GUÍA 1: SEPARACIÓN DE AMINOÀCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA
DELGADA
I. EL PROBLEMA
Usar la técnica de cromatografía en capa delgada (CCD) para separar e identificar
los aminoácidos de un extracto por su diferente afinidad por las fases móvil y
estacionaria.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Cromatografía en capa fina
Esta técnica se define como un método de separación relativamente rápido,
basado en la distribución selectiva de las sustancias a separar, entre dos fases
inmiscibles, denominadas FASE ESTACIONARIA y FASE MÓVIL. Las dos fases
deben permanecer en contacto, pero no se deben mezclar. Con base en lo
anterior, la denominada FASE ESTACIONARIA, normalmente es un material
SÓLIDO granulado , poroso y adsorbente sobre una delgada capa de un soporte
de vidrio, metal u otro material inerte, y la FASE MÓVIL es un LÍQUIDO
constituido por un solvente o mezcla de solventes .Estas características del
sistema cromatográfico, lo hacen altamente eficiente para separar mezclas de
sustancias que tienen gran semejanza en su estructura química y sean afines con
las dos fases del sistema, lo cual no es posible por otros métodos como el de
destilación o extracción con solventes ya estudiados en cursos previos. La
separación se fundamenta en diferentes principios como la absorción, adsorción,
reparto y arrastre mecánico, de tal manera que se establece una competencia
entre las dos fases por las sustancias a separar, la fase móvil "lavará" a estas con
diferente eficiencia, de modo que aquellas que "prefieren disolverse" en la fase
móvil se moverán rápido, mientras las que sean preferencialmente solubles en la
fase estacionaria se moverán menos. Existen diferentes tipos de cromatografía:
sobre papel, en capa delgada (CCD), también llamada TLC (de la sigla en inglés
para thin layer chromatography), en columna, cromatografía de gases y
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC de la sigla en inglés).
III. MATERIALES Y REACTIVOS
1. CROMATOGRAFÍA
TRAER LÁPIZ DE GRAFITO (no portaminas) , MARCADOR PERMANENTE,
TRAPO Y REGLA EL DÍA DE LA PRÁCTICA
TRAER MASCARILLA CON FILTRO PARA SOLVENTES, ÉSTA SE COLOCA
MIENTRAS SE ABRA LA CÁMARA
Materiales
3 Cámaras para cromatografía (para todos los grupos de laboratorio)
1 Placa de celulosa por grupo de laboratorio
10 Tubos capilares para aplicación de muestras
1 pipeta graduada de 10 mL
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
2 probetas de 100 mL
1 espátula
Perlas de ebulliciòn
Muestras para extracción( solo debe hacer un extracto o dos según le corresponda
y le entregue el monitor):
Espinaca
Bebida de soya
Propoleo
Harína de alpiste
Harína de quinua
Gaseosa seven up
Agua de coco
Reactivos
El volumen del solvente requerido depende del tamaño y número de las cámaras
de revelado que se dispongan para la práctica.
Solventes (fase móvil): butanol-acetona-ácido acético-agua ([Link])
300 mL solución reveladora de ninhidrina en etanol y acidulada (PREPARADA EL
MISMO DÍA)
50 mL Soluciones patrón de los siguientes aminoácidos:glutamina, glicina,
cisteína, treonina,tirosina, valina, histidina, triptófano, leucina, acido aspártico,
lisina, metionina, prolina, serina, ácido glutámico, arginina, cisteína, asparragina,
fenilalanina, isoleucina y alanina. (Ver método de preparación)
Cinco bandejas de metal grandes (o de disección) para adicionar la Ninhidrina.
IV. PROCEDIMIENTO
CROMATOGRAFÍA
Precauciones: use guantes y gafas durante toda la práctica, colóquese la
mascarilla al abrir la cámara, mantener la cámara de cromatografía tapada y
cuando sea necesario destaparla hágalo rápidamente y tape de nuevo. Una vez
puestas las placas en la cámara NO LA MUEVA DE SU LUGAR.
Para la extracción de aminoácidos a partir de muestras vegetales puede usar las
siguientes técnicas:
Extracción etanólica de aminoácidos presentes en espinaca, harinas, propoleo o
bebida de soya
Pese en un vidrio de reloj 5 g de material seco (y finamente picado solo en el caso
de la espinaca), transfiéralo completamente a un mortero y realice varias
extracciones, cada una con una pequeña porción de etanol hasta completar 30mL
de etanol al 70%. Centrifugue los extractos etanólicos y reúnalos en un vaso de
precipitados de 100 mL, luego al baño maría o directamente en un pequeño vaso
de precipitados ( con perlas de ebulliciòn)evapore el etanol hasta una cuarta parte
del volumen original (marque el nivel inicial con marcador y esté siempre
pendiente para no secar la muestra), y guarde cuidadosamente.
Manejo de agua de coco y gaseosa seven up
Coloque el vaso de precipitados con la muestra directamente sobre placa elèctrica
( con perlas de ebulliciòn), marque el nivel con el marcador permanente y evapore
hasta una cuarta parte del volumen original (esté siempre pendiente para no
secar la muestra) y guarde cuidadosamente.
SOLO PARA EL MONITOR: Método de preparación de los patrones de
aminoácidos
Preparar las soluciones de los siguientes aminoácidos patrones, suspendiendo 1
mg (0,99) de cada aminoácido en 2,5 mL de solución metanol:agua (50:50, v/v) a
pH 1,7. Calcular que la solución de cada aminoácido patrón sea del 39,6 % (m/v).
Coloque 10mL de la fase móvil (mezcla de solventes) en cada una de las
cámaras, tápelas y déjelas en reposo mientras prepara las cromatoplacas.
Preparación de las cromatoplacas
Tome una cromatoplaca e identifique la parte donde está la celulosa (fase
estacionaria), con un lápiz trace una línea a 1,5cm del borde inferior; (Observe
las figuras 3 y 4) esta será la línea de siembra. Según las instrucciones del
profesor aplique con un tubo capilar sobre las líneas de siembra, cinco gotas del
extracto etanólico preparado en el procedimiento anterior (espinaca) y tres gotas
de cada uno de los aminoácidos patrón en el lugar correspondiente; seque la
placa en la estufa. Una vez hayan secado las gotas aplicadas, introduzca lo más
rápidamente posible con cuidado y de manera perpendicular la placa en la cámara
de cromatografía que contiene la fase móvil, tape la cámara. Cerciórese que los
solventes hayan quedado por debajo de la línea de aplicación y deje que
asciendan por la placa hasta el límite superior de la misma. Una vez hayan
ascendido completamente, seque en la estufa a 100ºC, pase la placa por la
bandeja con la solución reveladora de Ninhidrina y seque nuevamente a la misma
temperatura por cinco minutos o hasta que desarrolle el color. Encierre las todas
las manchas con lápiz, marque el centro de las mismas. Calcule el Rf como se
indica en la figura 3. Marque las placas y envuélvalas en película plástica para
entregarlas con el informe.
[Link]ÌA
Bohinski. Robert. 2019. Bioquímica. 5ed. México: Pearson.
Brieger, Gottfried. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de
Laboratorio. España: Harper y Row Publishers INC.
Daniels, Farrintong. 1972. Curso de Fisicoquímica Experimental. Centro Regional
de Ayuda Técnica AID. España: McGraw-Hill.
Fessenden, Ralph y Joan S. Fessenden. 2002. Química orgánica. México:
Interamericana.
Feduchi C, Elena., Romero M, Carlos., Yáñez C, Esther., Garcia, Carlota. 2021.
Bioquímica. Conceptos Esenciales. 3 ed. Bogotá: Médica Panamericana.
Mathews, Christopher K y Van Holde, K.E. 2004. Bioquímica. 3 ed. España:
Pearson
Polo Diez, Luis María. 2015. Fundamentos de Cromatografía. España: Dextra
editorial.
Skoog, Douglas A. 2014. Fundamentos de Química Analítica. 9 ed. México.
Cengage Learning.
PREINFORME
Nombre _____________________________ Grupo ________________________
I. CUESTIONARIO DE CONSULTA PARA EL PREINFORME
Responda las siguientes preguntas en forma concreta, ordenada y con citas
en normas APA:
[Link] una tabla de composición de aminoácidos de cada una de las muestras
especificadas en la guìa (incluya unidades de concentración).
Espinaca 100 gr
Ácido
220 mg. Leucina 190 mg.
aspártico
Ácido
315 mg. Lisina 160 mg.
glutámico
Alanina 130 mg. Metionina 43 mg.
Arginina 130 mg. Prolina 103 mg.
Cistina 38 mg. Serina 95 mg.
Fenilalanina 110 mg. Tirosina 80 mg.
Glicina 123 mg. Treonina 110 mg.
Hidroxiprolina 0 mg. Triptofano 41 mg.
Histidina 53 mg. Valina 140 mg.
Isoleucina 120 mg.
Bebida de soya 100 gr
Ácido aspártico 372 mg. Leucina 263 mg.
Ácido glutámico 600 mg. Lisina 195 mg.
Alanina 133 mg. Metionina 44 mg.
Arginina 233 mg. Prolina 176 mg.
Cistina 51 mg. Serina 157 mg.
Fenilalanina 164 mg. Tirosina 122 mg.
Glicina 131 mg. Treonina 123 mg.
Triptofan
Hidroxiprolina 0 mg. 47 mg.
o
Histidina 77 mg. Valina 154 mg.
Isoleucina 157 mg.
Propoleo
Ácido aspártico: 12.57
Ácido glutámico: 12.18
Leucina: 9.06
Lisina: 7.70
Isoleucina: 7.00
Valina: 6.91
Prolina: 6.21
Fenilalanina: 5.94
Alanina: 5.38
Arginina: 5.35
Serina: 4.95
Glicina: 4.81
Tirosina: 3.69
Metilonina: 1.17
Hidroxiprolina: menos de 1.00
Cistina: menos de 1.00
Harína de alpiste
lisina y treonina (1.3 y 2.7 g/100g de proteína, respectivamente
metionina en las proteínas de alpiste (1.4 4 g/100g de proteína
cisteína (3.3 g/100g de proteína
Harína de quinua
*
Gaseosa seven up
Agua de coco
1 Asp 1,59
2 Glu 1,03
3 Ser 10,51
4 Gly 27,19
5 Thr 6,34
6 His 25,30
7 Cit ND
8 Ala 6,38
9-10 Gaba-Arg NC
11 Tyr 7,91
12-13 Met - Val NC
14 Phe 21,34
15 Ile 10,48
16 Leu 6,76
17 Lys ND
[Link] la naturaleza química de la celulosa (Incluyendo su polaridad) y tipos
de sustancias que pueden usarla como fase estacionaria en la CCD.
Es un polímero compuesto por muchas glucosas de forma lineal, las cadenas de a
celulosa se acoplan mediante puentes de hidrogeno.
3. Para la fase móvil, describa la naturaleza química de sus solventes y teniendo
en cuenta las proporciones de los mayoritarios determina su polaridad, en
comparación con la fase estacionaria.
El acido acético es una sustancia orgánica, bastante polar por su grupo carboxilo
El butanol es polar aunque poco, menos que el agua y el metanol
La acetona tiene un dipolo por lo que no se considera con carga positiva o
negativa.
El agua es polar
La fase móvil debido a que todos son mayormente polar, esta mezcla lo será
también.
4. Mencione los colores esperados al revelar los aminoácidos con la ninhidrina,
incluyendo los casos especiales de la prolina y la asparragina.
Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre,
reaccionan con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color
violáceo o amarillo.
5. ¿Cómo se mide el Rf y para qué se utiliza en identificación de sustancias en la
CCD?
Permite medir las distancias recorridas en la placa por el soluto y el eluyente, con
lo que se puede determinar el compuesto con unas constantes determinadas para
cada compuesto y se determina como:
Rf= distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)
II. DIAGRAMA DE FLUJO
3. Fichas técnicas.
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio (incluya las filas
necesarias para los solventes de la fase móvil y el reactivo para revelar los
aminoácidos)
LOS AMINOÁCIDOS NO SON PELIGROSOS POR LO TANTO NO SE LES
HACE FICHA
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Forma de
molecular desechar el
reactivo( àci
dos, bàsicos,
orgànicos,
metales
pesados)
Metanol CH3OH
Etanol C2H5OH
Acetona
Butanol
Ácido acético
Ninhidrina
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable
(F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn),
irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Los símbolos con las normas del Sistema
Globalmente Armonizado (SGA)
PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME
I. TABLA DE DATOS
1. CROMATOGRAFÍA
Completa la siguiente tabla de datos para la cromatografía
Cromatografía del extracto etanólico
Compuesto # Distancia al Distancia al Rf Nombre
* centro de la límite del del
mancha solvente compuesto
probable
*Calcule los valores de Rf de todas las señales obtenidas de los patrones y sus
dos muestras.
II. ANÁLISIS DE RESULTADOS
RECUERDE RESPONDER CON CITAS EN NORMAS APA
[Link] fotografía de la placa de cromatografía y sobre esta (usando los patrones
para la identificación) nombre las señales de los aminoácidos encontrados en las
muestras.
[Link] los valores de Rf de las señales obtenidas en las muestras con los
correspondientes patrones e identifique los posibles aminoácidos presentes. Y
contraste con los esperados de acuerdo con su consulta del preinforme.
[Link] la cantidad de aminoácidos diferentes que encontró por cromatografía
en cada una de sus muestras.
[Link] los colores de las señales en la placa de acuerdo con la reacción de la
ninhidrina.
[Link] en la literatura, los valores de Rf para sistemas cromatográficos
similares (fase estacionaria y fase móvil ) y analice qué tan válida es la
comparación con los valores obtenidos por usted.
[Link] las estructuras de todos los aminoácidos usados en la práctica, analice
las estructuras y establezca cuál fue el orden de migración, es decir ¿cuáles
aminoácidos migraron más, los polares con carga, polares sin carga, o los
apolares y por qué cree usted que fue así de acuerdo con las condiciones de la
cromatografía en cuanto a polaridad de la fase estacionaria y móvil?
III. BIBLIOGRAFÍA.
Enuncie la bibliografía utilizada como apoyo para la elaboración del análisis de
resultados (Normas APA).
