ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE
EN GELES DE POLIACRILAMIDA
Realizado por: Revisado por: Aprobado por:
Hallar Requejo El Korchi María José Álvarez Pinazo María José Álvarez Pinazo
Página 1 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
Contenido
Contenido ...................................................................................................................................... 2
1. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 3
2. FUNDAMENTO TEÓRICO ....................................................................................................... 3
• ELECTROFORESIS ............................................................................................................... 3
• SEPARACIÓN DE LA PROTEÍNA MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
EN PRESENCIA DE SDS. .............................................................................................................. 3
• PROPIEDADES DEL PATRÓN DE PROTEÍNAS DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA
RELACIONADAS CON ESTA PRÁCTICA ....................................................................................... 4
• PROPIEDADES DE LA MUESTRA......................................................................................... 4
3. MATERIALES Y REACTIVOS .................................................................................................... 4
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA................................... 5
• PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS .................................................................................... 5
• PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................................ 7
• PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS ............................................................................. 8
5. DATOS Y CÁLCULOS ............................................................................................................. 10
6. RESULTADOS ....................................................................................................................... 10
7. OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES .................................................................................... 10
8. GESTIÓN DE RESIDUOS........................................................................................................ 11
9. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 11
Página 2 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
1. OBJETIVOS
Conocer las técnicas de electroforesis de proteínas en geles de SDS-PAGE, la separación de
proteínas de un extracto problema y la determinación del peso molecular de dichas proteínas.
2. FUNDAMENTO TEÓRICO
• ELECTROFORESIS
Esta es una técnica que permite la separación de moléculas en función de sus diferentes
relaciones carga/masa. Tanto los ácidos nucleicos como las proteínas poseen una carga eléctrica
determina, estas macromoléculas podrán migrar en un campo eléctrico de acuerdo con su carga.
La velocidad de la migración dependerá de la intensidad el campo eléctrico aplicada, la carga
neta de la macromolécula, del coeficiente de fricción que expresa la resistencia al movimiento
de la partícula, de la viscosidad del medio y el tamaño de la partícula.
• SEPARACIÓN DE LA PROTEÍNA MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS.
Existen diferentes técnicas y aparatos para el uso de la separación y purificación de proteínas
por electroforesis. Sin embargo, la técnica más empleada es la formación de una placa de gel de
poliacrilamida en la que se utiliza el método desarrollado por Laemmli (1970). En este método
se lleva a cabo la preparación de placas de gel de poliacrilamida que contienen dodecil sulfato
de sodio, denominando esta técnica como “SDS‐PAGE”, por las siglas en inglés de Sodium
Dodecil Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis. Las placas de gel de poliacrilamida se
forman por la co‐polimerización de la acrilamida para lo cual se utiliza un agente entrecruzador
como la N,N’‐metilen bis‐acrilamida en presencia de un catalizador de ion persulfato en forma
de persulfato de amonio y un iniciador como TEMED (N,N,N,N'‐tetrametilendiamina). La
polimerización depende de la temperatura. Se recomienda utilizar una temperatura por encima
de los 20°C para prevenir una polimerización incompleta. La polimerización se debe realizar en
una atmósfera inerte ya que el oxígeno puede actuar como un neutralizador de radicales libres,
generados por el ión persulfato, por lo que se deben utilizar cámaras verticales que dispongan
de dos placas de vidrios selladas o en tubos para formar geles en disco (Disc gel) y de esta manera
disminuir la absorción de oxígeno por los geles. Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues
el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor
que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel. En la electroforesis en disco,
también se emplea riboflavina para polimerizar la acrilamida.
La velocidad de polimerización está determinada por la concentración de persulfato de amonio
y TEMED. Mientras que la porosidad del gel, la determinan las proporciones relativas de
poliacrilamida (C) y bis‐acrilamida (T), siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida haya en
relación a la concentración de acrilamida. El porcentaje total de acrilamida/bis‐acrilamida
determina el rango de separación del gel. Habitualmente los geles se denominan en función del
% de acrilamida/bisacrilamida que 82 NACAMEH Vol. 9, No. 2, pp. 77‐96, 2015 contienen. Así, la
mayoría de las proteínas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor
tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.
Página 3 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
La electroforesis desnaturalizante, la más común, también conocida como SDS‐PAGE, debido a
que se utiliza el detergente dodecil sulfato de sodio o SDS. Este tratamiento asegura la
desnaturalización total de la proteína por pérdida de su estructura tridimensional. A su vez, la
cadena hidrocarbonada hidrófoba del SDS rodeará a las cadenas polipéptidicas, ya separadas,
orientando el ion sulfato, hidrofílico, con carga negativa hacia el medio acuoso. De esta manera
todas las cadenas polipeptídicas adquieren una carga negativa neta y todas las cadenas
polipeptídicas quedan aisladas. La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la
molécula pero no a su forma. La separación de los complejos SDS‐proteína es proporcional solo
a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede
entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un
patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos.
• PROPIEDADES DEL PATRÓN DE PROTEÍNAS DE CONCENTRACIÓN
CONOCIDA RELACIONADAS CON ESTA PRÁCTICA
Se emplea un patrón de proteínas de peso molecular conocido, “Panreac Protein Marker VI”.
Este patrón presenta proteínas de tamaño molecular comprendido entre 245 y 10 kDa: 245,180,
135, 100, 75, 63, 48, 35, 25, 20, 17 y 11 kDa.
• PROPIEDADES DE LA MUESTRA
Las globulinas constituyen el grupo de proteínas de reserva presente en mayor proporción en la
familia de las leguminosas. Esta proteína es soluble en agua y en ácidos y álcalis débiles, y no
coagula por efecto del calor. Se asemeja a la caseína de la leche de los mamíferos, la cual fue
considerada idéntica por Liebig y otros, y por lo tanto fue llamada "caseína vegetal". Contiene
menos carbono y más nitrógeno que la caseína.
3. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES REACTIVOS
• Equipo de electroforesis • Muestras de extractos proteicos
• Centrifugadora • Solución de
• Espátula acrilamida/bisacrilamida 30%
• Micropipetas • Tris-Base
• Agitador de bandejas • SDS
• Puntas para micropipetas • Glicerol
• Marcador de pocillos • Azul bromofenol
• Bandejas de plástico • 2-Mercaptoetanol
• Vórtex • Glicina
• Pipeta Pasteur • Persulfato amónico (APS)
• Tubos Falcon • TEMED
• Tubos Eppendorf • Azul de coomassie
• Baño maría
Página 4 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
• pH-metro
• Papel de filtro
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y PREPARACIÓN DE LA
MUESTRA
• PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
o Tampón para gel separador Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Para preparar 1000 ml, tomar 118,2 g de Tris-HCl pesados en balanza analítica directamente
sobre un tubo Falcon limpio apoyado sobre un vaso de precipitados. A continuación, enrasar
con agua destilada hasta 1000 ml y disolver con ayuda de un agitador vórtex. Para ajustar el pH
a 8,8 emplear una solución concentrada de NaOH y HCl 2 M sin añadir más de 10 gotas para
evitar la dilución del tampón.
o Tampón para gel concentrador y muestra Tris-HCl 1 M pH 6,8
Se preparan 500 ml a partir de tampón Tris-HCl 1 M pH 7,5 que se encontraba preparado.
Ci · Vi = Cf · Vf
1.5 M · Vi = 1 M · 500 ml
Vi = 333.33 ml
o SDS 10 % (p/v)
Se preparan 50 ml a partir de SDS 20% que se encontraba preparado.
Ci · Vi = Cf · Vf
20% · Vi = 10% · 50 ml
Vi = 25 ml
o Persulfato amónico (APS) 100%
Se prepara en el momento de su adición.
Pesar 200 mg de APS en un Eppendorf y disolver en 200 µL, homogeneizando la disolución
mediante succión y expulsión con la pipeta automática.
o Gel separador al 13% de acrilamida en tampón Tris-HCl 0,375 M y pH 8,8
Para preparar 10 ml realizar la siguiente mezcla:
COMPONENTES VOLUMEN (µL)
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 2500
SDS 10% 100
Acrilamida/Bisacrilamida 30% 4300
Página 5 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
APS 100% 50
TEMED 10
Agua destilada 3000
o Gel concentrador al 3% de acrilamida en tampón Tris-HCl 0,125 M y pH 6,8
Para preparar 10 ml realizar la siguiente mezcla:
COMPONENTES VOLUMEN (µL)
Tris-HCl 1 M pH 6,8 2500
SDS 10% 100
Acrilamida/Bisacrilamida 30% 1000
APS 100% 100
TEMED 10
Agua destilada 6290
o Tampón de la muestra
Para preparar se usa la siguiente mezcla:
COMPONENTES VOLUMEN (µL)
Tris-HCl 1 M pH 6,8 500
SDS 10% 800
Glicerol 800
Azul de Bromofenol 1% 400
2-mercaptoetanol Más tarde
Agua destilada 900
* En el momento de uso, tomar 1 ml de la mezcla sin 2-mercaptoetanol con pipeta automática
y pasar a un Eppendorf. A continuación, adicionar 59 µl de 2-mercaptoetanol con pipeta
automática y homogeneizar mediante succión y expulsión (en campana de gases).
o Tampón madre de electroforesis 10x Tris Glicina pH 8,3
Se encontraba preparado. Se elabora siguiendo el siguiente protocolo:
COMPONENTES CANTIDAD
Tris base 3g
Glicina 14,4g
SDS 1g
Agua destilada 80ml
Disolver los componentes y ajustar pH a 8,3 con HCl concentrado, transvasar a un matraz
aforado de 100 ml y enrasar con agua destilada hasta la señal de aforo.
Página 6 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
o Tampón trabajo de electroforesis 1x Tris Glicina pH 8,3
Para preparar 200 ml:
COMPONENTES VOLUMEN (ml)
Solución concentrada x10 20
Agua destilada 180
o Solución de tinción azul de Coomassie
Se dispone de una tinción antigua y es preferible elaborar una nueva, para preparar 200 ml (en
campana de gases):
COMPONENTES CANTIDAD
Azul de Coomassie R-250 0,2g
Ácido acético 20ml
Metanol 80ml
Agua destilada 100ml
Se mantiene en agitación hasta total disolución y se filtra antes de almacenar en un frasco
topacio que lo proteja de la oscuridad.
o Solución decolorante de geles
Para preparar 100 ml (en campana de gases):
COMPONENTES VOLUMEN (ml)
Ácido acético 10
Metanol 40
Agua destilada 50
• PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
o Toma de la muestra
1. Se toma el material seco, en este caso garbanzos, y se trituran con el molinillo hasta
convertirlo en una harina, esta debe ser tamizada con un tamiz de 2mm de luz de malla.
2. Se pesan 5 gramos de muestra en un tubo de rosca
3. Se le añaden 15 ml de éter dietílico (frio)
4. Agitar por 5 min y dejar reposar 1 min. Repetir esto 3 veces.
5. Se desecha la parte etérea, la cual contiene los lípidos, en un bote de residuos de etéreos.
6. Nuevamente se añade el éter dietílico y se repite la extracción, explicada en el punto anterior.
Página 7 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
7. Una vez acabada la extracción, se seca el polvo desgrasado con ayuda de un secador.
o Extracción de proteínas
1. Se comienza pesando 0.5g de la muestra desgrasada en un tubo de rosca, se le añade 5 ml de
la solución extrayente constituida por NaCl 0.5M, NaOH 0.5N, alcohol 80% y agua destilada a
partes iguales.
2. Cada vez que se añada la solución extrayente se debe llevar al vortex por 10 min y luego
centrifugar durante 5 min, y recoger el sobrenadante en un tubo Falcon. Este proceso se a de
repetir 3 veces, hasta completar la extracción de las proteínas.
3. A continuación se comienza con el método Bradford, comenzando por preparar un blanco
constituido por 20μL de la solución extrayente y 200 μL del reactivo Bradford.
4. Colocar en una cubeta 20μL de la muestra problema, se le añaden 200 μL del reactivo Bradford
y se mezcla.
5. Incubar por unos minutos a temperatura ambiente comprobar el color con la escala de colores
Bradford y determinar cualitativamente a qué conocido patrón corresponde la muestra
desconocida.
o Preparación de la muestra
1. Se toman 50 µL de la muestra (solución de globulina de lenteja concentrada) con una pipeta
automática, debidamente ajustada a dicho volumen, y una punta adecuada a la misma. Para
ello, presionar el botón de la pipeta hasta el primer tope, sumergir la punta en la muestra
(contenida en un tubo eppendorf) y soltar el botón suavemente para evitar que se formen
burbujas. Transvasar dicho volumen a un tubo enppendorf.
2. Añadir 50 µL de tampón de muestra y homogeneizar con la pipeta automática mediante
succión y expulsión.
3. Dejar ligeramente abierta la tapa del tubo y calentar a 100 ºC durante 5 minutos al baño maría
(con ayuda de un flotador). Digestión de la muestra.
4. Centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el fondo
del tubo.
• PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS
o Preparación del gel separador 13%
1. Realizar el montaje del molde del gel. Llenar con agua destilada para asegurar que no presenta
fugas y secar con papel de filtro.
2. Mezclar los componentes del gel en un tubo Falcon.
3. Utilizando una micropipeta de 1000 µl, añadir la mezcla en el interior del molde hasta una
altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede suficiente
espacio para el gen concentrador. Desechar la punta de la pipeta.
Página 8 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
4. A continuación, usando la pipeta automática con una punta limpia, cubrir la superficie con
isopropanol para prevenir el contacto del oxígeno con el gel, lo cual inhibiría la polimerización.
5. Controlar la polimerización del gel con el sobrante que queda en el tubo Falcon.
o Preparación del gel concentrador 3%
1. Una vez polimerizado el gel separador, retirar el isopropanol con papel de filtro y lavar la parte
superior 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier resto de isopropanol o de
acrilamida no polimerizada. Secar con papel de filtro.
2. Mezclar los componentes del gel en un tubo Falcon.
3. Utilizando una micropipeta de 1000 µl añadir la mezcla en el interior del molde hasta cubrir
la zona superior. Inmediatamente insertar el peine de pocillos en la solución concentradora con
cuidado para evitar que se formen burbujas de aire.
4. Controlar la polimerización del gel con el sobrante que queda en el tubo Falcon.
5. Tras polimerizar, retirar el peine cuidadosamente con un movimiento vertical. Usando un
frasco lavador, enjuagar los pocillos 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier resto
de acrilamida y secar.
o Electroforesis
1. Insertar las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis limpia.
2. Añadir tampón de electroforesis en los reservorios interior y exterior. Retiran las burbujas de
aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos introduciendo tampón de electroforesis en
los mismos.
3. Se aplican, con ayuda de una pipeta automática, 18 µl de cada muestra procesada en un
pocillo correspondiente; reservando uno para el patrón de proteínas Panreac VI.
4. Conectar los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación. Aplicar una
corriente eléctrica de 160 V durante 45 minutos.
5. Una vez terminada la electroforesis desconectar de la fuente de alimentación, retirar los
electrodos y sacar los geles de la cubeta de electroforesis del interior del molde con guantes de
látex, separando cuidadosamente con una espátula ambos cristales.
6. Separar con cuidado el gel concentrador.
o Revelado mediante tinción del gel con azul de coomassie
Página 9 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
1. Transferir el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de tinción de
coomassie. Teñir los geles con la solución de azul de coomasie en agitación suave durante 30
minutos – 1 hora.
2. Transferir el gel a un recipiente que contiene solución decolorante. Incubar en agitación hasta
que solo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la solución decolorante tantas veces
como sea necesario.
3. Retirar la solución decolorante y enjuagar con agua destilada.
4. Fotografiar los geles para estudiar los coeficientes de reparto de los patrones y las muestras
para determinar el peso molecular de las muestras problema.
5. DATOS Y CÁLCULOS
No se pueden apreciar resultados en el gel, por tanto no se obtienen cálculos.
6. RESULTADOS
No se pueden apreciar resultados en el gel, por tanto no se obtienen resultados ni conclusiones
(no se a encontrado fotográfica en la lámpara UV)
Como podemos observar en la imagen no se
aprecian las bandas de proteínas por tanto no se
puede obtener un resultado y por tanto
conclusiones
7. OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES
En la lectura del gel no se observan las bandas de proteínas esto se puede deber a diversos
factores:
• No se preparo el gel con la concentración indicada, ya que este no gelificaba y se
estuvo realizando pruebas con distintas concentraciones.
• Que la muestra no haya migrado al gel separador.
Página 10 de 11
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE EN GELES DE EB/INF/05
POLIACRILAMIDA
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 28/12/22
• Que el voltaje en la electroforesis haya sido incorrecto.
• El manejo de volúmenes y cantidades tan pequeñas hace posible una mayor
probabilidad de perdida de muestra.
• Entre otras causas que podrían haber afectado.
8. GESTIÓN DE RESIDUOS
• La acrilamida es una sustancia neurotóxica, esta fue guardada para su posterior gestión
de forma adecuada.
• Demás residuos no tóxicos ni dañinos fueron echados por el desagüe.
• El lugar de trabajo, tras cada jornada, fue limpiado y desinfectado con una solución de
lejía y agua.
9. BIBLIOGRAFÍA
• Fundamento:
file:///C:/Users/34602/Downloads/Dialnet-
ElectroforesisEnGelDePoliacrilamidaSDSComoHerramie-6020409.pdf
Página 11 de 11
