR DE LOS

CARBOHIDRATOS. ISOMERIZACIÓN EN BASES DILUÍDAS

Los álcalis pueden inducir varias reacciones químicas en los monosacáridos que
dependen de la intensidad del tratamiento y de la concentración del álcali
utilizado. A bajas concentraciones (0.05 N) se favorece la isomerización y el
equilibrio ceto-enólico (aldosas-cetosas).

En condiciones más severas (0.5 N), la isomerización se produce fuertemente y

los enoles intermediarios se rompen produciendo compuestos como:
formaldehído, aldehído glicólico, gliceraldehído, acetona, los ácidos, láctico,
propiónico, pirúvico etc.

En condiciones fuertemente alcalinas se generan ácidos sacáridos.

73
Una reacción característica de los carbohidratos se basa en el poder reductor
que le confiere su grupo aldehído o cetona.

Trans-enodiol Cis-enodiol

Figura 5. Isomerización de aldosas y cetosas en medio alcalino (equilibrio

o transposición de Lobry de Bruyn, Cornelis, Adriaan- Van Eckenstein,
Willem,Alberda)

a.- IDENTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES. REACCIÓN DE

FEHLING

FUNDAMENTO.

La reacción de Fehling está basada en la acción reductora que tienen los

azúcares sobre los iones cúpricos en medio alcalino, como se representa a
continuación:

Carbohidrato reducido + Cu2+→ Carbohidrato oxidado + Cu+

El reactivo de Fehling está constituido por dos soluciones que se mezclan al

momento de usarse (Solución A de sulfato de cobre y solución B de tartrato de
sodio-potasio en medio alcalino) con lo que se obtiene el tartrato de cobre, que
es el que se reduce.
El poder reductor de los oligo y polisacáridos depende del número de carbonilos
potencialmente libres que no estén involucrados en enlaces glicosídicos.

PROCEDIMIENTO

1) Micrométodo.
a) En una placa de hemaglutinación colocar 200 L de las soluciones a ensayar
marcadas con asterisco en la tabla.

74
b) Adicionar 100 L del reactivo de Fehling A y 100 L del reactivo de Fehling B
mezclar suavemente.

c) Calentar en placa de 2 minutos.

d) Una prueba positiva es la presencia de un precipitado rojo ladrillo.

2) Macrométodo.

PREPARACIÓN DEL TESTIGO

a) Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de agua destilada.

b) Agregar 0.5 mL del reactivo de Fehling A y 0.5 mL del reactivo de Fehling B y

mezclar.

c) Calentar en baño maría durante 5 minutos.

d) Debe mantenerse el color azul característico sin producirse un precipitado rojo

ladrillo.

PREPARACIÓN DE LOS PROBLEMAS

a) Colocar en el tubo correspondiente 1 mL de las soluciones a probar marcadas

con asterisco en la tabla.
b) Agregar 0.5 mL del reactivo de Fehling A y 0.5 mL del reactivo de Fehling B y
mezclar.

c) Calentar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.

d) Una prueba positiva es un precipitado rojo ladrillo por la presencia de óxido

cuproso Cu2O.

Unión transitoria de la sal doble de tartrato y el cobre, en medio alcalino.

75
3. SOLUBILIDAD Y SABOR DE LOS CARBOHIDRATOS

PROCEDIMIENTO

a) Colocar en 5 tubos de ensayo 3 mL de agua destilada

b) Agregar en el tubo correspondiente aproximadamente 50 mg de los

carbohidratos sólidos a probar (marcados con asterisco en la tabla 1).

c) Mezclar y anotar el grado de solubilidad en frío.

d) Calentar en baño maría durante 2 minutos

e) Anotar el grado de solubilidad en caliente.

f) Tomar, con ayuda de un agitador, unas gotas de cada solución y percibir su

sabor.

g) Hacer las anotaciones correspondientes.

4. REACCIÓN DEL YODO O LUGOL

FUNDAMENTO.
El yodo es atrapado por los polisacáridos formando clatratos, y dependiendo de
la estructura del polisacárido, da una coloración característica; si el polisacárido
es lineal se obtendrá una coloración azul pero si es poco ramificada la coloración
obtenida es morada y muy ramificada es roja.

PROCEDIMIENTO
a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 mL de las soluciones a probar
(marcadas con asterisco en la tabla 1).

b) Agregar una gota de Lugol y mezclar.

c) Anotar el color producido en frío.

d) Calentar en baño maría.

e) Anotar la observación después de aplicar calor.

f) Introduzca los tubos calientes en hielo y observar qué sucede.

76
TABLA 1. REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Quimiotipos Molisch Tollens Seliwanoff Fehling Solubilidad/ Sabor Yodo (Lugol)

[Link] (agua) * * * * *

* * * * * *
[Link]

*
[Link]

*
[Link]

* * * * * *
[Link]

* * *
[Link]

* * *
[Link]ógeno

* * * *
[Link]ón

* * * * *
8. Dextrina

77
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivo.
3. Fundamento de las reacciones con fórmulas.
4. Resultados en forma de tabla.
5. Interpretación de cada una de las reacciones.
6. Conclusiones.
7. Bibliografía.
8. Preguntas extra.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Glucosa al 2%.- Pesar 2 g de glucosa y disolver en 100 mL de agua destilada,

refrigerar.

2) Arabinosa al 2%.- Pesar 2 g de arabinosa y disolver en 100 mL de agua

destilada, refrigerar.

3) Maltosa al 2%.- Pesar 2 g de maltosa y disolver en 100 mL de agua destilada,

refrigerar.

4) Sacarosa al 2%.- Pesar 2 g de sacarosa en 100 mL de agua destilada.

Refrigerar.

5) Fructosa al 2%.- Pesar 2 g de fructosa en 100 mL de agua destilada, refrigerar.

6) Solución de glucógeno al 0.2%.- Pesar 200 mg de glucógeno y disolver en

100 mL de agua caliente. Refrigerar.

7) Solución de almidón al 2%.- Pesar 2 g de almidón comercial y disolver en 100

mL de agua caliente, al agua caliente agregar poco a poco el almidón. Refrigerar.

8) Dextrina al 2%.- Pesar 2 g de dextrina y llevar a 100 mL con agua destilada

(para disolver, alcalinizar en caliente y neutralizar posteriormente), refrigerar.

9) Reactivo de Molish.- Pesar 5 g de alfa-naftol y disolver en 100 mL de alcohol

a 96º.

10) Floroglucinol al 2%.- Pesar 2 g de floroglucinol y disolver en 100 mL de agua

caliente.

11) Reactivo de Tollens.- Mezclar 10 mL de HCl concentrado con 2 mL de

floroglucinol al 2% y llevar con agua destilada hasta 18 mL.

12) Reactivo de Fehling:

78
Solución A.- Pesar 34.65 g de sulfato de cobre y disolver 300 mL de agua
destilada, llevar a 500 mL con agua y conservar en frasco con tapón de hule.

Solución B.- Pesar 125 g de KOH y 173 g de tartrato de sodio y potasio, y llevar
con agua destilada a 500 mL, conservar en frasco revestido de parafina y con
tapón de hule.

13) Reactivo de Seliwanoff.- Pesar 0.05 g de resorcinol y disolver en 100 mL de

HCl diluido 1:3.

14) Lugol.- Pesar 1 g de yodo elemental, 2.0 g de KI (dos partes de KI por una
de yodo), mezclar en un mortero y agregar agua destilada poco a poco hasta la
disolución total. Llevar a 300 mL con agua destilada y conservar en un frasco
ámbar.

BIBLIOGRAFÍA

1. Boyer R., “Conceptos en Bioquímica” Ed. International Thomson Editores., 1a.

Edición en español. pp. 204- 236, (1999).

2. Campbell M.K., Farrel S.O., “Bioquímica”, Thomson Editores, 4a. Edición

pp.433- 461, (2004).

3. McKee T., McKee J. R., “Bioquímica” Ed. McGraw- Hill; Interamericana, 3ª.
Edición. pp. 200- 233, (2003).

4. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger Principios de Bioquímica” Editorial

OMEGA, 3ª. Edición, pp. 293- 314, (2001).

5. Plummer, D. T. "Introducción a la Bioquímica Práctica". Mc Graw Hill

Latinoamericana, S.A. pp. 166-167 (1981).

6. Mathews C.K., Van Holde K.E., “Bioquímica” Editorial McGraw- Hill-

Interamericana 2ª Ed. pp. 306- 328, (1998)

7. [Link] el 7 Julio del

2022.

79
NOTAS Y CÁLCULOS

80
 PRÁCTICA No 7
OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO DE RATA
Y SU CARACTERIZACIÓN QUÍMICA

INTRODUCCIÓN

El glucógeno es el principal polisacárido de reserva de las células animales y al

igual que la amilopectina es un polisacárido ramificado de la D-glucosa con
enlaces α-1,4 y α-1,6 en los puntos de ramificación, pero es mucho más
ramificado y compacto que ésta. El glucógeno es especialmente abundante en
el hígado, en donde puede alcanzar hasta el 7% del peso húmedo y se halla
presente también en el músculo esquelético. En células hepáticas, el glucógeno
se encuentra almacenado en gránulos grandes que contienen además, unidas
en forma muy íntima, las enzimas responsables de su síntesis y degradación.

El glucógeno puede hidrolizarse por la acción de la enzima alfa-amilasa que se

encuentra en la saliva y en el jugo pancreático, la cual rompe los enlaces α-1,4
de las ramas exteriores del glucógeno para dar glucosa, una cantidad pequeña
de maltosa, unidades de maltotriosa y residuos de cadenas ramificadas llamadas
dextrinas, puesto que no hidroliza las ramificaciones.

OBJETIVOS

Obtener glucógeno a partir de hígado de rata o hígado de pollo.

Caracterizar químicamente al glucógeno obtenido de hígado de rata o hígado de

pollo.

MATERIAL

Vasos de precipitados de 100 mL Pipetas de 1, 5 y 10mL

Equipo de disección Centrífuga
Recipientes para hielo Algodón
Balanza granataria Papel manila
Mortero con pistilo Arena lavada
Probeta de 100 mL Placa de calentamiento
Tubos de polipropileno 50 mL Tijeras
Baño maría Éter
Vidrio de reloj Ácido tricloroacético al 5%
Tubos de ensaye de 10 x 15 mm Ácido tricloroacético al 10%

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Etanol 96°
Amilasa salival (diferentes diluciones)

81
 Cloruro de sodio sólido
Etanol absoluto
HCl 1 N, 2 N, 4 N y concentrado

1. OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO.

PROCEDIMIENTO.

A) Si se utiliza hígado de rata (de acuerdo a la disponibilidad de animales en

el bioterio).

a).- Sacrificar una rata con éter (procurando no excitarla).

b).- Extraer rápidamente el hígado y lavarlo al chorro del agua.

B) Si se utiliza hígado de pollo.

a).- Comprar hígado de pollo en un tiempo no mayor a 24h antes de la práctica.

b).- Una vez en el laboratorio, lavar al chorro de agua.

Para ambas muestras seguir incisos como se indica.

c).- Pesar y cortar rápidamente el hígado en pedazos pequeños, los cuales

deben ser lavados nuevamente con agua fría.

d).- Colocar los pedazos de hígado en un mortero previamente sumergido en

hielo, añadir ácido tricloroacético (TCA) al 10% en proporción de 1 mL/g de tejido
hepático y aproximadamente 0.5 g de arena lavada. Triturar el hígado hasta
formar una pasta homogénea.

e).-Centrifugar el homogeneizado durante 5 minutos a 2000 rpm.

f).-Decantar el líquido sobrenadante en un vaso de 250 mL y mantenerlo en hielo.

g).-Lavar el mortero y el pistilo con 10 mL de ácido tricloroacético al 5% y en este

líquido resuspender el precipitado de la centrifugación anterior, homogeneizando
bien.

h).-Dejar en reposo 5 minutos y centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos.

i).-Decantar el líquido sobrenadante y reunirlo con el obtenido en el inciso (f).

j).-Añadir dos volúmenes de etanol de 96º por volumen de sobrenadante. Agitar

esta mezcla y dejar en reposo hasta que el glucógeno flocule. Si esto no sucede,

82
añadir un poco de NaCl sólido y colocarlo en baño maría a 37ºC, hasta la
formación del flóculo.

k).-Centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos.

l).-Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 mL de agua

destilada.

m).-Volver a precipitar con 2 volúmenes de etanol 96º.

n).-Centrifugar a 2 000 rpm durante 3 minutos.

o).-Decantar y suspender con la menor cantidad posible de alcohol absoluto (1-

2 mL) y pasarlo a un vidrio de reloj o canasta de aluminio. Dejar que se seque y
cristalice.

2. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL GLUCÓGENO.

PROCEDIMIENTO.

a) Preparar 15 mL de una solución de glucógeno de 5 mg/mL.

b) De la solución anterior prepara 3 tubos para realizar las pruebas de

ninhidrina, Biuret y Molish al glucógeno, utilizando para ello 0.5 mL de la solución
de 5 mg/mL. Anotar los resultados en la tabla 1

TABLA 1. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL GLUCÓGENO SIN

HIDROLIZAR

PRUEBA OBSERVACIÓN
Molish
Biuret

Ninhidrina

83
Preparar cinco tubos para hidrólisis del glucógeno según la siguiente tabla:

TABLA 2. HIDRÓLISIS DEL GLUCÓGENO

TUBO 1 2 3 4 5 6

Glucógeno (mL) 2 2 2 2 2 2

HCl 1 N (mL) 2

HCl 2 N (mL) 2

HCl 4 N (mL) 2

Amilasa concent. (mL) 2

Amilasa 1:2 (mL) 2

NaCl al 5% 1 gota 1 gota

Agua destilada 2

Incubar: 92º C 37º C

30 min.

c) A 0.5 mL de los hidrolizados se les realizan las pruebas de Fehling, lugol y

Seliwanoff. Para cada prueba incluya un blanco con agua destilada y un testigo
de glucógeno sin hidrolizar. Anotar los resultados en la siguiente tabla:

TABLA 3. RESULTADOS DE LA CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL

GLUCÓGENO HIDROLIZADO
Hidrólisis Ácida Testigo Enzimática Blanco

1N 2N 4N Glucógeno Conc. 1:2 Agua

sin
hidrolizar
(Tubo No.
4)
Fehling

Lugol

Seliwanoff

84
 NOTA: Para Fehling se neutralizan los tubos de la hidrólisis ácida de la siguiente
forma (utilizando una pipeta de 10 mL):
1. Para el tubo de HCl 1N se adicionan 2 gotas de NaOH al 40%.
2. Para el tubo de HCl 2N con 4 gotas de NaOH al 40%.
3. Para el tubo de HCl 4N con 8 gotas de NaOH al 40%.

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivo.
3. Realizar un diagrama de flujo del procedimiento de obtención de glucógeno,
explicando el fundamento de cada paso.
4. Determinar el porcentaje de glucógeno presente en el hígado de la rata.
5. En caso de haber realizado la caracterización química, informar con las tablas
correspondientes de resultado.
6. Discusión.
7. Conclusiones.
8. Preguntas extra.
9. Bibliografía.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) HCl 1 N. Medir 85.51 mL de HCl con 37% de pureza y 1.18 de densidad. Llevar
a un litro con agua destilada en un matraz aforado.

2) HCl 2 N. Medir 162.02 mL de HCl con 37% de pureza y 1.18 de densidad.

Llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado.

3) HCl 4 N. Medir 334.04 mL de HCl con 37% de pureza y 1.18 de densidad.

Llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bohinski, R. C., "Bioquímica", 5ª Ed Addison-Wesley Iberoamericana,

Argentina, Brasil, pp.187-195, (1991).

2. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger Principios de Bioquímica” Editorial

OMEGA, 3ª. Edición, pp. 304-306, (2001).

3. Boyer R., “Conceptos en Bioquímica” Ed. International Thomson Editores., 1a.

Edición en español. pp. 220- 223, (1999).

4. Campbell M.K., Farrel S.O., “Bioquímica”, Thomson Editores, 8a. Edición. Vol.
II pp.519- 526, (2015).

5. Mathews C.K., Van Holde K.E., “Bioquímica” Editorial McGraw- Hill-

Interamericana 2ª Ed. pp. 329- 337, (1998)

85
NOTAS Y CÁLCULOS

86
 PRÁCTICA No 8
SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA

INTRODUCCIÓN

Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos de origen biológico,

insolubles en agua y solubles en solventes no polares. Los lípidos se han
clasificado en 1) simples y 2) complejos.
Los lípidos simples son derivados del isopreno y no son saponificables. Entre
ellos se encuentran el colesterol, hormonas sexuales, ácidos biliares y algunas
vitaminas.
Los lípidos complejos contienen ácidos grasos por lo que son saponificables y
se dividen en: triacilglicéridos, esfingolípidos, fosfoacilglicéridos y ceras.
Los triacilglicéridos, llamados también grasas neutras, son ésteres del glicerol y
ácidos grasos.
Los fosfoglicéridos y los esfingolípidos se conocen también como fosfolípidos
debido a la presencia del grupo fosfato.
Las ceras son ésteres de ácidos grasos con alcoholes diferentes del glicerol.
Los antiguos métodos para separar e identificar los lípidos basados en
procedimientos químicos clásicos de cristalización, destilación y extracción por
solventes, han sido en gran parte reemplazados por procedimientos
cromatográficos. Particularmente útil para la separación de las diversas clases
de lípidos es la cromatografía en capa fina. Antes de que esta técnica se aplique,
los lípidos deben extraerse de los tejidos por un sistema de solventes,
generalmente cloroformo-metanol 2:1.

OBJETIVOS

Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la separación de los

fosfolípidos de la yema de huevo.

Discutir las ventajas de la técnica de separación respecto a la cromatografía en

papel.

MATERIAL
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Papel filtro
Bulbo de hule Balanza granataria
Vasos de precipitados de 25 mL Micropipetas de 5 y 50 L
y 100 mL Capilares
Cámaras de cromatografía Celdas de vidrio
Placas de vidrio de 8 x 7 cm Puntas para micropipetas
Aspersor Pipetas Pasteur
Agitador de vidrio Espectrofotómetro
Horno de cromatografía Cromatofolios

87
 Embudo de filtración Gradilla

SOLUCIONES Y REACTIVOS
KI Molibdato de sodio
H2SO4 concentrado Ninhidrina
Cloroformo Butanol
Metanol Nitrato de bismuto
KCl 0.1 M Yodo (cristales)
Ácido acético glacial al 20% Colesterol

PROCEDIMIENTO
1. EXTRACCIÓN DE LOS LÍPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO

a) Mezclar media yema de huevo con 15 mL de cloroformo-metanol (2:1 v/v).

b) Agitar enérgicamente durante 20 minutos en un baño de hielo y filtrar (medir

la cantidad de filtrado).

c) Mezclar el filtrado con 5 mL de KCl 0.1 M y agitar.

d) Dejar reposar para separar las dos fases o centrifugar a 2500 rpm por 5 min.

e) Desechar la fase superior acuosa y utilizar la fase inferior orgánica para la

separación cromatográfica.

2. APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Colocar a 1 cm del extremo inferior y debidamente separadas, 2 µL de dos

muestras diferentes de extracto de lípidos, en una o dos aplicaciones, en cuatro
placas cromatográficas, teniendo cuidado de no perforar la capa de sílica.

3. DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA

Desarrollar las placas cromatográficas en la cámara de cromatografía, utilizando

como fase móvil una mezcla de cloroformo-metanol-ácido-acético-agua
([Link]).

4. REVELADO DE LOS CROMATOGRAMAS

Se dispondrá de tres reactivos líquidos (molibdato, ninhidrina y bismuto) los
cuales se colocarán en cajas de Petri (de vidrio) de tal forma que solamente se
llene el fondo de la misma. El cuarto reactivo (yodo metálico) se encontrará en
unfrasco de vidrio bien tapado.

a) Una de las placas cromatográficas se revalará con el reactivo de molibdato

88
para fosfolípidos en general. Se verán manchas de color azul.

b) Otra de las placas cromatográficas se revelará con el reactivo de bismuto para

revelar fosfolípidos que contienen colina, los cuales se verán de color amarillo-
naranja.

c) La tercera placa cromatográfica se revelará con el reactivo de ninhidrina para

revelar fosfolípidos que contienen grupos amino (calentar la placa a 100º C
durante 2 a 3 minutos en el horno). Al terminar, se revelarán manchas de color
violeta.

d) Colocar una cuarta placa en una cámara que contenga cristales de yodo para
revelar lípidos que tengan dobles enlaces en su molécula. Estos se verán de
color café.

5. IDENTIFICACIÓN DE LOS LÍPIDOS

a) Hacer un esquema o tomar una fotografía de las cromatoplacas obtenidas con

los diferentes reveladores.

Figura 1. Cromatoplacas de los distintos fosfolípidos a determinar. Se

muestran los resultados para grupos fosfato de fosfolípidos en general
(Molibdato), fosfolípidos con grupo colina (Bismuto), fosfolípidos con grupos
amino (Ninhidrina) y fosfolípidos con dobles enlaces (Yodo), se utilizan dos
muestras , izquierda Gallina y derecha Codorniz. (Fotografía tomada por [Link] E.
Sakuntala Gonzara).

89
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Cálculos de los Rf e informarlos en forma de tabla.
4. Esquemas de las placas obtenidas.
5. Discusión.
6. Conclusiones.
7. Bibliografía.
8. Preguntas extra

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) KCl 0.1 M.- Pesar 7.4 g de cloruro de potasio y llevar a 1000 mL con agua
destilada en un matraz aforado.

2) Cloroformo-metanol (2:1).- Mezclar 200 mL de cloroformo con 100 mL de

metanol.

3) Cloroformo - metanol - ácido acético - agua.- Mezclar en un matraz 68 mL de

cloroformo con 25 mL de metanol más 8 mL de ácido acético y 4 mL de agua.

4) Reactivo de molibdato (para fósforo.)- Pesar 6.85 g de molibdato de sodio y

0.4 g de sulfato de hidrazina, disolver en 100 mL de ácido sulfúrico concentrado,
enfriar y diluir a un litro con agua destilada.

5) Reactivo de ninhidrina (para amino-fosfolípidos).- Pesar 0.5 g de ninhidrina y

disolver en 100 mL de butanol.

6) Reactivo de bismuto (para fosfolípidos con colina).- Preparar dos soluciones:

A y B.
Solución A: Pesar 1.7 g de nitrato de bismuto en 100 mL de ácido acético al 20%
en agua destilada (volumen/volumen).

Solución B: Pesar 40 g de yoduro de potasio (KI) y disolverlos en 100 mL de

agua destilada.

Este reactivo se prepara al momento de usarse:

Mezclar: 0.4 mL de solución A con 2.5 mL de ácido acético al 20%, agitar y

adicionar 0.1 mL de la solución B.

7) Ácido acético al 20%.- Medir 20 mL de ácido acético glacial y llevar a 100 mL

con agua destilada.

8) Reactivo de Iodo.(para lípidos con dobles enlaces).- En una cámara de

cromatografía colocar 2 g de cristales de iodo.

90
BIBLIOGRAFÍA

1. Burton, D. J. y Routh J. I., Química Orgánica y Bioquímica", 1a. Edición, Ed.

Mc Graw Hill, pp. 231-250, (1989).

2. Freifelder., D., "Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular", Ed. Reverte,

Mexicana, S. A de C. V., pp. 188-199, (1991).

3. Conn, E. E.., Stumpf P. K.,Bruening G., Doi R.H., "Bioquímica Fundamental".

Ed. Limusa, México, pp. 285- 297 (2004).

4. Alexander R.R, Griffiths J.M., Wilkinson M.L., “Basic Biochemical Methods”

Editorial John Wiley & Sons. Inc. 10a Ed. pp. 102- 115 (1984)

5. Thorpe, W. V., Bray. H. G. y James, S. P., "Bioquímica", Ed. Continental, S.

A., México, pp. 81-90, (1974).

6. McKee T., McKee J. R., “Bioquímica” Ed. McGraw- Hill; Interamericana, 3ª.
Edición. pp. 331- 369, (2003).

91
NOTAS Y CÁLCULOS

92
 PRÁCTICA No 9
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN LA YEMA DE HUEVO

INTRODUCCIÓN

Los lípidos simples no contienen ácidos grasos por lo que no son saponificables
y se dividen en terpenos, prostaglandinas y esteroides.

Los terpenos se encuentran en animales y plantas, tienen estructura de

diisopreno, triisopreno, etc. No se sintetizan a partir del isopreno sino de la
acetilcoenzima A y son los precursores de los esteroides.

Las prostaglandinas son consideradas como moderadores de la actividad

hormonal, son ácidos carboxílicos de 20 átomos de carbono, que contienen un
anillo ciclopentano, grupos oxidrilo, uno o más dobles enlaces y a veces un grupo
cetona.

Los esteroides son derivados de alcoholes cíclicos de peso molecular elevado

que existen en todas las células vivas. El hidrocarburo original para todos los
esteroides es el núcleo esteroidal.

El colesterol es el esterol más común y es un compuesto clave en la síntesis de

ácidos biliares, hormonas sexuales, hormonas corticosuprarrenales y vitamina
D.

Fundamento de la reacción de Lieberman-Burchard.

En solución clorofórmica, el colesterol reacciona con anhídrido acético y ácido

sulfúrico para dar un complejo de color verde que resulta de la mezcla de dos
compuestos: uno de color azul y otro amarillo y que se cuantifican a 640 nm.
Esta reacción es inestable por lo que las lecturas se deberán realizar antes de
20 minutos.

Figura 1. Estructura del Colesterol

OBJETIVO
93
Determinar la concentración de colesterol en la yema de huevo, por el método
de Lieberman-Burchard.

MATERIAL
Micropipetas de 5 y 50 L Espectrofotómetro
Celdas de vidrio Tubos de ensaye
Puntas para micropipetas Pipetas de 1 y 5 mL
Gradilla Propipeta

SOLUCIONES Y REACTIVOS
H2SO4 concentrado
Anhídrido acético
Cloroformo
Estándar de Colesterol (4 mg de colesterol en 50 mL de cloroformo)
Extracto de lípidos (previamente obtenido)

Figura 2. Reacción de Lieberman-Burchard

94
PROCEDIMIENTO

NOTA: Todo el material que se usará deberá estar perfectamente limpio y seco
porque la reacción ocurre en condiciones anhidras y el solvente es cloroformo.

Preparar una serie de tubos de acuerdo con la tabla siguiente, tomando en

cuenta las indicaciones del profesor.

TABLA 1. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL POR EL MÉTODO DE

LIEBERMAN- BURCHARD

TUBO No. B 1 2 3 4 5 Pb
Estándar de colesterol* 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 0.00
(mL)
80 g/mL
Cloroformo (mL) 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1.25
Extracto de lípidos (µL) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 5.00
Anhídrido acético(mL) 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
AGITAR

Ácido sulfúrico concentrado (µL) 50 50 50 50 50 50 50

Agitar e incubar 5 minutos a temperatura ambiente

Leer a 640 nm dentro de los primeros 20 minutos debido a que el producto

de la reacción es inestable.

Absorbencia

g de colesterol en el
tubo
de reacción

* Estándar de colesterol: 4 mg de colesterol por 50 mL de cloroformo

INFORME
1. Introducción.
2. Objetivos.
3. Cálculos de los Rf e informarlos en forma de tabla.
4. Esquemas de las placas obtenidas.
5. Gráfica de la curva tipo y cálculos de la concentración total de colesterol, en
la yema de huevo.
6. Discusión.

95
7. Conclusiones.
8. Bibliografía.
9. Preguntas extra

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Estándar de colesterol.- Pesar 0.004 g de colesterol y disolverlos en 50 mL de

cloroformo.

BIBLIOGRAFÍA

1. Conn, E. E., Stumpf P. K., Bruening G., y Doi R.H. “Bioquímica Fundamental”.
Editorial Limusa S.A. 5ª. Reimpresión México, pp. 470.472, (2204).

2. Pesce, M.A., and Bodourian, S.H., Enzymatic rate method for measuring
cholestherol in serum. Clin Chem. 22 (12): 2042- 2045. (1976).

3. Weidman S.W., and Schonfeld G. Lipids and lipoproteins in Gradwohl´s

Clinical Laboratory Method and Diagnosis. 8th Edition, Vol: I Sonnenwirth A.C.
and [Link]. The C.V. Mosby Company; 280 (1980)

4. Krupp M.A., Tierney I.M., Jawets E., Roe. R.I., Camargo C.A., “Manual de
diagnóstico clínico y de Laboratorio. Editorial Manual Moderno. 8ª Ed. México
D.F., pp. 190- 192 (1986).

5. Suardíaz. J., Cruz C., Colina A., “Laboratorio Clínico” Editorial Ciencias
Médicas, 1ª Ed. pp 117-121 (2004).

96
NOTAS Y CÁLCULOS

97
 PRÁCTICA No 10
REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO
DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

Las reacciones de transaminación juegan un papel fundamental en los sistemas

biológicos. Por ejemplo, participan en procesos de los cuales derivan
intermediarios del Ciclo de Krebs y de la gluconeogénesis. Contribuyen a la
eliminación de amonio y en la síntesis de otros aminoácidos, así como en la
regulación de neurotransmisores como el ácido 4-aminobutírico (GABA)
(Litwack, 2018). En plantas intervienen en el metabolismo del glutamato,
asociado a la asimilación de N2 y al crecimiento de las plantas (Hong-Sheng y
col, 2022). En la industria también son de interés ya que se emplean para la
síntesis de medicamentos, como la rivastigmina -para el tratamiento de las
enfermedades de Alzheimer y Parkinson- y la sitagliptina -agente antidiabético-.
También son usadas en la fabricación de polímeros como el ácido omega-
aminoláurico -monómero de plásticos biodegradables- (Fuchs y col, 2015).

Las transaminasas -también llamadas aminotransferasas- están ampliamente

distribuidas en los tejidos animales, sin embargo son muy abundantes en
corazón, músculo, hígado y riñón (Bhagavan y Chung-Eun, 2015). En la clínica
son dos las enzimas más importantes; la TGO (Transaminasa Glutámico-
Oxalacética) también llamada AST (Aspartato-aminotransferasa) y la TGP
(Transaminasa Glutámico-Pirúvica) también llamada ALT (Alanino-
aminotransferasa). Ambas se usan como marcadores de daño hepático y
cardiaco respectivamente (Aldous, 2013; Gwaltney-Brant, 2016).

Figura 1. Reacción general de la transaminación

Modificado de Bhagavan y Chung-Eun, 2015

Todas las transaminasas emplean como cofactor al fosfato de piridoxal (PLP)

derivado de la vitamina B6. La reacción que catalizan es la transferencia
reversible del grupo α-amino de los aminoácidos hacia el carbono α de un α-
cetoácido (como el α-cetoglutarato). Por lo tanto, el α-cetoácido aceptor se
transforma en un nuevo aminoácido y el aminoácido donador se transforma en
un nuevo α-cetoácido (Figura 1). Sin embargo, es necesario considerar que esta
reacción se lleva a cabo en dos etapas en las que el PLP es indispensable debido
a que su función es la de realizar el traspaso del grupo amino del α-aminoácido

98
hacia el α-cetoácido (Figura 2).

Figura 2. Etapas de la transaminación y el papel del fosfato de piridoxal

Modificado de Litwack, 2018

OBJETIVO

Cuantificar la actividad de la transaminasa ALT/TGP a partir de un extracto crudo

de hígado.

MATERIALES Y EQUIPOS

Celdas de vidrio Tubos de ensaye

Gradilla p/ tubos de ensaye Vasos de precipitados de 100 mL
Micropipetas de 5 L vol. mínimo Aspersor
Papel Whatman N°1 Baño de agua 37°C
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 mL Cámara de cromatografía
Tijeras, lápiz, regla y encendedor Centrífuga
Tubos cónicos de 50 mL Espectrofotómetro
Parrilla de calentamiento Estufa de cromatografía
Secadora de cabello

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Alanina 100 moles/mL Ninhidrina al 1% en butanol

Ácido alfa-cetoglutárico 100 moles/mL Acetona al 75%
Ácido glutámico 20 moles/mL Regulador de fosfatos 0.1 M pH 7
Etanol 96º Etanol: metanol: agua: urea (45: 45:
10 + 0.5 g de urea)
Regulador de fosfatos 0.006 M pH 7.4

99
PROCEDIMIENTO

1.- REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN

a) Preparar dos tubos en la forma siguiente:

TABLA 1. ENSAYO DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA

TRANSAMINASA
Volumen para adicionar
Reactivo (mL)
Testigo Problema
Preparación cruda de
1.0 1.0
transaminasa
Regulador de fosfatos
1.0 1.0
(0.006 M pH 7.4)
Alanina
0.5 0.5
(100 µM/mL)
Pre incubar a 37ºC durante 5 minutos

Agua destilada 0.5 0.0

Ácido alfa-cetoglutárico
0.0 0.5
(100 µM/mL)
Incubar a 37ºC durante 1 hora con agitación ocasional

Alcohol 96º 4.0 4.0

Centrifugar 4 minutos a 4000 rpm

100
b) Pasar el sobrenadante a un vaso de precipitados y evaporar casi a sequedad
en una placa de calentamiento. Tener cuidado de no carbonizar la muestra.

c) Disolver los residuos con 1 mL de agua regulador de fosfatos.

2.- PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA

a) Cortar una tira de papel Whatman No. 1 de 23 x 57 cm. Con lápiz trazar a lo
ancho tres líneas paralelas -partiendo del borde inferior del papel- a 2.5, 6.0
y 8.0 cm. Doblar sobre la primera línea hacia el frente y sobre la segunda
hacia atrás.

b) En la última línea (8.0 cm) marcar con lápiz nueve puntos equidistantes
dejando un margen para que el punto 1 y 9 no queden justo en el borde del
papel.

c) Para la curva tipo se aplicarán en los primeros cinco puntos 5, 10, 15, 20 y
25 L respectivamente, de la solución de ácido glutámico de 20 moles/mL.
Secar después de cada aplicación con la secadora de cabello.
d)
e) Colocar en los cuatro puntos restantes, 60 L de los tubos P y T de la
reacción de transaminación, 20 L de regulador (blanco para ajustar el
espectrofotómetro), y 5 L de la solución tipo de alanina, respectivamente.
Como en el paso anterior, secar después de cada aplicación con la secadora
de cabello.

f) Saturar el cromatograma durante dos horas en una cámara de cromatografía

previamente saturada con el eluyente etanol: metanol: agua: urea
([Link].5 v:v:v:p).
g)
h) Desarrollar el cromatograma durante 18 horas aproximadamente con el
disolvente utilizado, hasta que éste haya recorrido tres cuartas partes del
cromatograma.

i) Sacar el cromatograma de la cámara, marcar el frente de corrimiento y

dejarlo secar.

3.-REVELADO Y ELUCIÓN DE LAS MUESTRAS

a) Revelar el cromatograma asperjando con una solución de ninhidrina en

etanol al 0.05%.

b) Calentar el cromatograma a 80ºC en la estufa para cromatografía hasta que

aparezcan ligeramente las manchas.
c) Medir frente del solvente y frente de las manchas para el cálculo de RF.

101
d) Recortar las manchas correspondientes a la curva tipo de ácido glutámico y
también las correspondientes al ácido glutámico de los tubos P y T.

e) Para el blanco, recortar en el carril donde se aplicó el regulador una porción

de papel a la misma altura de las manchas del ácido glutámico.

f) Fragmentar cada una de las porciones de papel y colocarlas en tubos de

ensaye previamente etiquetados. Añadir 1 ml de solución de ninhidrina al 1%
en butanol para eluir las muestras.

g) Colocar los tubos de ensaye en baño de agua a 80ºC durante 2 minutos.

Enfriar en baño de hielo y agregar a cada tubo 5 mL de acetona al 75%.

h) Vaciar cada una de las muestras en celdas de vidrio y leer en el

espectrofotómetro a 540 nm previamente ajustado con el blanco a cero de
absorbancia.

i) Calcular la concentración de ácido glutámico obtenido por acción de la

transaminasa.

INFORME
1. Introducción
2. Objetivo
3. Resultados
a. Esquema a escala del cromatograma obtenido y su interpretación
b. Cálculo y tabla de los valores de Rf.
c. Gráfico de curva tipo (absorbencia contra micromoles de ácido
glutámico). Incluir la ecuación de la recta resultante.
d. Cálculo de la actividad de la enzima en unidades arbitrarias de
transaminasa (UAT).Considerar que 1 AUT se define como la cantidad
de enzima necesaria para producir un micromol de ácido glutámico por
gramo de hígado por hora de incubación.
4. Discusión
5. Conclusiones
6. Preguntas extra
7. Bibliografía

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Preparación cruda de transaminasa de hígado de rata.- Con una licuadora

homogenizar el hígado de 1 rata en proporción 1:30, p/v en regulador de
fosfatos 0.1 M, pH 7.0. Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos. Separar
el sobrenadante y desechar la pastilla.

2) Alanina 0.1 M.- Pesar 0.891 g de alanina y llevar a 100 mL con agua destilada

102
 en un matraz aforado.

3) Ácido -cetoglutárico 0.1 M.- Pesar 1.46 g de ácido alfa-cetoglutárico y llevar

a 100 mL con agua destilada en un matraz aforado.

4) Ácido glutámico 0.02 M.- Pesar 0.147 g de ácido glutámico y llevar a 50 mL

con agua destilada en un matraz aforado. Ajustar el pH de la solución a 7.0.

5) Regulador de fosfatos 0.006 M, pH 7.4.- Pesar 2.136 g de Na2HPO4 • 12

H2O y llevar a 1000 mL con agua destilada en un matraz aforado. Pesar
0.816 g de KH2PO4 y llevar a 1000 mL con agua destilada en un matraz
aforado. Mezclar en proporción 8:2 de Na2HPO4 y KH2PO4 respectivamente;
ajustar el pH si es necesario.

6) Regulador de fosfatos de 0.1 M, pH 7.0.- Pesar 3.6 g de Na2HPO4 • 12 H2O

y 13.6 g de KH2PO4 y llevar cada uno a 100 mL con agua destilada en un
matraz aforado, por separado. Mezclarlos en proporción 6:4 (v/v). Ajustar el
pH si es necesario.

7) Ninhidrina al 0.05% en etanol 96º.- Pesar 0.05 g de ninhidrina y llevar a 100

mL con etanol 96º.

8) Ninhidrina 1% en butanol saturado con regulador de fosfatos 0.006 M, pH

7.4.- Pesar 5 g de ninhidrina y llevar a 500 mL con butanol. Mezclar 500 mL
de regulador de fosfatos 0.006 M, pH 7.4 con los 500 mL de ninhidrina al 1%
en butanol, agitar en un embudo de separación, eliminar la fase inferior
(acuosa) y usar la fase superior orgánica.

9) Etanol: metanol: agua: urea ([Link].5g v/v/v/p) Mezclar el etanol,

metanol, agua y urea en las proporciones correspondientes.

10) Acetona al 75%.- Medir 75 mL de acetona y llevar a 100 mL con agua

destilada.

BIBLIOGRAFÍA

1. Aldous, S. J. “Cardiac biomarkers in acute myocardial infarction”.

International Journal of Cardiology, 164:3, 282-294. (2013).

2. Bhagavan, N. V y H. Chung-Eun. “Protein and amino acid metabolism”.

Essentials of Medical Biochemistry. Editorial Academic Press. Segunda
edición. Pp. 227-268 (2015).

3. Bohinski, R. "Bioquímica". Editorial Addison-Wesley Iberoamericana, S. A.

5ª Ed. pp. 671-675. (1991).

103
4. Boyer R.F. “Modern Experimental Biochemistry” Editorial. The Benjamin/
Cummings Publishing Company, Inc. 2a Edition. pp. 59- 65 (1993).

5. Fauchs, J. E. Farnberg y W. Kroutil. “The industrial age of Biocatalytic

Transamination”. European Journal of Organic Chemistry, 2015:32, 6965-
6982. (2015).

6. Freifelder D. “Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular” Editorial

Reverté. pp. 188- 195 (1991).

7. Gwaltney-Brant, S. M. “Nutraceuticals in Hepatic Diseases”

Nutraceuticals. Editorial Academic Press. Pp. 87-99. (2016).

8. Hong-Sheng, L. C. Yi-Hsin y H. Ming-Hsiun. “Glutamate: A multifunctional

amino acid in plants”. Plant Science, 318:9, 111238. (2022).

9. Litwack L, “Metabolism of Amino Acids”. Human Biochemistry. Editorial

Academic Press. Pp. 3-59-394. (2018).

10. Rendina, G. "Técnicas de Bioquímica Aplicada". Ed. Interamericana.

México. pp. 264-266 (1974).

104
NOTAS Y CÁLCULOS

105
 PRÁCTICA No 11
REACCIONES ENZIMÁTICAS DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Todas las manifestaciones vitales requieren energía, la cual se obtiene de la

oxidación gradual de los alimentos a través de reacciones de óxido-reducción,
es decir, reacciones en las cuales se transfieren electrones o hidrógenos desde
un compuesto, el donador de electrones o agente reductor, a un aceptor de
electrones o agente oxidante.

Las grandes cantidades de energía que liberan las reacciones biológicas de

óxido reducción constituyen de hecho la principal fuente de energía disponible
para el trabajo de la célula.

El ATP es el portador intermediario de energía entre las oxidaciones biológicas

que la liberan y los diversos sistemas que la utilizan.

Las reacciones de óxido-reducción llevadas a cabo por la célula son catalizadas

por enzimas que actúan como intermediarios hasta llegar al aceptor final de
electrones que es el oxígeno.

OBJETIVO

Determinar la actividad de algunas enzimas que participan en reacciones de

óxido-reducción y discutir la importancia de los cofactores y en su caso el efecto
sobre la velocidad de reacción de estas cuando se encuentran en presencia de
algunos inhibidores.

MATERIAL Y EQUIPO

• Tubos de ensaye • Gradillas

• Pipetas de 1, 5 y 10 mL • Tubos de centrífuga
• Bureta de 25 mL • Centrífuga
• Vasos de precipitados • Recipientes para hielo
• Mortero y pistilo • Balanza granataria
• Equipo de disección • Algodón
• Matraz Erlenmeyer de 125 mL • Arena lavada
• Baño de agua atemperado 37 °C • Músculo esquelético, hígado, riñones y/o corazón
de rata o de pollo frescos o congelados.

106
 SOLUCIONES Y REACTIVOS

• Éter dietílico • Malonato de sodio 0.01 M, pH 7.0

• Agua destilada • KCN 0.75%
• NaCl al 0.9% • Azul de metileno 0.002 M
• Na2HPO4 0.06 M, pH 7.0 • p-fenilén-diamina 1 %, ó
• Lactato de sodio 1%, pH 7.0 N’,N’ dimetil-p-fenilén-diamina 0.5% en regulador
• Succinato de sodio 0.1 M, pH 7.0 de fosfatos 0.06 M, pH 7.0 (Prepararse al momento)
• Aceite vegetal • -naftol 0.15% en etanol

Nota: Trabajar la solución de cianuro de potasio (KCN) con MUCHA

PRECAUCIÓN, por lo cual ESTRICTAMENTE debe utilizar propipeta, ya que es
una sustancia altamente tóxica → POTENTE INHIBIDOR DE LA RESPIRACIÓN
CELULAR.

PROCEDIMIENTO

1. OBTENCIÓN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LÁCTICA “LDH” – NAD+

A. Obtención de la coenzima NAD+

a) Sacrificar una rata con éter dietílico y obtener 6 g de músculo de las patas
traseras. Se puede utilizar músculo previamente congelado. Se pueden utilizar
músculo esquelético de pollo o hígado, mantenidos en frío y deben ser pesados.

b) Cortar el músculo esquelético o hígado en fragmentos pequeños.

c) Colocarlos en un matraz Erlenmeyer con 24 mL de agua.

d) Hervir durante 5 minutos y ajustar con agua destilada al volumen original.

e) Pasar el contenido del matraz Erlenmeyer a un mortero que contenga

aproximadamente 1 g de arena y triturar el órgano hasta obtener un
homogenizado.

f) Centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos.

g) Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "Coenzima NAD+".

h) Desechar el precipitado en una bolsa de plástico para llevarlo al incinerador.

B. Obtención de la deshidrogenasa láctica (LDH)

a) Sacrificar una rata con éter dietílico y obtener 6 g de músculo esquelético de

107
las patas traseras. También se puede utilizar músculo de piernas de pollo o
hígado de pollo fresco o previamente congelado.

b) Cortar el músculo esquelético o hígado en fragmentos pequeños y colocarlos

en un mortero previamente sumergido en hielo.

c) Adicionar en el mortero 4 mL de NaCl 0.9 % (solución fisiológica) por gramo

de órgano pesado y aproximadamente 1 g de arena.

d) Triturar el músculo esquelético o hígado en frío hasta la obtención de un

homogenizado.
e) Centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos.

f) Desechar el precipitado en una bolsa de plástico para llevarlo al incinerador.

g) Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "LDH".

2. OBTENCIÓN DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA "SDH" Y

CITOCROMO OXIDASA.

a) Sacrificar una rata con éter y obtener el corazón. Se pueden usar corazones
previamente congelados, de rata o de pollo.

b) Partir el corazón a la mitad, lavarlo con agua fría hasta que quede libre de
coágulos pesarlo y después cortarlo en fragmentos pequeños.

c) Colocar los fragmentos en un mortero previamente sumergido en hielo, y

adicionar 25 mL de Na2HPO4 0.06 M pH 7.0, y aproximadamente 1 g de arena.

d) Triturar el corazón en frío.

e) Centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos.

f) Recuperar el sobrenadante, completar al volumen necesario con solución de

fosfatos, y etiquetarlo como "SDH-Cit".

g) Desechar el precipitado en una bolsa de plástico para llevarlo al incinerador.

108
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DESHIDROGENASA
LÁCTICA

a) Preparar una serie de 5 tubos según se indica en la siguiente tabla. Observar

a los tiempos indicados y registrar anotando en el cuadro el grado de
decoloración.

TABLA 1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA DESHIDROGENASA

LÁCTICA
TUBO No. 1 2 3 4 5

Lactato 1% (mL) 1.00 1.00 0.00 1.00 1.00

KCN 0.75% (mL) 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00

Azul de metileno 0.002 M (mL) 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30

Agua (mL) 0.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Coenzima NAD+ (mL) 1.00 0.00 1.00 1.00 1.00

LDH (mL) 1.00 1.00 1.00 0.00 1.00
Mezclar y mantener en hielo

Aceite vegetal (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

No agitar los tubos

Incubar a baño maría a 37º C

0 min (Observación inicial)

2 min

5 min

7 min

10 min

15 min

20 min

30 min
Nota: Iniciar las lecturas en los tiempos indicados cuando ya se observe
decoloración en el tubo núm. 1.

109
Figura 1. Reacción de la Lactato deshidrogenasa (Deshidrogenasa láctica).
Se muestra la reacción enzimática (Sustratos, productos y cofactores) con la
subsecuente formación de la cianhidrina del piruvato que permite que el equilibrio
de la reacción enzimática se desplace hacia la producción de NADH + H +. Se
pone de manifiesto la actividad de la enzima a través de la reducción del azul de
metileno, como se muestra en la Figura 5.

Figura 2. Reacción de óxido – reducción del dinucleótido de nicotinamida

adenina. El NAD+ se reduce a NADH debido a la transferencia de un hidruro al
anillo de nicotinamida.

110
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DESHIDROGENASA
SUCCÍNICA

a) Preparar una serie de 7 tubos de acuerdo con lo indicado en la tabla siguiente.

Observar a los tiempos indicados y registrar anotando en el cuadro el grado de
decoloración.

TABLA 2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE DESHIDROGENASA

SUCCÍNICA
TUBO No. 1 2 3 4 5 6 7

Succinato de sodio 0.1 M (mL) 0.50 0.50 0.00 0.50 0.50 0.50 1.00

Azul de metileno 0.002 M (mL) 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30

Malonato de sodio 0.01 M (mL) 0.00 0.00 0.00 1.00 0.50 0.25 0.25

Agua (mL) 1.00 3.00 1.50 0.00 0.50 0.75 0.25

SDH-CIT (mL) 2.00 0.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00

Mezclar y mantener en hielo hasta agregar:

Aceite vegetal (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

No agitar los tubos

Incubar a baño maría a 37º C

0 min (Observación inicial)

2 min

4 min

6 min

8 min

10 min

15 min

20 min

111
Figura 3. Reacción de la Succinato deshidrogenasa (Deshidrogenasa
succínica). Se muestra la reacción enzimática (Sustratos, productos y
cofactores). Esta reacción da lugar a la reducción del grupo prostético de la
enzima (FADH2) lo que permite poner de manifiesto la actividad de la enzima
acoplarse a la reducción del azul de metileno, como se muestra en la Figura 5.

Figura 4. Reacción de óxido – reducción del dinucleótido de flavina. El FAD

es una coenzima que interviene como dador o aceptor de electrones y protones
en reacciones metabólicas; su estado oxidado (FAD) se reduce a FADH 2 al
aceptar dos átomos de hidrógeno (cada uno formado por un electrón y un
protón).

112
Figura 5. Reacción de óxido – reducción del Azul de metileno. La actividad
de varias oxido-reductasas puede ser evidenciada a través de indicadores
coloridos de óxido-reducción como el Azul de metileno. Tanto el NADH como el
FADH2 poseen la capacidad de dirigir sus electrones al Azul de metileno dando
como resultado una especie en su forma incolora o Leuco de este indicador.

Figura 6. Reacción del sistema de Citocromos: Citocromo C y Citocromo C

oxidasa. El donador de electrones en la reacción es la p-feniléndiamina que una
vez oxidada (p-feniléndiimina) se puede polimerizar a pigmentos color café (no
se muestra) o bien se condensa con el alfa naftol para producir un compuesto
colorido denominado azul de indofenol.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE CITOCROMOS:

CITOCROMO C Y CITOCROMO C OXIDASA

a) Preparar una serie de 8 tubos de acuerdo con la tabla siguiente. Hacer

observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro los cambios de
color de las soluciones.

113
TABLA 3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL SISTEMA DE
CITOCROMOS: CITICROMO C Y CITOCROMO C OXIDASA
TUBO No. 1 2 3 4 5 6 7 8

KCN 0.5% (mL) 0.0 0.0 1.0 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0

 - naftol 0.15% (mL) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1

Agua (mL) 1.1 2.1 0.1 2.1 1.0 2.0 0.0 1.0

SDH-CIT (mL) 1.0 0.0 1.0 1.0 1.0 0.0 1.0 0.0

Mezclar

Leer color antes de iniciar la reacción

p-fenilén diamina 1%
1.0 1.0 1.0 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(recién preparada) (mL)
Incubar a baño maría a 37º C
0 min (Observación
inicial)
1 min

2 min

4 min

6 min

8 min

10 min
NOTA: Puede utilizarse solución recién preparada de N’, N’ dimetil-p-fenilén
diamina al 0.5% en lugar de p-fenilén diamina al 1% .

INFORME

1.- Introducción.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tablas.
4.- Escribir con fórmulas las reacciones que se efectuaron en esta práctica.
5.- Interpretación de cada tubo y global de cada serie.
6.- Conclusiones.
7.- Bibliografía.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) NaCl 0.9%.- Pesar 0.9 g de NaCl y llevar a 100 mL con agua destilada.

114
2) KCN 0.75%.- Pesar 0.75 g de KCN y llevar a 100 mL con agua destilada (dosis
tóxica 4.3 mg/Kg de peso).

3) Lactato de sodio 1%.- Pesar 1 g de lactato de sodio y llevar a 100 mL con

agua destilada. Debe tener pH 7.0. (En ausencia de lactato de sodio éste se
puede preparar a partir de ácido láctico y neutralizando la solución con
bicarbonato de sodio sólido, hasta pH 7.0).

4) Azul de Metileno 0.002 M.- Pesar 0.747 g de azul de metileno y llevar a 1000
mL con agua destilada.

5) Na2HPO4•12H2O 0.06 M.- Pesar 21.36 g de fosfato disódico y llevar a 1000

mL con agua destilada. Ajustar a pH 7.0.

6) Succinato de sodio 0.1 M.- Pesar 11.8 g de ácido succínico y llevar a 1000 mL
con agua destilada. Neutralizar la solución con bicarbonato de sodio sólido hasta
pH 7.0.

7) Malonato de sodio 0.01 M.- Pesar 1.04 g de ácido malónico y llevar a 1000
mL con agua destilada. Neutralizar la solución con bicarbonato de sodio sólido
hasta pH 7.0.

8) p-fenilén-diamina (base) 1%.- Pesar 0.4 g de p-fenilén-diamina y llevar a 40

mL con solución de fosfatos 0.06 M pH 7.0 (DEBE PREPARARSE AL
MOMENTO DE USARSE Y ESTAR A pH NEUTRO).

9) -naftol 0.15%.- Pesar 0.15 g de alfa-naftol y llevar a 100 mL con alcohol etílico
95%.

BIBLIOGRAFÍA

1. Conn, E. E., Stump P. K., Bruening G., Doi R.H., “Bioquímica Fundamental,
Editorial Limusa Wiley S.A., 4a Ed., pp. 417- 433, 475- 506 (2004)

2. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger Principios de Bioquímica” Editorial Omega,

3ª. Edición, pp. 527- 544, 567- 591, 659- 690, (2001).

3. Rendina, G. “Técnicas de Bioquímica Aplicada”. Ed. Interamericana. pp. 235-

249. (1974).

4. Alexander R.R, Griffiths J.M., Wilkinson M.L., “Basic Biochemical Methods”

Editorial John Wiley & Sons. Inc. 10a Ed. pp. 102- 115 (1984)

5. Murray R.K., Mayes P.A., Rodwell V.W., “Harper’s Ilustrated Biochemistry”

115
Editorial Lange Medical Books/ McGraw-Hill. 26a Ed. pp. 51, 64-70, 93-95. (2003)

116
NOTAS Y CÁLCULOS

117
 PRÁCTICA No 12
AISLAMIENTO DEL DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU
CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTÓMETRICA

INTRODUCCIÓN

El ácido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en inglés) es una

macromolécula formada por desoxirribonucleótidos de cuatro bases
nitrogenadas distintas unidos por un enlace fosfodiéster y organizados en una
secuencia que es característica para cada organismo y que consta,
generalmente de dos cadenas antiparalelas. El material genético de las células
procariotas es una gran molécula de DNA, dispuesta de modo compacto en una
zona nuclear o nucleoide. Las células eucariotas contienen muchas moléculas
de DNA y se hallan organizadas en la fibra de cromatina en el interior del
organelo llamado núcleo.

Figura 1. Esquema de una célula vegetal

Las funciones del DNA consisten en almacenar la información genética completa

necesaria para especificar la estructura de todas las proteínas y en cada una de
las clases del RNA del organismo, en programar, tanto en el tiempo como en el
espacio, la biosíntesis ordenada de los componentes de las células y de los
tejidos, en determinar la actividad de un organismo a lo largo de su ciclo vital y
finalmente, en definir la individualidad de un organismo dado.

En el aislamiento de ácidos nucleicos debe tenerse en cuenta lo siguiente:

1.- Debe romperse eficientemente la pared (si las células del organismo en
estudio tienen esta estructura) y membrana celular para facilitar la extracción del
ácido nucleico deseado.
2.- Se debe trabajar en condiciones que inhiban las nucleasas (enzimas que
degradan ácidos nucleicos) liberadas durante el proceso de lisis celular.
El método utilizado en esta práctica involucra el rompimiento de la pared y la
118
membrana celular, inhibición de nucleasas, precipitación de DNA impuro,
disociación de proteínas del DNA y reprecipitación del DNA ya purificado.

OBJETIVO

Aislar, purificar y caracterizar DNA de tejido vegetal.

MATERIAL

Mortero con pistilo Gasa (manta de cielo) o tela magitel

Vasos de precipitados de 250 mL Cuchara de plástico
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Matraz Erlenmeyer de 250 mL
Pipetas Pasteur Agitador de vidrio
Tubos de centrífuga de 50 mL de
polipropileno

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Cloruro de sodio (NaCl) sólido EDTA 1M pH 8.0

Tris 0.4 M, pH 8.5 Cloroformo: alcohol isoamílico (24:1)
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 4% Etanol absoluto
Solución concentrada de citrato salina SSC diluida 1:1000
(SSC)
Tris/EDTA/NaCl (50 mM:20 mM: 5 Amilasa (100 mg/mL)
mM).

PROCEDIMIENTO

1.- AISLAMIENTO DE DNA DE ESPINACA O GUAYABA

a) Colocar 15 g de guayaba o de hojas de espinaca en un mortero. Adicionar 5

mL de Tris/EDTA/NaCl (50 mM:20 mM: 5 mM). Triturar durante 3 a 5 minutos.

b) Adicionar 0.3 mL de amilasa (100 mg/mL). Mezclar e incubar 10 minutos a

temperatura ambiente. Agitar ocasionalmente.(Nota: este paso se recomienda
cuando el tejido es rico en almidón como semillas, tubérculos u hojas de cítricos).

c) Agregar 10 mL de una solución saturada de NaCl y 5 mL de SDS al 10%.

Seguir triturando durante 5 minutos.

d) Filtrar el homogeneizado a través de tela sintética (“magitel”) en un embudo y

recuperando el filtrado (aproximadamente 10 mL) en un tubo Falcon de 50 mL.
Nota: No exprimir con las manos.

e) Adicionar 15 mL de la mezcla cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) (mantenido

en frio para mejores rendimientos). Tapar el tubo y agitar vigorosamente por 30
segundos.
119
f) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos.

g) Recuperar la fase superior con una pipeta Pasteur con bulbo, EVITANDO
tocar la fase de proteínas (interfase).

h) Verter el sobrenadante a un frasco que contenga 30 mL de alcohol 96° frío.

i) Recuperar el DNA, de ser posible enrollándolo en una varilla de vidrio.

j) Dejar escurrir la mayor cantidad de alcohol 96° y disolver el DNA en un tubo

que contenga 2 mL de una solución citrato salina diluida.

k) Hacer una dilución 1:10 con la solución citrato diluida y determinar el espectro
de absorción característico del DNA.

2.-ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL DNA DE ESPINACA O GUAYABA

a) Leer la absorbancia (A) en el espectrofotómetro en un rango de longitud de

onda (λ) de 200 a 300 nm en intervalos de 5 nanómetros, calibrando el equipo
con la solución citrato salina diluida.

b) Si la absorbencia a 260 nm (A260) es mayor que 1.0, preparar una dilución tal
que la A260 sea 1.0 o ligeramente menor.

c) Con estos datos, construir una gráfica de absorbancia contra longitud de onda,
en nanómetros.

d) Calcular la concentración del DNA obtenido en µg/mL mediante la siguiente

relación, tomando en cuenta el usar una cubeta con paso de luz de 1 cm.

[ADN]= 50 µg/mL x A260 x Factor de dilución

Nota: una solución de DNA bicatenario de 50 µg/mL en una cubeta con un paso
de luz igual a 1 cm, produce una A260 de 1.0

e) Determinar la pureza del DNA aislado mediante la relación de absorbancias

A260/A280. Un ADN puro se considera cuando la relación de absorbancias es igual
a 1.8, si es menor a este valor se considera contaminado con proteínas y otros
compuestos con grupos aromáticos como fenoles, polifenoles (por ejemplo,
lignina en el caso de material vegetal o compuestos fenólicos relacionados a
defensa derivado del estrés producido al tejido durante la extracción).

f) Determinar, con ayuda del nomograma anexo, la concentración de DNA en su

muestra. Este es otro método utilizado para determinar la concentración del DNA
si se conocen las absorbancias a 260 y 280 nanómetros.

120
g) También puedes considerar que una unidad de absorbencia de DNA de doble
cadena es equivalente a 50 microgramos /mL

TABLA 1. DATOS DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA

LONGUITUD DE ONDA(nm) ABSORBANCIA
200
205
210
215
220
225
230
235
240
245
250
255
260
265
270
275
280
285
290
295
300

121
122
INFORME

1. Objetivo
2. Diagrama de flujo del procedimiento de obtención del DNA.
3. Interpretación de cada paso efectuado en la obtención del DNA.
4. Espectro de absorción del DNA.
5. Cálculo de la concentración del DNA obtenido, en µg/mL tomando en cuenta
la fórmula sugerida en este procedimiento.
6. Determinación de la concentración del DNA obtenido, en mg/mL, con ayuda
del nomograma.
7. Conclusiones
8. Pregunta extra
9. Bibliografía

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Solución de tris-sacarosa-cloruro de magnesio.- Tris 0.01 M (PM 121.14

g/mol); sacarosa 0.3 M (PM 342.30 g/mol); MgCl2 (PM 203.30 g/mol). Pesar 1.21
g de tris, 102.66 g de sacarosa y 1.016 g de MgCl2 y disolver en 1000 mL de
agua destilada en un matraz aforado.

2) Solución de tris 0.4 M, pH 8.5.- Pesar 24.22 g de tris y disolverlo en

aproximadamente 450 mL de agua destilada en un matraz aforado, ajustar a pH
de 8.5 y aforar.

3) Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 4%.- Pesar 20 g de dodecil sulfato de sodio

(SDS) y llevar a 500 mL de agua destilada.

4) Solución de EDTA salina, pH 8.0.- EDTA 0.1 M (PM 292.25 g/mol); cloruro de
sodio (NaCl) 0.15 M (PM 58 g/mol). Pesar 2.922 g de EDTA y 0.87 g de NaCl y
disolver en 80 mL con agua destilada. Ajustar el pH a 8.0 y llevar a 100 mL con
agua destilada en un matraz aforado.

NOTA: Disolver el EDTA añadiendo NaOH concentrado y ajustar a pH de 8.0.

5) Solución concentrada de citrato-salina.- Citrato de sodio 0.15 M (PM 294.10

g/mol); cloruro de sodio 1.5 M (PM 58 g/mol). Pesar 11.028 g de citrato de sodio
y 21.75 g de cloruro de sodio y disolver en 250 mL de agua destilada en un
matraz aforado.

6) Solución diluida de citrato salina.- Preparar una dilución 1:1000 de la solución

anterior. Mezclar 1 mL de la solución salina citrato concentrada con 999 mL de
agua destilada.

7) Mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1).- Mezclar 24 mL de cloroformo

con 1 mL de alcohol isoamílico usando una probeta de vidrio, se recomienda
mantenerlo en frio.

NOTA: Esta solución se prepara en el momento de usarse.

123
BIBLIOGRAFÍA
1. Alemany. M., Font, D. "Prácticas de Bioquímica". Ed. Alhambra. Madrid. pp.
285-289 (1983).

2. Rawn, J. D. "Bioquímica". Vol. II. Mc Graw Hill. Interamericana. Madrid. pp

665-700 (1989).

3. Bohinski, R. C. "Bioquímica". 5a. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana.

Argentina. Brasil. pp. 227-242 (1991).

4. Alexander R.R, Griffiths J.M., Wilkinson M.L., “Basic Biochemical Methods”

Editorial John Wiley & Sons. Inc. 10a Ed. pp. 16- 17, (1984)

5. Voet D., Voet J.G., “Biochemestry” Editorial John Wiley & Sons, Inc., 3a Ed.
pp1107- 1116, (2004).

124
NOTAS Y CÁLCULOS

125
 PRÁCTICA No 13
HIDRÓLISIS DE RNA Y DNA E IDENTIFICACIÓN DE BASES
PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA

INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos se encuentran en las células desempeñando las funciones

de almacenamiento y transmisión de la información genética.
Los ácidos nucleicos, al igual que las proteínas son biopolímeros de alto peso
molecular constituidos por nucleótidos, los cuáles se encuentran unidos entre sí
por enlaces covalentes denominados enlaces fosfodiéster. Un nucleótido está
formado por una base heterocíclica nitrogenada derivada de la purina o de la
pirimidina, de un azúcar pentosa y de un grupo fosfato. Dependiendo del tipo de
nucleótido existen dos clases de ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico
(DNA) y ácido ribonucleico (RNA).
El DNA está formado por desoxirribonucleótidos cuya base nitrogenada puede
ser adenina, guanina, citosina o timina, y el azúcar 2-desoxi-D-ribosa y el grupo
fosfato. Mientras que el RNA está formado por ribonucleótidos cuya base
nitrogenada puede
ser adenina, guanina, citosina o uracilo, y el azúcar D-ribosa y el grupo fosfato
(Figura 1).

Figura 1. Fórmulas de desoxirribonucleótidos del DNA

En presencia de ácidos minerales fuertes y concentrados, los ácidos nucleicos

se hidrolizan liberando las bases nitrogenadas, el azúcar y el grupo fosfato. Las
bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos absorben fuertemente luz ultravioleta
en la región 260-280 nm. La longitud de onda de máxima absorción de mezclas
de las bases comunes es aproximadamente de 260 nm. Esta propiedad es de
126
gran utilidad en la detección y análisis cuantitativo no solo de las bases libres
sino también de los nucleósidos, nucleótidos y moléculas de ácidos nucleicos
intactas.

OBJETIVO

Separar las bases nitrogenadas del DNA y del RNA por cromatografía en capa
fina a partir de hidrolizados de los mismos, identificándolas por la propiedad que
tienen de absorber luz ultravioleta.

MATERIAL

Tubos de tapón de rosca Tijeras, lápiz, y regla

Autoclave Capilares
Estufa
Cromatoplacas Pipetas de 1 ml
Cámara de cromatografía Cuarto obscuro
Lámpara de luz ultravioleta Secador de aire caliente
Placa de calentamiento Vasos de precipitados de 100 mL

SOLUCIONES Y REACTIVOS

DNA 5 mg/mL Citosina 2 mg/mL

RNA 2.5 mg/mL Guanina 2 mg/mL
HCl 2N y 6N Timina 2 mg/mL
Isopropanol Uracilo 2 mg/mL
Adenina 2 mg/mL

PROCEDIMIENTO

1. HIDRÓLISIS ÁCIDA DEL DNA Y RNA

a) Preparar dos tubos de tapón de rosca de la siguiente manera:

0.5 mL de solución de DNA 5mg/mL + 0.2 mL de HCl 6 N

0.5 mL de solución de RNA 2.5mg/mL + 0.2 mL de HCl 6 N

b) Hidrolizar en autoclave el DNA y el RNA a 15 lb/pulg 2 durante 12 horas en 3

ciclos de 4 horas cada uno

c) Colocar el contenido de los tubos en vasos de precipitados y evaporar casi a

sequedad en una placa de calentamiento

127
2A. PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA EN CAPA FINA

A 1 cm de distancia de uno de los extremos de la placa cromatográfica y de

manera equidistante, colocar 2 a 3 aplicaciones de cada solución (adenina,
guanina, citosina, timina y uracilo) y 2 a 3 aplicaciones de los hidrolizados de
DNA y RNA, dejando secar después de cada aplicación y teniendo cuidado de
no perforar la capa de sílica.

2B. DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA

Desarrollar la placa en la cámara de cromatografía, utilizando como fase móvil

la mezcla butanol: ácido acético: agua (5: 2: 3 v/v/v).

3. REVELADO DEL CROMATOGRAMA

a) Revelar el cromatograma por exposición a la luz ultravioleta en un cuarto

obscuro, exponiéndose la persona el menor tiempo posible a la radiación y
protegiéndose los ojos con lentes de vidrio.

b) Circunscribir las manchas de cada una de las muestras y calcular los Rf

correspondientes.

INFORME
1. Introducción
2. Objetivo
3. Esquema a escala del cromatograma obtenido
4. Resultado de los Rf en forma de tabla
5. Discusión
6. Conclusiones
7. Preguntas extra
8. Bibliografía

128
PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) DNA 5 mg/mL. Pesar cuidadosamente 250 mg de DNA y disolverlo con

agitación en 50 mL de NaCl 0.15 M.

2) RNA 2.5 mg/mL .Pesar cuidadosamente 125 mg de RNA y disolverlos con

agitación en 50 mL de NaCl en 0.15 M.

3) Cloruro de sodio 0.15 M. Pesar 8.7 g de NaCl y llevar a 1000 mL con agua
destilada.

4) Adenina, guanina, timina, uracilo y citosina 2 mg/mL. Pesar 10 mg de la base

correspondiente y disolverla por separado en 5 mL de HCl 0.1 N.

5) Ácido clorhídrico 0.1 N. Tomar 8.35 mL de HCl concentrado (densidad 1.18,

pureza 37%) y llevar a 1000 mL de agua destilada.

6) Ácido clorhídrico 2 N. Tomar 166 mL de HCl concentrado (densidad 1.18,

pureza 37%) y llevar a 1000 mL de agua destilada.

7) Ácido clorhídrico 6 N. Tomar 498 ml de HCl concentrado (densidad 1.18,

pureza 37%) y llevar a 1000 mL de agua destilada.

8) Isopropanol-HCl 2 N (1:1, v/v). Mezclar 1 volumen de HCl 2 N con un volumen

igual de isopropanol.

BIBLIOGRAFÍA

1. Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger Principios de Bioquímica” 3ª. Edición.

Editorial OMEGA, pp. 325-345 (2001).

2. Mathews C.K., Van Holde K.E., “Bioquímica” 2ª Ed. Editorial McGraw-Hill-

Interamericana, pp. 94-109 (1998).

3. Campbell M.K., Farrel S.O., “Bioquímica”. 4a. Edición. Thomson Editores,

pp.228- 252 (2004).

129
NOTAS Y CÁLCULOS

130
 PRÁCTICA No 14
AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO

INTRODUCCIÓN:

Los plásmidos son moléculas circulares de DNA extracromosomal que se

replican de manera independiente al cromosoma de la célula hospedera, tienen
uno o más genes que codifican para proteínas que confieren ventajas selectivas
al hospedero, como la resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se encuentran
en las bacterias en diferentes tamaños que oscilan entre 2,000 y 400,000 pb
(Figura 1).

Figura 1. Plasmidos. Imagen tomada “Concepto de plásmido” de National Human Genome

Research Institute. [Link] 8 de Julio 2022.

Los plásmidos naturales a menudo tienen características que los hacen ideales
para el desarrollo de vectores que pueden ser introducidos en las bacterias por
un proceso denominado transformación. En la biotecnología, los plásmidos se
utilizan como vectores para la clonación de fragmentos de DNA de interés y
como sistemas de expresión de genes por lo que su aislamiento y caracterización
es una de las técnicas importantes en esta rama de la ciencia.

Se han desarrollado diferentes vectores para la clonación mediante la

modificación de plásmidos. El plásmido pUC19 muestra algunas características
importantes de un vector de clonación: a) contiene un origen (ORI) de replicación
para propagar el plásmido, b) gene que confiere resistencia a un antibiótico para
la selección de bacterias que contengan el plásmido (AmpR) y 3) sitios únicos
de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción, donde se puede cortar
el plásmido para insertar las secuencias de DNA a estudiar.

131
 What is a Plasmid? - Plasmids 101
[Link]
[Link]

Plásmido pUC19
pUC19 es un vector de clonación creado por Joachim Messing. La designación
"pUC" se deriva del prefijo "p" (plásmido) y la abreviatura “UC”de la Universidad
de California, donde se realizaron los primeros experimentos en plásmidos y el
número corresponde a la serie. Es un DNA circular de doble cadena y tiene 2,686
pb (Figura 2).

Figura 2. Mapa del plásmido pUC19, imagen tomada de Addgene

[Link]

OBJETIVO

Aislar DNA plasmídico bacteriano mediante una lisis alcalina y evidenciarlo por
una electroforesis en gel de agarosa.

132
MATERIAL

Tubos de 1.5 mL
Pipetas automáticas de volumen variable, de 5-50 μL, y de 50-200 μL.
Fuente de poder
Cámara de electroforesis
Peine para electroforesis
Documentador de geles
Vortex
Ultracentrífuga
Transiluminador

SOLUCIONES Y REACTIVOS

I.- Solución GTE

II.- SDS 1%-NaOH 0.2 N
III.- Acetato de potasio 5M
IV.- Isopropanol
V.- Regulador tris-EDTA (TE)
Bromuro de etidio (10 g/mL)
Agarosa 0.8%
Regulador de carga
Isopropanol
Regulador TBE 1X

PROCEDIMIENTO:

A) AISLAMIENTO DEL DNA PLASMÍDICO (MINI-PREP).

1. Se emplea a la bacteria Escherichia coli que contiene al plásmido pUC19.

2. Crecer las bacterias en medio Luria-ampicilina hasta fase logarítmica.
3. Centrifugar 1.5 mL del cultivo bacteriano en un tubo de 1.5 mL, a 13,000
rpm durante 5 min.
4. Desechar el sobrenadante y agregar 100 L de la solución I, resuspender
con vortex e incubar 5 min en hielo.
5. Agregar 200 L de la solución II y mezclar invirtiendo el tubo 3 o 4 veces
(con cuidado para no romper el DNA), posteriormente incubar 5 min en
hielo.
6. Agregar 150 L de la solución III, mezclar invirtiendo el tubo 3 o 4 veces
e incubar 5 min en hielo.
7. Centrifugar 5 min a 13,000 rpm y transferir el sobrenadante (que contiene
al plásmido) a un tubo limpio de tubo de 1.5 mL y agregar 500 L de la
solución IV y mezclar suavemente. Incubar 5 min en hielo.
8. Centrifugar 5 min a 13,000 rpm y desechar el sobrenadante. Eliminar

133
 completamente los residuos de la solución IV y agregar 10 l de la
solución V.
9. Resuspender suavemente con la micropipeta.

B) ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

La electroforesis es un método de separación de biomoléculas como el DNA o

RNA dependiendo de su tamaño, forma y carga. La electroforesis en ácidos
nucleicos es muy versátil, porque permite visualizar los fragmentos de DNA
directamente en el gel. El revelado del gel se lleva a cabo a través de la tinción
mediante el compuesto bromuro de etidio, este hace visible al DNA (fluórese)
mediante la emisión de luz ultravioleta.

1. Pesar un gramo de agarosa y disolverla en 100 mL regulador TAE 1X.

Calentar en baño maría o microondas hasta obtener una solución
homogénea y transparente.
2. La disolución se vacía en un molde (portageles) y se coloca un peine (el
peine forma unos pozos donde se depositan las muestras). Se deja enfriar
para polimerizar.
3. Retirar el peine y verificar que los pozos se encuentren bien delimitados
(Figura 3).
4. El DNA se deposita en los pozos del gel, el cual previamente debe mezclarse
con un regulador de carga. Tomar 5-10 L del DNA plasmídico obtenido y
mezclar con el regulador de carga (5-6 l). Esto permite: a) aumentar la
densidad de la muestra para depositarse en el fondo del pozo, b) teñir la
muestra para facilitar su carga dentro del gel y c) identificar la distancia
recorrida por las muestras.
5. El gel de agarosa se somete a una corriente eléctrica de 80 Volts durante 30
minutos, el DNA que tiene una carga neta negativa migrara hacia el ánodo
(polo positivo). La migración de las moléculas de DNA plasmídico variarán
dependiendo del tamaño y conformación molecular (lineal, circular,
superenrollado).
6. Sumergir el gel en bromuro de etidio (1 /mL) durante 10 minutos.
7. Eliminar el exceso de bromuro y exponer el gel en un transiluminador para
observar las bandas de DNA plasmídico.

134
Figura 3. Procedimiento y materiales para la polimerización de un gel de agarosa. 1. Se
coloca la bandeja en el caster gel. 2. Se caliente el buffer TAE o TBE con agarosa y se calienta,
cuando está disuelta la agarosa se deja enfriar un poco y se coloca en la bandeja. 3. Se deja
enfriar para polimerizar el gel. 4. Cuando el gel ha polimerizado se coloca dentro de la cámara
de electroforesis horizontal. 5. Se coloca el buffer de corrida, se carga el ADN, se tapa y conecta
a una fuente de poder entre 70-100 V/h. Imagen tomada de
[Link] Alberto Checa Rojas.
(2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa. 2022, Julio 13.

135
INFORME
1. Introducción.
2. Objetivo.
3. Resultados.
4. Interpretación de resultados
5. Discusión.
6. Conclusiones.
7. Preguntas extra.
8. Bibliografía.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1. Medio Luria. Pesar 15 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl

y mezclar en 1L de agua destilada. Esterilizar en una autoclave a 15 lb/pg2 de
presión durante 15 min. Suplementar el medio de cultivo con ampicilina (25
g/mL).

2. Regulador de Tris (100 mM)-EDTA (40 mM), pH 8. Pesar 12.11 g de Tris base
y 14.88 g de EDTA y disolver en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8 y
llevar a 1000 mL en un matraz aforado.

3. Solución I GTE (Glucosa 50 mM, Tris 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM).- Mezclar

en condiciones de esterilidad 5 mL de regulador Tris 100 mM-EDTA 40 mM y 1
mL de glucosa al 18% con 16 mL de agua estéril (todas las soluciones deben
estar estériles). Adicionar RNasa. Conservar en refrigeración.

4. Solución II NaOH 0.2 N-SDS 1%. Pesar 4 g de NaOH y disolver en 400 mL de

agua destilada. Adicionar 5 g de SDS y llevar a 500 mL en un matraz aforado de
500 mL

5. Solución III Acetato de potasio 5 M, pH 4.8. Pesar 245.35 g de acetato de

potasio anhidro y disolver en 450 mL de agua destilada, ajustar el pH a 4.8 con
HCl y llevar a 500 mL en un matraz aforado.

6. Glucosa al 18 %. Pesar 9 g de glucosa y llevar a 50 mL con agua destilada.

Esterilizar por filtración.

7. NaCl 0.15 M. Pesar 0.9 g de NaCl y disolver en 100 mL en un matraz aforado.

8. Regulador TAE 1X. Pesar 240 g. de tris base, adicionar 57.1 mL. de ácido
acético glacial y 100 mL de EDTA 0.5 M y llevar a 1000 mL con agua destilada.
(Esta solución se encuentra 50 veces concentrada.

9. Regulador de carga. Pesar 0.25 g de azul de bromofenol y disolver en 10 mL

de agua destilada, adicionar 30 mL de glicerol y llevar a 100 mL (Alicuotar en
tubos de 1.5 mL).

136
BIBLIOGRAFÍA

1. Voet D., Voet J.G., “Biochemestry” Editorial John Wiley & Sons, Inc., 3a Ed.
pp105- 112, 1285- 1290 (2004).

2. Campbell M.K., Farrel S.O., “Bioquímica”, Thomson Editores, 4a. Edición

pp.370-372, (2004).

3. McKee T. y McKee J. R. “Bioquímica” La Base Molecular de la Vida. Ed.

McGraw-Hill- Interamericana, pp. 37, (2003).

4. Ondarza R.N., “Biotecnología Básica” Editorial Trillas pp 59-60 (2002)

Información extra

Para completar tu conocimiento en Biología molecular, te recomendamos visitar

“Plásmidos en electroforesis”, donde encontraras información de toda la técnica
de aislamiento de DNA-plasmídico.

[Link]

137
 NOTAS Y CÁLCULOS

La siguiente imagen representa un gel de agarosa. Dibuje las estructuras que se

pueden encontrar en la técnica de “Aislamiento de DNA plasmídico” e indique el
nombre de cada isoforma y donde se encuentra el cátodo y el ánodo.

138
REGISTRO Y CONTROL DE ENTREGA DE INFORMES

Fecha Firma
Práctica de del Calificación Observaciones
entrega profesor

Determinación de aminoácidos terminales

con grupo alfa amino libre por el método
de Sanger
Reacciones de aminoácidos y proteínas

Precipitación, separación y punto

isoeléctrico de proteínas
Curvas de titulación de aminoácidos
(Titulaciones potenciométricas)

Curva de calibración de azúcares

reductores

Efecto de la concentración de enzima

sobre la velocidad de reacción/

Efecto del pH sobre la velocidad de

reacción

Efecto de la temperatura sobre la

velocidad de reacción

Efecto de la concentración del sustrato

sobre la velocidad de la reacción

Inhibición enzimática

Reacciones de carbohidratos

Obtención de glucógeno a partir de hígado

de rata y su caracterización química

Separación de fosfolípidos por

cromatografía en capa fina

Determinación de colesterol en la yema de

huevo

Reacción de transaminación y su
reconocimiento por medio de
cromatografía en papel
Reacciones enzimáticas de óxido-
reducción
Aislamiento del DNA de origen vegetal y
su caracterización espectrofotométrica
Hidrólisis de RNA y DNA e identificación
de bases púricas y pirimidinas por
cromatografía en capa fina
Aislamiento de DNA plasmídico

139