PCR
¿Qué es?
La técnica molecular de PCR (Polymerase Chain Reaction, por sus siglas en inglés) es
una herramienta ampliamente utilizada en biología molecular para amplificar específicamente una
región de interés en el ADN o ARN. La técnica utiliza una enzima llamada Taq polimerasa para
amplificar el fragmento de interés mediante ciclos repetitivos de desnaturalización del ADN,
apareamiento de cebadores específicos y extensión de la cadena de ADN. El producto de PCR
resultante puede ser analizado para la detección de enfermedades genéticas, diagnóstico de
infecciones, análisis de expresión génica, secuenciación de ADN y otras aplicaciones en
investigación y diagnóstico molecular.
¿Cuáles son los pasos a seguir?
1. Diseño de los cebadores: se deben diseñar cebadores específicos para la secuencia de
interés a amplificar.
2. Preparación de la mezcla de reacción: se prepara una mezcla que contiene los cebadores,
la ADN polimerasa, los nucleótidos y una solución tampón que proporciona las
condiciones adecuadas de pH y concentración iónica para la reacción.
3. Extracción de la muestra: se extrae y purifica el ADN de la muestra a amplificar, por
ejemplo, mediante una técnica de extracción de ADN.
4. Amplificación por PCR: se realiza la amplificación de la secuencia de interés mediante
ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación utilizando un termociclador. Este
proceso resulta en la amplificación exponencial de la cantidad de ADN de la secuencia
de interés
5. Análisis de los productos de la PCR: los productos de la PCR se pueden analizar mediante
electroforesis en gel de agarosa o en tiempo real para confirmar la presencia y tamaño de
los fragmentos amplificados.
6. Interpretación de los resultados: se interpretan los resultados según el tamaño de los
fragmentos amplificados y se comparan con una muestra de control para confirmar la
presencia de la secuencia de interés.
Sobre la desnaturalización la hibridación y la extensión
La PCR consta de tres pasos principales: la desnaturalización, la hibridación y la
extensión.
En el primer paso, la desnaturalización, se calienta la muestra a una temperatura alta
(generalmente entre 94°C y 98°C) para separar las dos hebras de la molécula de ADN o ARN
objetivo, formando dos hebras simples. Este proceso se realiza para permitir que los cebadores
(oligonucleótidos) se unan específicamente a la secuencia de interés en el segundo paso.
En el segundo paso, la hibridación, se reduce la temperatura para permitir que los
cebadores se unan específicamente a la región de ADN o ARN de interés en cada hebra. La
temperatura de hibridación depende de la longitud y composición de los cebadores y de la
secuencia del ADN o ARN de interés. La temperatura de hibridación típica varía entre 50°C y
65°C.
Finalmente, en el tercer paso, la extensión, se aumenta la temperatura de la muestra a la
temperatura óptima de actividad de la polimerasa (generalmente entre 72°C y 80°C) para permitir
que la polimerasa se una a los cebadores y sintetice una nueva cadena de ADN complementaria
en cada hebra, utilizando los nucleótidos libres presentes en la mezcla de reacción.
La extensión es uno de los pasos más críticos de la PCR ya que afecta a la eficiencia y
especificidad de la amplificación. Es importante tener en cuenta que la temperatura de extensión
debe ser suficientemente alta para que la polimerasa tenga actividad óptima, pero no tan alta como
para causar desnaturalización del ADN o ARN objetivo o de las hebras recién sintetizadas.
En general, la temperatura de extensión recomendada es de 72°C para la mayoría de las
polimerasas termostables. Sin embargo, la temperatura de extensión óptima puede variar según el
tipo de polimerasa, el tamaño del fragmento amplificado, la longitud y composición de los
cebadores y la secuencia del ADN o ARN objetivo. Por lo tanto, es importante optimizar la
temperatura de extensión en función de las condiciones específicas de la PCR. La
extensión dura entre 30 y 60 seg dependiendo de la longitud de la cadena y otros factores.
Variantes
Existen varias variantes de la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
que se han desarrollado para adaptarse a diferentes objetivos de investigación. Algunas
de las variantes más comunes incluyen:
1. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR): Esta variante de la PCR se utiliza para medir la
cantidad de ADN o ARN presente en una muestra. La qPCR utiliza una sonda
fluorescente que se une específicamente al fragmento de ADN o ARN que se está
amplificando, lo que permite la detección y cuantificación en tiempo real del producto de
PCR.
2. PCR anidada: En esta técnica, se llevan a cabo dos rondas de amplificación de PCR. La
primera ronda utiliza cebadores específicos para amplificar una región de ADN o ARN
de interés. Luego, se toma una muestra de la primera reacción de PCR y se utiliza como
plantilla para la segunda ronda de amplificación, utilizando un conjunto diferente de
cebadores internos específicos para la región de interés. La PCR anidada aumenta la
especificidad de la amplificación y reduce la posibilidad de amplificar ADN o ARN no
específico.
3. PCR en tiempo real con transcriptasa inversa (RT-qPCR): Esta técnica combina la PCR
cuantitativa en tiempo real con la transcriptasa inversa, lo que permite la amplificación y
cuantificación de ácidos nucleicos específicos de ARN. La RT-qPCR se utiliza para medir
la cantidad de ARN presente en una muestra y se usa comúnmente en la investigación de
expresión génica.
4. PCR de punto final: La PCR de punto final es la técnica de PCR estándar en la que se
amplifica una región de ADN o ARN de interés utilizando cebadores específicos.
Después de la amplificación, el producto de PCR se visualiza mediante electroforesis en
gel. A diferencia de las variantes anteriores, la PCR de punto final no proporciona
información cuantitativa sobre la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra.
En general, las variantes de PCR se diferencian de la técnica estándar en los reactivos y las
condiciones de amplificación utilizados. Por ejemplo, la qPCR utiliza una sonda fluorescente para
la detección en tiempo real, mientras que la PCR anidada utiliza cebadores internos adicionales
para aumentar la especificidad de la amplificación. La elección de la variante de PCR dependerá
de los objetivos de investigación específicos y las necesidades de detección y cuantificación de la
muestra.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Ventajas Desventajas
Riesgo de contaminación de la muestra y
Alta sensibilidad y especificidad
falsos positivos
Dependencia de los cebadores específicos
Amplificación exponencial del ADN o
de la secuencia del ADN o ARN de
ARN de interés
interés
Capacidad para trabajar con cantidades Posibilidad de amplificación de ADN o
muy pequeñas de material genético ARN no específico
No proporciona información sobre la
Rápido y fácil de llevar a cabo
función o estructura del gen o proteína
No es adecuado para detectar cambios en
Permite la clonación de fragmentos de
la expresión génica o la presencia de
ADN
mutaciones
Puede ser utilizado en una variedad de
aplicaciones, como diagnóstico médico,
investigación básica y aplicada, y análisis
forense
*Las ventajas y desventajas varían dependiendo de la variante de PCR, estas solo son
generales.
FUENTES
1. Tenorio-Abreu, A., Ruiz-Castillo, A., Francisco Guzmán-González, A., Peña-
Monje, A., María Saavedra-Martín, J., & Franco-Álvarez De Luna, F. (2022).
Comparación entre cinco técnicas de PCR para el diagnóstico del SARS-CoV-2.
Revista Española de Quimioterapia, 35(4), 401–405.
https://doi.org/10.37201/req/076.2020 (EBSCO Maristas)
2. Reacción en cadena de la polimerasa, Ana Soledad Sandoval Rodríguez;
Alejandra Meza Ríos; Jorge Fernando Floresvillar Mosqueda (AccesMed
Maristas).
3. Michael A. Innis, David H. Gelfand, & John J. Sninsky. (1999). PCR
Applications : Protocols for Functional Genomics. Academic Press. (EBSCO
Maristas).
VIDEOS DE LA CLARA DEL WEBO
Método - https://youtu.be/g-dNJdOvBM4
Pasos - https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA
Review - https://www.youtube.com/watch?v=uKeMiAZ8Zu4
