Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de
Biotecnología
Laboratorio de Biotecnología Molecular
Profesoras:
Flor Selene Villalobos Escobedo
Aida Margarita Zamora Contreras
Bitácora: Práctica 7 “Inserción de material genético en un
plásmido bacteriano”
Alumno: Cano Pérez Jeimy Melanie
Equipo: 5
Fecha de entrega: 25/11/2022
Objetivos:
Generales
Realizar el corte de un vector con el uso enzimas de restricción.
Realizar la inserción de material genético dentro de un vector plasmídico.
Específicos
Realizar la metodología para cortar un vector utilizando la enzima de restricción
BamHI.
Realizar la metodología para insertar material genético de interés dentro de un
plásmido previamente tratado con la enzima de restricción BamHI.
Tabla de reactivos
Tabla 1. Función de reactivos Práctica 7
Reactivo Función
Enzimas de restricción Las enzimas de restricción son enzimas que cortan ADN. Cada
enzima reconoce una o un número pequeño de secuencias
blanco y corta el ADN en o cerca de esas secuencias. (Sandoval,
2013)
Buffer de restricción Garantiza las condiciones de reacción óptimas para las enzimas
(Tango) de restricción. (Thermo Scientific, 2012)
Metodología
*Nota: las cantidades varían de
acuerdo a la enzima de restricción
que se usará*
Ilustración 1. Metodología para realizar corte en un plásmido con una enzima de restricción. Cantidades usadas para la
enzima BamHI.
Cuestionario
1. Coloca una imagen de tu plásmido con sus características
2. En un vector ¿qué es el sitio múltiple de clonación (SMC) Multiple Clonation
Site (MCS).
Es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento
para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de
posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más
comunes presentes en el sitio de clonación múltiple de la mayoría de los vectores
son para las enzimas EcoRI, Hind III, BamHI, XhoI y KpnI.
3. ¿Un sitio de corte puede encontrarse fuera del SMC?
Si, hay sitios de corte fuera del SMC.
4. De acuerdo a las enzimas de corte que usaron de forma grupal, busca los
insertos de la marca correspondiente y pégalos en tu bitácora
Enzima de Restricción Insertos
EcoRI
BamHI
HindIII
5. ¿Cuántos tipos de enzimas de restricción se conocen? ¿Qué características
tiene cada tipo?
De acuerdo a su función las enzimas de restricción se clasifican en tipo I, II y III.
Tipo I: Las enzimas de este tipo reconocen una secuencia específica de
nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier
secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de
corte; además tienen la función de metilar su propio genoma. Estas enzimas
necesitan adenosín trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de la molécula
de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.
Tipo II: Las enzimas de este tipo reconocen secuencias específicas y hacen
el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de reconocimiento.
Estas enzimas sólo tienen actividad de restricción, no de metilación y son las
utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias
+¿¿
específicas reconocidas. Requieren Mg 2 como cofactor y no requieren de
ADN. Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas son
palindrómicas, es decir, son secuencias que se leen igual en las dos cadenas
de ADN.
Tipo III: Las enzimas de este tipo reconocen una secuencia específica y
cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia blanco
(aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del sitio de
reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y
requieren de ATP para desplazarse a lo largo de la molécula de ADN.
6. ¿Para qué utilizan las bacterias las ER? ¿Por qué es importante la metilación?
Las enzimas de restricción son un mecanismo de defensa que le permite a las
bacterias cortar en fragmentos más pequeños el ADN exógeno potencialmente
nocivo, por ejemplo, el ADN de algún virus bacteriófago. La metilación del ADN
juega un papel central en la regulación y expresión génica. La metilación es un
mecanismo epigenético que bloquea la expresión de genes.
7. ¿Qué características posee un sitio de corte?
Un sitio de corte es la secuencia de ADN que es reconocida por una enzima de
restricción como el lugar en el que se cortará el ADN. Los sitios de corte cuentan
con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.
8. ¿Qué aplicaciones adicionales tienen las ER?
Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería
genética, tienen diversas aplicaciones como realizar mapas de restricción de
plásmidos o genomas, estudios de determinación de polimorfismos, construcción de
moléculas de ADN recombinante, entre otras.
9. ¿Qué tipo de ligasas se prefiere emplear? ¿Para qué necesitan las células
ligasas?
La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos fragmentos de ADN tienen
extremos complementarios, la ligasa puede unirlos para formar una molécula única
e intacta de ADN.
10. ¿Qué contiene el buffer de la ligasa? ¿Cuál es la función de estos componentes?
La ligasa de ADN T4 cataliza la formación de enlaces fosfodiéster en presencia de
ATP entre ADN bicatenario con extremos 3´-hidroxilo y 5´-fosfato. Sus
componentes son:
250 mM Tris-HCl (pH 7.6)----Mantiene la carga negativa.
50 mM MgCl2----Fuente de iones magnesio.
5 mM ATP----Cofactor
5 mM DTT--- Se utiliza para estabilizar enzimas y otras proteínas con
grupos de sulfhidrilos libres.
25% (w/v) Polietilenglicol -8000
11. ¿Cómo funciona el sistema de selección de colonias blancas y azules del gen
Lac?
Este método se basa en la expresión del operón Lac y sirve para reconocer las
bacterias recombinantes. Consiste en utilizar los reactivos IPTG y X-gal. El IPTG es
un inductor artificial del gen lacZ, determinante de la b-galactosidasa. El sitio de
clonamiento del plásmido se encuentra en el interior del gen lacZ, por lo tanto,
cuando el plásmido sin inserto mantiene el gen lacZ intacto, la b -galactosidasa
separa el X-gal (un galactósido artificial), que le sirve como sustrato, las colonias
tienen un aspecto azul por la degradación del X-gal. Si el gen lacZ es inactivado,
por la presencia del inserto, las colonias presentan el color blanco.
12. ¿Cómo se puede prevenir que se recircularice un vector con extremos
compatibles?
Para prevenir que el vector se auto ligue o recircularice durante la ligación del
fragmento de ADN y el plásmido se debe involucrar fosfatasas alcalinas, las cuales
remueven los grupos fosfato del extremo 5’ del vector.
Referencias
Pregunta 2: Sandoval Rodríguez A, & Mena Enríquez M, & Márquez Aguirre A (2013).
Vectores de clonación y expresión. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, &
Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud. McGraw Hill. Recuperado de:
[Link]
Pregunta 4:
Thermo Scientific. (2012). EcoRI. Recuperado de:
[Link]
%3A%2F%[Link]%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals
%2FMAN0012092_EcoRI_10_UuL_10000U_UG.pdf
Thermo Scientific. (2012). BamHI. Recuperado de:
[Link]
url=[Link]
%2FMAN0012056_BamHI_10_UuL_5x4000U_UG.pdf
Thermo Scientific. (2012). HindIII. Recuperado de:
[Link]
url=[Link]
%2FMAN0012130_HindIII_10_UuL_5000U_UG.pdf
Pregunta 5: Sandoval Rodríguez A, & Mena Enríquez M, & Márquez Aguirre A (2013).
Vectores de clonación y expresión. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, &
Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud. McGraw Hill. Recuperado de:
[Link]
Pregunta 6: Luque, J; Herráez, A. (2002). Texto Ilustrado de Biología Molecular e
Ingeniería Genética, conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Primera
edición. Elsevier Science. Madrid, España. Recuperado de:
[Link]
se-usan-y-que-funcion-desempenan-en-la-naturaleza
Pregunta 7: Sandoval Rodríguez A, & Mena Enríquez M, & Márquez Aguirre A (2013).
Vectores de clonación y expresión. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, &
Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud. McGraw Hill. Recuperado de:
[Link]
Pregunta 8: Sandoval Rodríguez A, & Mena Enríquez M, & Márquez Aguirre A (2013).
Vectores de clonación y expresión. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, &
Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud. McGraw Hill. Recuperado de:
[Link]
Pregunta 9: ¿Qué es la ADN ligasa? (2019). Labxchange. Recuperado de:
[Link]
6fc1991b634d/items/lx-pb:613ef48f-f29c-40c8-9e76-6fc1991b634d:html:967c93e3
Pregunta 10: Checa Rojas, A., Orlando Santillán Godínez (2018) Método: ligamiento con
T4 ADN ligasa. Conogasi. Recuperado de: [Link]
ligamiento-con-t4-adn-ligasa/
Pregunta 11: Orlando, Y. A. V. (s/f). Aislamiento y caracterización de marcadores
moleculares microsatelites a partir de la construcción de librerias genomicas enriquecidas
de camote (Ipomoen batatas (L) Lam). Recuperado de:
[Link]
%C3%[Link]#
Pregunta 12: Kroemer, T. (s/f). Cómo solucionar problemas de clonación basada en
enzimas de restricción. Goldbio. Recuperado de:
[Link]
restriccion
