UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA EDUCATIVO
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

UNIDAD DE APRENDIZAJE INMUNOLOGÍA GENERAL

MANUAL DE LABORATORIO

ELABORARON:
Dr. en C. JONNATHAN GUADALUPE SANTILLÁN BENÍTEZ
Esp. Pediatría ITZEL OSORNIO GARCÍA

Febrero 2020
Contenido

INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 3
Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje ....... 4
Formato de la práctica y simbología ................................................................... 6
Evaluación del curso .......................................................................................... 7
Reglamento del laboratorio de Inmunología ....................................................... 8
Manejo de residuos peligrosos ........................................................................... 9
PRÁCTICA No. 1 TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA Y OBSERVACIÓN DE
LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE ......................................................... 10
PRÁCTICA No. 2 FAGOCITOSIS .................................................................... 14
PRÁCTICA No. 3 DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO Y Rh ......... 17
PRACTICA No. 4 DETERMINACIÓN DE LA HORMONA GONADOTROPINA
CORIONICA HUMANA O PRUEBA DE EMBARAZO .................................... 21
PRÁCTICA No. 5 REACCIONES FEBRILES.................................................. 24
PRÁCTICA No. 6 DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS
(HEMAGLUTINACIÓN).................................................................................... 27
PRACTICA No. 7 CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS POR
INMUNODIFUSIÓN RADIAL O LA TÉCNICA DE MANCINI. ........................... 30
PRÁCTICA No. 8 EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO HUMANO ............... 34
PRÁCTICA No. 9 DETERMINACIÓN DE IgG ANTIHEPATITIS B POR LA
TÉCNICA DE ELISA Y/O EN PEINE. ............................................................... 37

2
INTRODUCCIÓN

Los científicos de los comienzos del siglo XIX estaban muy ocupados en
tratar de descubrir las causas de las enfermedades, por lo que pronto fueron
descubiertos agentes causales de agentes causales y así poco a poco se fueron
descubriendo una serie de fenómenos biológicos en donde los términos de
inmunidad y respuesta inmunitaria eran cada vez más frecuente, casi sin
percibirlo nació una nueva rama del conocimiento que con el tiempo fue
creciendo hasta constituirse en lo que hoy es una ciencia, la inmunología la cual
sigue haciendo grandiosas aportaciones en todos los campos de la biología, así
han nacido otras disciplinas como la neuroinmunlogía y la neuro-endocrino-
inmunología.

La inmunología no sólo es una ciencia, tiene muchas aplicaciones en

nuestra vida, un ejemplo es conocer la concentración de algunas hormonas que
se producen en la gestación tales como la GCH la cual se puede presentar entre
las primeras 4 a 8 semanas de gestación tanto en suero como en orina. El otro
ejemplo más ampliamente es el grupo sanguíneo y RH, hasta el empleo de los
inmunoensayos como la ELISA.

En la segunda edición de este Manual, se dirige a los estudiantes, que

tienen un primer contacto con la inmunología, su objetivo es servir al estudiante
de licenciatura como una herramienta para el curso práctico, así como de la
correlación con fundamentos teóricos de INMUNOLOGÍA.

3
Congruencias con el contenido programático de la unidad de
aprendizaje

Práctica Nombre de práctica Sesiones Unidad y Tema

1 Toma de muestra sanguínea y 1.1. Describir los
observación de las células del 1 componentes del
sistema inmune I sistema inmune
específicos y no
específicos
2 Fagocitosis 1 I 1.2. Fagocitosis
3 Determinación de grupo 1 1.1. Conocer y comprender
sanguíneo y Rh las características y
funciones que tienen los
antígenos.
II
1.3. Identificar la estructura
y clasificación de las
inmunoglobulinas

4 Determinación de la hormona 1 1.1. Conocer cómo se lleva

gonadotropina coriónica a cabo la reacción antígeno
humana o prueba de anticuerpo
III
embarazo. 1.2 Determinar cuáles son
los factores que influyen en
una reacción inmunológica
5 Reacciones Febriles 1 1.1. Conocer cómo se lleva
a cabo la reacción antígeno
anticuerpo
III
1.2 Determinar cuáles son
los factores que influyen en
una reacción inmunológica
6 Determinación de 1 1.3. Conocer las diferentes
Antiestreptolisinas técnicas inmunológicas:
(Hemaglutinación) ELISA, Western blot , RIA,
IF, IHA, citometría de flujo,
III
ect.
1.5 Aplicar las técnicas
inmunológicas para
establecer un diagnóstico.
7 Cuantificación de 1 1.3. Conocer las diferentes
inmunoglobulinas por técnicas inmunológicas:
inmunodifusión radial o la ELISA, Western blot , RIA,
técnica de Mancini
IF, IHA, citometría de flujo,
III ect.

1.5 Aplicar las técnicas

inmunológicas para
establecer un diagnóstico.
8 Efecto bactericida del suero 2 1.1. Conocer los
humano IV componentes del
complemento

4
 1.2. Activación de la Vía
clásica del
complemento
1.3. Activación de la vía
alterna del
complemento.
1.4. Mecanismo de
daño
1.5. Valores de
referencia
1.6. Métodos para
cuantificación
1.7. Valores de
referencia
1.8. interpretación de
resultados
9 Determinación de IgG 1
antihepatitis B por la técnica de
ELISA y/o en peine

5
Formato de la práctica y simbología

Objetivo

Fundamento teórico

Aspectos de seguridad e higiene

Procedimiento.- este puede ser considerado como actividad o

ejercicios demostrativos.

Actividades de comprobación o evaluación

Observaciones

Bibliografía

6
Evaluación del curso

El discente tendrá derecho a presentar las evaluaciones correspondientes, con

base a los lineamientos establecidos en el Reglamento Interno de la Facultad de
Química. Así mismo debe ser puntual a cada actividad académica, mostrar un
comportamiento adecuado en cada sesión y cumplir con el 80% de asistencia.
La unidad de aprendizaje se va a evaluar con base en la construcción de
conocimientos y habilidades adquiridos durante el proceso de aprendizaje; se
tomarán en cuenta los valores y la actitud mostrados por los estudiantes en las
actividades académicas, en la participación con exposiciones y la entrega de
trabajos escritos como evidencia, propios de cada una de las unidades de
competencia.

La evaluación del curso se integra de la siguiente forma:

Evaluación Ponderación

1ª Examen Parcial 50%

2ª Examen Parcial 50%

Promedio de Exámenes Parciales 80 %

Calificación de Laboratorio 20%

Si el alumno en esta ponderación alcanza una evaluación igual o mayor a 8.0

(ocho puntos), estará exento de presentar el Examen Final; si la evaluación
obtenida en esta ponderación es menor de 8.0 (ocho puntos), el alumno tendrá
que presentar el Examen Final

Examen Final 100 %

Laboratorio

Reportes 20%

Bitácora 10%

Desempeño en el laboratorio 20%

Examen final de laboratorio 50%

Total 100%

7
Reglamento del laboratorio de Inmunología

1. Uso obligatorio de bata blanca de manga larga y abotonada.

2. Uso obligatorio de guantes en el manejo de animales y muestras clínicas.
3. Usar cubre bocas o careta en el caso de prácticas de mayor riesgo.
4. Limpiar las mesas de trabajo con solución antiséptica (benzal o hipoclorito
de sodio al 1 % al inicio y al finalizar la práctica.
5. No abandonar el laboratorio una vez que ha iniciado la práctica, salvo
emergencia justificada.
6. No correr en el laboratorio.
7. Contar con gasas o papel adsorbente en cada mesa de trabajo.
8. Prohibido tomar alimentos dentro del laboratorio.
9. Evitar corrientes de aire en el laboratorio.
10. Disponer de recipiente con agua clorada para inactivar las puntas de las
micropipetas, material contaminado con reactivos y/o muestras
biológicas.
11. Utilizar jabón líquido para aseo de las manos antes de abandonar el
laboratorio al término de la sesión.
12. Esterilizar en autoclave el material que así lo requiera.
13. En caso de algún accidente o percance avisar al profesor de la práctica.

LA REGLA DE ORO

Toda muestra: sangre, suero, cultivos bacterianos, cultivos celulares, virus y

productos radiactivos deben manipularse con extremo cuidado, como si fuesen
muestras potencialmente patógenas.

8
Manejo de residuos peligrosos

Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con
algunas de las siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables,
explosivas, reactivas, radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden
causar daño a la salud humana y/o al medio ambiente. Así mismo se consideran
peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto
con ellos.

Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y

recolección de los residuos químicos, para su posterior almacenamiento y
confinamiento.

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y

recolectarse de acuerdo a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que
considera como R.P.B.I. los siguientes:

Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.

Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación,

asi como los generados en la producción de agentes biológicos.

Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o

térmicos, es el caso de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización
por calor seco o calor húmedo frecuentemente utilizados en las áreas de
microbiología.

Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio,

2006).

9
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PRÁCTICA No. 1 TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA Y

OBSERVACIÓN DE LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

Objetivos

Observar y caracterizar las células del sistema inmune presentes en la sangre

periférica a través de una tinción de Wright, obteniendo la muestra por punción
venosa.

Fundamento

Nuestro sistema inmune lo componen las diferentes células los glóbulos blancos
o leucocitos presentes en circulación sanguínea y que al ser teñidas con el
colorante Wright o Giemsa, permite diferenciarlas en función a su tamaño celular,
núcleo y gránulos presentes y a la afinidad por el colorante ácido o básico con el
cual se tiñen y conocer la concentración en sangre de las mismas, esto permitirá
asociar los hallazgos con una infección bacteriana, viral o parasitaria, o alguna
otra patología como el caso de leucemias o una deficiencia, por lo que es
necesario saber los valores normales de cada una de las células sanguíneas.
Las células linfoides participan en la inducción y expresión de la respuesta
inmunitaria adquirida. Incluye a los linfocitos macrófagos y a otras células
presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas, las células de
Langerhans, las células NK o Natural Killer, otras células importantes en la
manifestación y regulación de la respuesta inmunitaria son los neutrófilos, las
células cebadas, basófilos y eosinófilos.
Los linfocitos y las células NK, son células redondas, su tamaño oscila entre 8 y
10 micras, tienen un núcleo prominente y escasos organelos citoplasmáticos, las
células NK son más granulares que los linfocitos y esta es una característica
distintiva de los linfocitos. Los macrófagos y las células accesorias en los tejidos
son células grandes mayores de 12 micras, irregulares y dendrítica, con
abundante citoplasma y núcleo proporcionalmente pequeño y con gran cantidad
de gránulos, organelos y vacuolas.

Material y reactivos

1. Jeringas de plástico estériles de 3 o 5 mL, Sistema Vacutainer

2. Torundas embebidas en etanol al 70%
3. 1 caja de portaobjetos por grupo
4. Tubos de 13 x 100 con anticoagulante EDTA
5. Ligadura

10
6. Colorante de Wright
7. Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4
8. Microscopio, aceite de inmersión
9. Gradilla
10. Micropipeta de 200 L
11. Puntas

Procedimiento
2. Verificar que la aguja este
1. Localizar y palpar la vena en
atornillada en la jeringa y que
el brazo
el embolo fluya sin ningún
4. Desinfectar el área donde se obstáculo.
localizó la vena con una
torunda impregnada en 3. Colocar una ligadura
etanol al 70% y con (torniquete) aprox 15 cm por
movimientos circulares de encima de la vena.
antro hacia afuera se realiza
la desinfección. 6. Colocar la torunda encima del
bisel antes de quitar la jeringa
y al mismo tiempo se quita la
5. Colocar el bisel de la aguja
ligadura.
con la perforación hacia
arriba antes de introducirlo,
una vez que se tiene el bisel 7. Vaciar la muestra lentamente
dentro de la vena, jalar el por las paredes del tubo con
embolo lentamente hasta la anticoagulante EDTA y
cantidad que se va a obtener mezclar por inversión 5 a 7
(3 mL). veces

9. El éxito de cualquier 8. Si se utiliza el sistema

determinación o análisis vacutainer se debe colocar la
clínico depende de la toma aguja doble en el soporte de
de la muestra. plástico y realizar el mismo
procedimiento.
10. Una vez que tengan su
muestra deberán colocar una 11. Inmediatamente con otro
gota (10 μL) en uno de los portaobjetos colocado a 45º
extremos del portaobjetos. del primero recorrer para
hacer un extendido

12. Observar al microscopio a 11. Secar la laminilla por 5 minutos

un aumento de 100x con y teñir con Wright o Giemsa.
aceite de inmersión.

15. Comparar los datos obtenidos

13. Identificar las células del
contra los valores de
sistema y llevar a cabo un
referencia y registrarlos para
conteo de 100.
Observaciones su análisis.

11
Con ayuda de las imágenes y las observaciones realizadas en el microscopio describe
las características morfológicas y tincionales de las células identificadas

Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___
Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___
Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___
Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___

Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___
Célula:____________ Célula:____________

Características:___________ Características:____________
_______________________ ________________________
_______________________ ________________________
___

12
 Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Qué es un anticoagulante?

2. ¿Cuáles son las células granulocíticas?

3. ¿Cuáles son los valores normales de las células sanguíneas?

4. ¿Qué calores obtuviste en tu muestra?

Bibliografía
1. Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2015. Inmunología de Rojas. 17ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2. Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3. Marone G., Lichtenstein L.M., et al. 2000. Mast Cells and Basophils. Edit.
Academic Press Harcourt Publishers. Great Britain.
4. Burke B., Lewis C.E. 2002. The Macrophages, 2ª Edición, Edit. Oxford
University Press. Great Britain.

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PRÁCTICA No. 2 FAGOCITOSIS

Objetivo.

Observar microscópicamente el proceso de la fagocitosis de levaduras,

principalmente la endocitosis y la reducción de nitroazul de tretrazolio derivado
de los mecanismos de destrucción oxidativos.

Fundamento.

La fagocitosis es el mecanismo innato o inespecífico más importante de nuestro

sistema inmune, en el cual participan las células fagocíticas como los
polimorfonucleares (PMN), las dendríticas, los monocitos, la actividad fagocítica
de los macrófagos no solo está relacionada con protección, también desempeña
un papel importante en la inducción de la respuesta inmunitaria, a través de la
fagocitosis, los macrófagos atrapan e ingieren microorganismos, los inactivan y
los digieren en moléculas de tamaño variable, alguno de estos, se degradan
produciendo pequeños fragmentos antigénicos o epítopos que se asocian a
moléculas de histocompatibilidad clase I y de clase II y así se transportan a la
superficie de los macrófagos para ser presentados a las células T del individuo.
La fagocitosis efectuada por los PMN se lleva a través de una serie de 6 etapas:
adherencia, quimiotaxis, opsonización, ingestión, desgranulación, y destrucción.
En la adherencia de los PMN llegan al lugar de la infección atravesando la pared
endotelial de los vasos sanguíneos, en donde interactúan con las moléculas
(selectina E y quimiocinas) de las células endoteliale, generando que se
expresen moléculas de adhesión ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, VCAM-2 y
MadCAM-1 mientras que en la membrana del PMN las integrinas LFA-1, CR-3,
VLA-4 y LPAM-1, entre estas dos tipos de moléculas se lleva la adhesión y los
PMN salen del tejido por entre las uniones de las células endoteliales, conocido
como diapédesis.
La quimiotaxis es el proceso mediante el cual los fagocitos son atraídos al lugar
de la invasión microbiana, las moléculas relacionadas en la reclutación de los
neutrófilos son derivados de la activación del complemento, fragmentos de
fibrina y colágena, productos de degradación bacteriana. Las opsoninas (Ia
inmunoglobulina G y las fracciones C3b y C4b del complemento) presentes en
el suero interaccionan con los microorganismos y los hacen más susceptibles a
la ingestión por los fagocitos llevándose a cabo la opsonización.
Los pseudopodos citoplasmáticos de los fagocitos se extienden al ponerse en
contacto con las bacterias, fusionándose sobre el lado distal del material que va
a ser ingerido, englobando a la partícula y formando una vesícula fagocítica

14
denominada fagosoma, la cual es llevada al interior de la célula proceso
denominado endocitosis.
A medida que se forma el fagosoma, los gránulos lisosomales del PMN
adquieren movimiento, se fusionan con la vacuola fagocítica vaciando su
contenido al interior, desapareciendo del citoplasma y formando así el
fagolisosoma proceso denominado desgranulación.
En los fagocitos existen múltiples sistemas microbicidas: la acidificación
(pH 3.5 - 4.0), metabolitos tóxicos derivados del oxígeno como el anión
superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH-), el
óxido nítrico (NO), péptidos antimicrobianos (proteínas catiónicas) y enzimas
(Lisozima) esto participa en la destrucción de algunos microorganismos).

Material y reactivos

1.- Jeringa de 5 mL
2.- Torundas de algodón
3.- Tubos de ensayo de 13 x 100
4.- Pipetas Pasteur
5.- Centrífuga
6.- Portaobjetos
7.- Colorante de Wright o Giemsa
8.- Etanol al 70%
9.- Cubreobjetos
10.- Microscopio Óptico.
11.- Heparina 1000 unidades
12.- Solución de Levaduras.

Procedimiento

1. Realizar extracción de 2. Adicionar a un tubo de ensayo

sangre por punción venosa 1 mL de sangre más 250 L de
con una jeringa impregnada solución de levaduras y
con heparina. homogeneizar por 15 min a
1. 37ºC, invirtiendo el tubo con
suavidad cada minuto.
4. Observar a 100X células 3.
PMN entre células
fagocitantes reportando los
resultados obtenidos con las 3. Hacer una extensión sanguínea
siguientes fórmulas: y teñirlo con Wright.

Índice fagocitario= Promedio de partículas fagocitadas x PMN fagocitados

Promedio de partículas fagocitadas = Partículas fagocitadas / Total de PMN

15
 Observaciones

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Qué es la fagocitosis?

2. ¿Cuáles el objetivo que tiene los fagocitos?

3. ¿Cómo se calcula el índice fagocitario?

4. ¿Qué función tiene el nitro azul de tetrazolium?

Bibliografía

1. Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2. Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3. Burke B., Lewis C.E. 2002. The Macrophages, 2ª Edición, Edit. Oxford
University Press. Great Britain.

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PRÁCTICA No. 3 DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO

Y Rh

Objetivo

El objetivo principal de la práctica es que el alumno conozca distintas maneras

de poner en evidencia la reacción de hemaglutinación directa que ocurre cuando
los glóbulos rojos interaccionan con su anticuerpo.

Fundamento

Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas (glicoproteínas,

glicolípidos y proteínas) determinadas genéticamente, las cuales pueden
identificarse mediante anticuerpos específicos, estos antígenos junto con los de
histocompatibilidad, constituyen importantes antígenos de trasplante y son
responsables de las reacciones post-trasfusionales que aparecen cuando se
administra sangre no compatible de un individuo a otro. Se encuentran
agrupados en sistemas de los que actualmente se conocen 23 en el ser humano,
incluyendo los sistemas ABO, Rh, MN, Lewis, Kell, Duffy, Kidd, Lutheran,
Chido/Rogers, Diego, Colton, KX, LW, Xg y otros. Aunque todos los sistemas
son importantes porque sus antígenos tienen diversas funciones biológicas.

En el sistema ABO se reconocen 4 grupos sanguíneos (ver Figura 1), según se

tenga al antígeno A ó el antígeno B, las personas del grupo A tienen en sus
eritrocitos el antígeno A, las personas del grupo B tienen el antígeno B, las
personas que poseen tanto el antígeno A y el B se clasifican como AB y aquellas
que carecen de estos antígenos constituyen el grupo cero.

Figura 1. Grupos sanguíneos del sistema ABO

17
Al mismo tiempo las personas del grupo A tienen en su sangre anticuerpos contra
el antígeno B, aquellas del grupo B poseen anticuerpos contra el antígeno A, los
individuos del grupo AB no tienen anticuerpos contra los antígenos A y B y los
individuos del grupo O tienen anticuerpos contra los antígenos A y B (ver figura
2). A los anticuerpos contra las sustancias del grupo sanguíneo se les llama
Isoaglutininas son se clase IgM, por lo que son totalmente aglutinantes y
fijadores de complemento, por este motivo la determinación del sistema ABO es
de gran relevancia en trasfusiones sanguíneas.

Material y reactivos

1. Tubos de 13x100mm
2. Tubos con anticoagulante EDTA
3. Lancetas
4. Placa de porcelana
5. Antisueros A, B, AB y anti-D (Rh)
6. Solución salina estéril
7. Centrifuga clínica
8. Aplicadores
9. Torundas de algodón en alcohol al 70%

Procedimiento

I. En tubo:

1. Obtener 1mL de sangre venosa 2. Preparar una solución de

con anticoagulante (EDTA) eritrocitos al 0.5% en solución
salina al 0.8% que debe tener
un color rojo cereza.

4. Colocar una gota de la 3. Marcar 4 tubos de ensaye con

suspensión de eritrocitos al 0- las letras A, B, AB y Rh.
5%.

5. Adicionar una gota de los 6. Centrifugar los tubos por 5min

antisueros correspondientes a 2500 rpm.

8. Interpretar los resultados 7. Observar si hay aglutinación o

obtenidos y reportar el no en cada tubo al agitar
resultado. ligeramente

18
 II. En placa:

1. Realizar una punción capilar 2. Antes de puncionar se debe

usando el dedo índice de la desinfectar con una torunda
mano izquierda. con alcohol al 70%.

4. En la placa de porcelana
3. Puncionar con la lanceta.
colocar en cada pocito una gota
(debe tenerse 4 gotas).

5. Adicionar los antisueros 6. Interpretar el resultado.

correspondientes para realizar
la identificación del grupo
sanguíneo. 7. Comparar los métodos
determinando ventas y
8. Determinar la incidencia de los desventajas.
diferentes tipos sanguíneos.

Observaciones

Esquematiza la aglutinación que se obtuvo de tu muestra:

Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D

Figura 2. Reacciones de aglutinación de los diferentes tipos sanguíneos del sistema ABO

19
 Anti-suero Aglutinacion (+/-) Tipo sanguíneo
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
Anti-O

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Qué componentes tiene la membrana del eritrocito tipificado del grupo “O”?

2. ¿Cuál es el grupo sanguíneo universal?

3.- ¿Cuál es el donador universal?

4.- ¿si tengo sangre tipo B que anticuerpo tendré?

5.- ¿Qué es un antisuero?

Bibliografía

1. Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2. Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3. Todd-Sanford, Análisis Clínicos 2001. Ed: Panamericana.

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PRACTICA No. 4 DETERMINACIÓN DE LA HORMONA

GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA O PRUEBA DE
EMBARAZO

Objetivo

El objetivo de la práctica es realizar ejercicios de aglutinación pasiva en tuvo y

en placa utilizando eritrocitos y partículas de látex como soportes.

Fundamento

La aglutinación es una reacción inmunológica entre un antígeno partículado con

su anticuerpo, específico, tiene muchas aplicaciones debido a la facilidad con
que se lleva a cabo y su alta sensibilidad (puede detectar hasta 1µg) comparada
con las reacciones de precipitación. Esta prueba no permite la cuantificación
exacta de anticuerpos y los resultados pueden solo expresarse en función de la
mayor dilución del suero en donde se aprecie la aglutinación, lo cual de
denomina título.

En el primer caso los antígenos que interviene en la reacción son componentes

de la partícula (bacterias, levaduras, eritrocitos, linfocitos, etc.) y en segundo
caso los antígenos se acoplan en forma artificial a partículas que solo funcionan
como soporte, las partículas más utilizadas como soportes son eritrocitos y
partículas de poliestireno (látex). En ambos casos se puede realizar en la placa
o en el tubo en forma cualitativa y semicuantitativa (determinación del título).

La Gonadotropina Coriónica Humana (GCH) es una hormona que se aparece en

el suero y en la orina de mujeres embarazadas o en ciertos procesos neoplásicos
como las molas o cáncer de testículo que en ese caso se concederá como un
marcador tumoral. La determinación de la GCH se puede realizar
inmunológicamente por dos métodos uno usando partículas de látex recubiertas
con GCH o por medio de la prueba de inhibición de la hemaglutinación pasiva,
ambas pruebas tienen una sensibilidad diferente por lo que en casos de
embarazos son de utilidad desde 10 días después de la fecha en que debiera

21
presentarse la menstruación. La persistencia de niveles altos de GCH es
sugerente de un proceso neoplásico.

El látex es una suspensión coloidal de partículas esféricas de poliestireno de 0.8-

1.1µm de diámetro cuya superficie está cargada negativamente, estas partículas
son capaces de absorber sustancias químicas, particularmente proteínas. El uso
de las partículas de látex como soporte de antígenos en pruebas de aglutinación
pasiva comparada con los eritrocitos tiene la ventaja de ser un método que
consume menos tiempo, que permite una lectura muy rápida y que proporciona
reactivos que permanecen estable por mucho tiempo.

Material y equipo

1. Placa de plástico
2. Aplicadores de madera o plástico
3. Reactivos con partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-HGC.
4. Reactivo control positivo
5. Reactivo control negativo
6. Muestra de orina de una persona embarazada
7. Muestra de orina de una persona en que se sospecha de cáncer de
testículo
8. Centrífuga.

Procedimiento

1. Colocar las muestras de orina en 2. Centrifugar las muestras a

tubos de 13x100 y ajustar el 2500 rpm por 5min.
volumen.
3. Colocar 50µL del reactivo de
4. Adicionar 50µL de la muestra de látex recubierta con anti-HGC.
orina.
6. Agitar o rotar la placa por 3
5. Con el aplicador homogeneizar min.

8. Observar cuando no hay 7. Observar la formación de

aglutinación en el control negativo. aglutinación en el control
positivo.

9. Comparar la muestra procesada 10. Realizar la interpretación de

con los controles y determinar si los resultados y determinar su
hay presencia de HGC. incidencia en hombre y en
mujeres.

¡¡¡ATENCIÓN!!!! Es necesario llevar a cabo el análisis de acuerdo al inserto

o instructivo que contiene el kit comercial.

22
 Observaciones

Dibuja:

Control (+) Control (-) Muestra

Actividades de comprobación o evaluación

1.- ¿Menciona cuáles son los factores que afectan la reacción de aglutinación?

2.- ¿Qué indica un resultado positivo para HGC en una muestra de orina de un
Hombre?

3.- ¿Qué indica un resultado positivo para HGC en una muestra de orina de
mujer?

4.- Menciona en qué casos se lleva a cabo la cuantificación de HGC.

5.- ¿Qué valores de HGC tendrá una persona que tiene 7 meses de embarazo?

Bibliografía

1. Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Todd-Sanford, Análisis Clínicos 2001. Ed: Panamericana.

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PRÁCTICA No. 5 REACCIONES FEBRILES

OBJETIVO

El objetivo de la práctica es que el alumno determine la presencia de anticuerpos

específicos contra el agente causal de diferentes procesos infecciosos por medio
de reacciones de aglutinación en placa.

FUNDAMENTO
La aglutinación de bacterias es una reacción que se lleva a cabo entre los
antígenos localizados en la superficie celular de estas (capsula, pared, flagelos,
etc.) y la población heterogénea de anticuerpos específicos ´presentes en el
huésped que estuvo en contacto con el microorganismo en cuestión. Este
contacto puede establecerse de forma natural (infecciones clínica o subclínicas)
o artificial (vacunación, inmunización de animales de experimentación).

Entre las aplicaciones más importantes de la aglutinación bacteriana esta

la identificación y clasificación de microorganismos aislados de diferentes
fuentes (exudados, heridas, sangre, alimentos, aguas negras, etc.) y el
diagnóstico de cuadros infecciosos mediante el hallazgo de anticuerpos
específicos en el suero del paciente. Así mismo, se emplean para seguir la
evolución del proceso en aquellos casos en que existe una correlación entre el
título de anticuerpos y el cuadro clínico. Aunque la relación de aglutinación es
una prueba semicuantitativa, la simplicidad y alta sensibilidad de la misma,
favorece su amplio uso.

La infección por gérmenes de diversas especies conduce a una elevación

marcada de la temperatura entre otros síntomas igualmente inespecíficos, por lo
cual se dificulta enormemente el diagnóstico de la enfermedad. Tal es el caso de
la fiebre tifoidea, causada por Salmonella typhi, las paratifoideas causadas por
Salmonella paratyphi A y B, la fiebre de Malta causada por Brucella melitensis y
el Tifo causado por Rickettsia prowasaki. Sin embargo cada uno de estos
microorganismos induce una respuesta humoral con la producción de
anticuerpos que pueden identificarse fácilmente con antígenos específicos. En
el caso de R. prowasaki es muy difícil contar con antígenos provenientes de la
bacteria, por lo que se utiliza Proteus OX19, el cual posee determinante
antigénicos comunes con Rickettsia.

24
 Materiales y reactivos

1. Placa de vidrio
2. Aplicadores
3. Micropipetas de 50, 100 y 200µL
4. Antisueros: tífico “O”, tífico “H”, paratífico “A”, paratífico ”B”, Proteus OX19
y Brucella.
5. Suero de paciente en el cual se detectan los anticuerpos específicos
6. Microcentrífuga

Procedimiento

1. Anotar en una placa de vidrio 2. Depositar en los cuadros de

con 5 hileras el antígeno cada serie 80, 40, 20, 10 y
correspondiente para cada 5 µL del suero del paciente
serie. de izquierda a derecha.

3. (Estas cantidades
4. Agregar una gota de antígeno corresponden a las
a cada una de las cantidades diluciones de 1:20, 1:40.
del suero. 1:80, 1:160: y 1:320)
respectivamente).
6. Agitar suavemente la placa
por rotación por 2min.
5. Mezclar con un aplicador
limpio comenzando con la
última dilución, se debe
utilizar un aplicador por serie.

7. Leer con luz directa, se

observa la aglutinación
macroscópica y se reporta el
valor de la última dilución
que presenta aglutinación

25
 Observaciones

Titulo Tífico Tífico Para Paratífico Proteus Brucella

anticuerpos tífico
/ Antisueros “O” “H” “B” OX19
“A”

1:20

1:40

1:80

1:160

1:320

1:640

Actividades de comprobación o evaluación

1.- ¿Qué es un título?

2.- ¿Cuáles son los microorganismos que se identifican en las reacciones

febriles?

3.- ¿Qué enfermedades se pueden identificar en las reacciones febriles?

4.- ¿Cuáles son los valores normales en las reacciones febriles?

5.- ¿a partir de que título e anticuerpos consideramos que el paciente está

cursando por una infección bacteriana?

Bibliografía

1.- Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Todd-Sanford, Análisis Clínicos 2001. Ed: Panamericana.

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Práctica No. 6 DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS

(HEMAGLUTINACIÓN)

Objetivo
Titulación de los anticuerpos antiestreptococicos y conocer las pruebas de
actividad reumática

Fundamento
La mayor parte de los grupos de estreptococos hemolítico beta de las infecciones
postestreptococicas (reumatismo articular agudo, glomérulo nefritis aguda)
producen hemolisina: la Estreptolisina O. los sujetos que han sufrido una
infección por el estreptococo beta hemolítico presentan una elevación transitoria
de los anticuerpos antiestreptolisina O.

Material y reactivos

Antiestreptolisina
Buffer de fosfatos pH=6.5
1 jeringa de 3ml
Eritrocitos “O” positivos

Procedimiento

1. Dilución 1:10, colocar 250µL de

Hacer diluciones del suero como suero con 2.25 mL de solución
sigue: amortiguadora.

2. Dilución 1:100. Colocar 0.2mL

3. Dilución: 1:500, colocar 0.4mL de de la dilución 1:10 con 1.8mL de
disolución 1:100 con 1.6mL de solución amortiguadora.
solución amortiguadora.

27
 Dilución Dilución Dilución

1:10 1:100 1:500

Tubos 1 2 4 6 8 10 12
(volumen en
ml)

Dilución del 0.4 0.1 0.4 0.2 0.5 0.3 0.1

suero

Solución 0.1 0.4 0.1 0.3 ---- 0.2 0.4

amortiguadora

Agitar todos los tubos

Estreptolisina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

“O” (1)

Agitar e incubar a 37°C durante 15min

Suspensión 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

de Glóbulos
rojos (2)

Agitar e incubar a 37°C durante 45min agitando los tubos durante este tiempo
cada 15min

Título en “O” 12 50 125 250 500 833 2500

(1).- Disolver el reactivo de estreptolisina con 10mL de agua destilada. Dividir en

4 tubos con 2.5mL cada uno. Disolver medio capilar de hidrosulfito de sodio con
2.5mL de estreptolisina reconstituida, una vez reconstituida es estable 30min.

(2).- Tomar eritrocitos de grupo “O” positivo, lavar tres veces con solución salina
y hacer una suspensión de solución amortiguadora hasta color cereza.

Observaciones

28
 Actividades de comprobación o evaluación

1.- ¿Qué es una unidad Todd?

2.- ¿Cuáles son los valores normales?

3.- Si un paciente tiene un título de ASLO de 1:525 ¿Qué indica?

4.- Describa el fundamento de la técnica de ASLO

5.- Menciona 3 factores que puedan influir en esta reacción inmune

6.- ¿Cuáles son las pruebas que conforman el perfil reumático?

7.- ¿Qué es el factor reumatoide?

8.- En qué casos se eleva la Proteína C reactiva?

9.- ¿Cuáles son los valores de referencia?

Factor reumatoide

Proteína C reactiva

10.- ¿Cuáles son los factores que influyen en estas reacciones?

Bibliografía

1.- Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Todd- Stanford. 2001. Análisis Clínicos. Edit. Panamericana

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PRACTICA No. 7 CUANTIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS

POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL O LA TÉCNICA DE MANCINI.

OBJETIVO.

Cuantificar las inmunoglobulinas del suero por medio de una reacción de difusión
radial.

FUNDAMENTO.

Las inmunoglobulinas son proteínas anticuerpo altamente específicas que

son producidas en respuesta a antígenos específicos. Los anticuerpos o
inmunoglobulinas son producidos por los linfocitos B en su forma unida a la
membrana. Este anticuerpo unido a la membrana constituye al receptor de
antígenos de la célula B. Los linfocitos B secretan anticuerpos solo tras su
diferenciación, inducida por la interacción del antígeno con el anticuerpo de
membrana de este tipo celular. Esta interacción constituye la fase de
reconocimiento de la inmunidad.

Funciones de las inmunoglobulinas

 La principal función de los anticuerpos consiste en reconocer y unirse al
antígeno, para la neutralización de este. Para conseguir este fin, el
dominio constante de la inmunoglobulina puede activar los siguientes
mecanismos:
 Activación del sistema de complemento, que termina que termina con la
lisis del microorganismo.
 Opsonización del microorganismo. Los anticuerpos se unen al antígeno,
presentándolo al macrófago para su destrucción.
 Precipitación de toxinas disueltas con el plasma. Así son fácilmente
destruidas por los macrófagos.
 Aglutinación de antígenos en una determinada zona, facilitando la acción
de los fagocitos y los linfocitos.
 Activación de linfocitos.

30
Clases y subclases de inmunoglobulinas

Inmunoglobulina G (IgG)

Se trata de la inmunoglobulina predominante en los fluidos internos del

cuerpo, como son la sangre, el líquido cefalorraquídeo y el líquido peritoneal
(líquido presente en la cavidad abdominal). Esta proteína especializada es
sintetizada por el organismo en respuesta de la invasión de bacterias, hongos,
parásitos y virus.

La IgG es la única inmunoglobulina que atraviesa la placenta,

transmitiendo la inmunidad de la madre al feto. La IgG constituye el 80% de las
inmunoglobulinas totales.
Es la inmunoglobulina más pequeña, con un peso molecular de 150,000 Dalton,
así puede pasar fácilmente del sistema circulatorio a los tejidos. La síntesis de
IgG se controla principalmente por el estímulo de los antígenos. En el caso de
los animales exénicos (sin microbios) con niveles de IgG muy bajos, el nivel de
IgG se aumenta en cuanto se les traslada a un ambiente normal. Se encuentran
cuatro subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.

Inmunoglobulina A

Es la clase de anticuerpo predomínate en las secreciones seromucosas

del organismo tales como saliva, lagrimas, calostro y secreciones respiratorias,
gastrointestinales y genitourinarias. En sangre se encuentran como una
molécula monomérica, pero en mucosas se encuentra en forma dimérica (IgA
secretora). Su función principal es identificar a los antígenos e impedir que se
localicen en las mucosas. Se encuentran dos subclases: IgA1 e IgA2.

Inmunoglobulina M

Los anticuerpos del tipo IgM son los que más rápidamente se forman en
respuesta a un estímulo antigénico (respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza
también por poseer capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar
complemento, activar la respuesta inmune, sin embargo, no atraviesa
activamente las membranas biológicas. Esta última propiedad hace que esta
inmunoglobulina ejerza su acción normalmente en los espacios intra-vasculares.
Representa del 5 al 10% de las Igs séricas totales y junto a la IgD es la más
frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como
inmunoglobulina de membrana.

Inmunoglobulina D

Presente en cantidades pequeñas de 0 a 1% de las inmunoglobulinas y

tiene un peso de 185,000 Dalton no es secretada por los plasmocitos, y no tiene
ninguna función conocida en el plasma sanguíneo. Se conoce por ser el mayor
componente de la superficie de muchas células B en etapa de maduración. Su
presencia sobre las células B sirve como marcador de diferenciación y puede
servir para controlar la activación y supresión de linfocitos. Esta no se encuentra
de manera soluble en el plasma.

31
Inmunoglobulina E

Implicada en la alergia y la respuesta inmune efectiva contra diversos

agentes patógenos, esencialmente parásitos por lo que sus niveles suelen estar
aumentados (fuera de rango) tanto en pacientes alérgicos como en una
parasitosis. Se encuentran en bajas concentraciones séricas aproximadamente
0.003mg/mL de sangre.
Las proteínas existentes en los líquidos corporales humanos forman una
reacción inmunoquímica con anticuerpos específicos en un gel de agarosa,
inmunocomplejos los cuales se ven como precipitados en forma circular
(inmunodifusion radial). El diámetro de estos anillos es directamente
proporcional a la concentración de la correspondiente proteína en la muestra.
Esta determinación cuantitativa proporciona información sobre el estado
inmunitario humoral:
 Concentraciones bajas aparecen tanto en estados primarios de
deficiencia como en los secundarios: tumores malignos, leucemina
linfática, mieloma múltiple, entre otros.
 Concentraciones altas resultan de una proliferación policlonal o
monoclonal de inmunoglobulinas: enfermedades autoinmunes, del
hígado, infecciones agudas o crónicas, entra otras.
Es posible cuantificar las inmunoglobulinas mediante otros métodos los
cuales pueden ser inmunonefelometría, espectrofotómetro y la técnica de ELISA,
siendo los valores normales:
IgA 4.7 a 8.6 g/L
IgG 5.2 a 6.8g/L
IgM 4.6 a 7.3g/L
Técnica

Material y equipo

1.- Placas de inmunodifusión conteniendo anti-IgA, Anti-IgG, anti IgM

2.- Micropipeta de 5 L
3.- Incubadora a 37ºC
4.- Suero del paciente o alumno
5.- Cámara de humedad

Procedimiento
2. Verter dicha cantidad de
suero a cada una de las placas
1. Tomar 5 L de suero NOR- Partigen (DADE Bering)
sanguíneo que se obtuvo de específicas para cada tipo de
cada alumno en la practica 1.
inmunoglobulinas (IgA, IgG e
IgM) en cada orificio asignado.
Medir los diámetros del halo
precipitado y obtener el porcentaje y 3. Dejar reposar a temperatura
concentración de inmunoglobulinas ambiente resguardadas de la luz
(g/L) por medio de las relaciones solar por 48 horas
reportadas en el manual de uso de
las placas 32
 Observaciones

Clase de Ig Diámetro (mm) Valor de referencia

IgA
IgG
IgM

Actividades de comprobación o evaluación

1.- Menciona el fundamento de la técnica de inmunodifusión radial

2.- En esta práctica ¿Cuál es el antígeno? y ¿Cuál es el anticuerpo?

3.- ¿Cuál es la concentración de IgA, IgG e IgM?

4.- ¿Qué importancia tiene llevar a cabo este análisis?

5.- Menciona en qué casos se pueden obtener resultados elevados de

inmunoglobulinas?

Bibliografía

1.- Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Todd- Stanford. 2001. Análisis Clínicos. Edit. Panamericana

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PRÁCTICA No. 8 EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO HUMANO

Objetivo.
Demostrar el efecto bactericida del suero como uno de los mecanismos
inespecíficos de defensa del organismo humano en contra de agentes biológicos
bacterianos.

Fundamento.
En 1980 Behring observó que el suero de la rata ejercía una influencia
destructora notable sobre Bacillus anthracis. Nuttal por su parte señaló que la
sangre desfibrinada de diversos animales es bactericida para determinado
número de gérmenes y que esta propiedad desaparecía después de calentarla
a 56ºC durante treinta minutos.
En 1893 Buchner demostró que este poder bactericida pertenecía al suero
exento de elementos celulares y que se trataba de un poder citotóxico general.
Posteriormente se demostró que esta propiedad se encontraba también en el
suero humano.
La capacidad bactericida del suero se incrementa cuando el hombre o los
animales se ponen en contacto previamente con las bacterias, es decir, cuando
aquellos reciben un estímulo antigénico por parte de éstos.
Actualmente se sabe que tal propiedad bactericida se debe a la presencia
en el suero, de una sustancia denominada Complemento; y que el incremento
de la propiedad se debe a la acción del complemento combinada con la acción
de anticuerpos séricos, citocinas, etc. que aparecen después del estímulo
antigénico.

Material y equipo

1. Una jeringa desechable de 5 c.c.

2. Torundas con alcohol
3. Ligadura
4. 4 tubos de 13 x 100 estériles
5. Dos cajas Petri con agar nutritivo
6. Espátula de vidrio
7. Vaso de precipitado de 50 mL con alcohol
8. Una pipeta Pasteur y bulbo de succión
9. Dos aplicadores de madera
10. Dos pipetas o micro pipetas de 0.2 mL

34
 Procedimiento

A.- OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SUERO

1. De una alícuota de suero 2. En un tubo de 13 x100 estéril que

obtenida en la práctica No. 1, contiene 0.9 ml de solución salina +
0.1 mL de bacterias Escherichia
colocar el suero en un tubo e
coli.
incubar a 37°C por 1 hr.

3. De una suspensión diez a la

4. Con la palabra CONTROL, número menos seis de un cultivo de 24:00
de grupo y equipo, incubar a 37º C. horas (SS+B).
durante 30 minutos.

6. Utilizar la varilla de vidrio en

forma de L para esparcir en toda
5. Colocar en cada caja un volumen la caja Petri, sobre el medio de
de 200 microlitros con puntas cultivo.
estériles, del que tiene bacterias y
del que no tiene.
9.
7. Incubar a 37°C durante 24 horas
8. Si hay formación de colonias del y observar cada caja anotando
mismo tamaño en la caja rotulada observaciones y dibujando la
con control, el resultado es actividad o no del complemento,
correcto. con el suero del paciente.
10.

B.- DEMOSTRACIÓN DEL EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO

1.- Marque el tubo de 13 x100 estéril que contiene 0.9 ml de solución salina +
0.1 mL de bacterias Escherichia coli, de una suspensión diez a la menos seis de
un cultivo de 24:00 horas (SS+B), con la palabra CONTROL, número de grupo y
equipo, incubar a 37º C. durante 30 minutos.
2.- Marque el tubo de 13 x100 estéril que contiene 0.9 ml de suero + 0.1 ml de
bacterias Escherichia coli, de una suspensión diez a la menos seis de n cultivo
de 24:00 horas(S+B), con la palabra PROBLEMA, número de grupo y equipo.
3.-Incubar el tubo PROBLEMA y CONTROL a 37º C. por 30 minutos.
4.- Mientras los tubos problema de todos los equipos se incuban, marque las
cajas de Petri, colocando un masking tape en la parte externa de la valva
pequeña:
a) Una con: CONTROL, número de grupo y equipo
b) Otra con: PROBLEMA, número de grupo y equipo

35
5.- Vierta 0.2 ml de tubo marcado como CONTROL (SS+B) en la caja con medio
de cultivo marcada con CONTROL y distribúyalo homogéneamente sobre la
superficie del medio con la varilla de vidrio, previamente esterilizada al flamearla
con el alcohol, en la llama del mechero.
6.- Cubra con la valva grande de la caja de medio cultivo Control que inoculó
(sembró) y déjela reposar de 1 a 3 minutos, para posteriormente invertirla con la
valva pequeña hacia arriba y déjela en la mesa.
7.- Despues de sacarla de la incubadora el tubo PROBLEMA (S+B), realice los
pasos 5 y 6, con el tubo y el medio de cultivo de la caja Petri, marcados como
PROBLEMA.
8.-Incube las cajas CONTROL y PROBLEMA a 37º C. por 24:00 horas
9.- En la siguiente práctica, revise el resultado de crecimiento de colonias y podrá
comparar la diferencia en el CONTROL y PROBLEMA al contar el número de
colonias.
10.- Escriba un reporte de los resultados.

Observaciones

Actividades de comprobación o evaluación

1.- ¿Qué es el complemento?

2.- ¿Cuáles son las funciones del complemento?

3.- Describa las vías del complemento y la fase en la que coinciden las tres

4.- ¿Qué ocurre en el problema y control empleado en esta práctica?

Bibliografía

1.- Rojas E., Anaya C.J.M., et al. 2010. Inmunología de Rojas. 15ª Edición, Edit.
Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Szebeni J. 2004. The Complement System: Novels Roles in Health and
Disease. Edit. Kluwer Academic Publishers. Boston.

36
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PRÁCTICA No. 9 DETERMINACIÓN DE IgG ANTIHEPATITIS B POR LA

TÉCNICA DE ELISA Y/O EN PEINE.

Objetivo.
Aplicar el método de ELISA indirecto para determinar anticuerpos en
suero humano contra antígenos de un agente infeccioso como es el caso del
antígeno de superficie del virus de hapatitis B.

FUNDAMENTO.
El uso de las enzimas como marcadores de anticuerpos o de antígenos
ha sido ampliamente difundido reemplazando a otros marcadores como los
fluorescentes o los radioactivos. Los métodos inmunoenzimáticos han sido
desarrollados para tres fines:
 Para la localización de constituyentes celulares
 Para la medición de pequeñas cantidades de competentes en los líquidos
biológicos.
 Para la detección de precipitados inmunológicos sobre geles o improntas
en nitrocelulosa.
Las técnicas inmunoenzimáticas cuantitativas se basan en dos tipos de
procedimientos:
 En fase heterogénea se necesita una fase sólida para inmovilizar al
antígeno o al anticuerpo asociado a la enzima y permitir la evaluación de
la actividad enzimática del complejo antígeno- anticuerpo – enzima.
 En fase homogénea no se necesita una fase sólida porque la dosificación
del complejo antígeno- anticuerpo – enzima se efectúa directamente en
la mezcla de reacción.
El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en ingles
(Enzyme linked Inmunoabsorbant Assay) fue escrito en 1971 por Engvall y
Perlman y en la actualidad se designan con este nombre a todos los
inmunoensayos enzimáticos en fase hetérogenea, su uso se ha diversificado
tanto que existen diferentes modalidades:
 ELISA método directo
 ELISA método indirecto
 ELISA tipo sándwich o captura del antígeno
 Inhibición de ELISA
 ELISA método competitivo
Que permiten determinar antígenos o anticuerpos en fluidos biológicos, sus
aplicaciones son en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o

37
parasitarias, cuantificación de hormonas, drogas, titulación de anticuerpos,
virales o parasitarias, determinación de isotipos específicos de anticuerpos, etc.
Las enzimas más empleadas en la prueba de ELISA son:
 Peroxidasa extraída del rábano
 Fosfatasa alcalina extraída de intestino de ternera o de E. coli
 Beta galactosidasa extraída de E. coli debido a su estabilidad y
reproducibilidad de resultados.
Los sustratos que se emplean para la peroxidasa son el peróxido de
hidrógeno o el peróxido de urea, que al ser reducidos dan productos incoloros,
por lo que se acompañan de cromógenos los cuales al ser oxidados en la
reacción enzimática desarrollan color.
Los cromógenos más usados:
 Orto fenilen diamina.
 Orto dianisidina que continúan en forma soluble después de ser
oxidados.
 4 Cloro 1- naftol
 Diaminobencidina
Los sustratos para la fosfatasa alcalina son:
 Para nitrofenilfosfato
 5-bromo-4 cloro- 3 indoil fosfato
La intensidad de color se puede apreciar a simple vista, pero también es posible
cuantificar la reacción mediante el uso de un fotocolorímetro, o de un
densitómetro. Los ELISAS en comparación con los radioinmunoensayos (RIA),
presentan algunas ventajas: ser más económico, no presenta el inconveniente
de la eliminación de desechos radioactivos y los conjugados anticuerpo- enzima
son más estables durante periodos más prolongados y podemos definir a los
ELISAs como método simple, específico, reproducible y muy sensible (detecta
antígeno y anticuerpo en concentraciones del orden de nanogramos).

Material y equipo

1. Placas de poliestireno de 96 pozos sensibilizados con el antígeno

2. Suero no hemolizado, ni lipémico
3. Conjugado
4. Solución de lavado
5. Sustrato
6. Cromógeno
7. Solución de Paro
8. Incubadora
9. Micropipetas de 50, 100, 200 mL
10. Si se realiza en placa se utilizará lector en placa de ELISA

Procedimiento

1. Atemperar los reactivos

2. Sacar la micropipeta y organizar como colocar las muestras

38
 3. Adicionar el suero
4. Incubar a 37ºC por 1 hr (reacción antígeno-anticuerpo)
5. Lavar con 300 mL por 4 veces
6. Adicionar el conjugado
7. Incubar a 37ºC por 1 hr
8. Lavar
9. Adicionar el sustrato al cromógeno
10. Incubar
11. Detener la reacción con ácido sulfúrico al 4N
12. Leer en absorbancia a 450 nm
13. Validar el método (de acuerdo con las Abs. de los controles negativos,
controles positivos)
14. Determinar el punto de corte.
15. Interpretar los resultados.
Nota: Los tiempos de incubación varían de acuerdo a la marca comercial
que la administración nos proporcione, revisar el inserto de cada analito a
determinar.

Observaciones

Tipo de muestra DO obtenida en la práctica DO Validación

Control Positivo
Control Positivo
Control Negativo
Control Negativo
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3

Fue validado el método

Cálculos para determinar el punto corte

Interpretación de resultados

Actividades de comprobación o evaluación

1.- ¿Defina que es el método de ELISA?

2.- ¿En qué consiste el bloqueo?

39
3.- ¿Qué conjugado se empleó en este método?

4.- ¿Cuál es el sustrato y/o cromógeno que usaste?

5.- ¿Qué enzima está unida al conjugado?

6.- ¿Qué función tiene el punto superior que se obtiene en el peine?

7.- ¿Cuál es la enzima que se ocupó en este método?

8.- ¿Qué contiene la solución de lavado?

9.- ¿Qué sustrato y /o cromógeno usaste en el método de peine?

10.- ¿Qué ventajas y desventajas observas al comparar ELISA en placa y en

peine?

Bibliografía

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Corporación para Investigaciones Biológicas. Colombia.
2.- Delves P.J., Martin S.J., et al. 2008. Roitt Inmunología Fundamentos. 11ª
Edición, Edit. Medica Panamericana. España.
3.- Todd- Stanford. 2001. Análisis Clínicos. Edit. Panamericana

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