PRÁCTICA 8

Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote

Producción de biomasa en
Cultivo por lote

1.0 INTRODUCCIÓN

Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: sistemas cerrados,

abiertos y semicerrados. Al primer grupo pertenece el Cultivo por Lote (CL), en el
cual una vez iniciada la fermentación ya no existe entrada ni salida de materiales.

Hasta la fecha la gran mayoría de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a

cabo en cultivo por lote. Este consiste en agregar al biorreactor un medio de
cultivo que contiene los nutrientes necesarios (fuentes de carbono, de nitrógeno y
de macro y micro elementos) para el crecimiento del microorganismo y/o para la
producción de un metabolito. El medio de cultivo se esteriliza con calor húmedo y
se enfría hasta la temperatura de fermentación. Se inocula con el microorganismo
de interés para permitir que con el tiempo se desarrolle y produzca el metabolito.
La biorreacción termina hasta que ocurre el agotamiento de uno o más de los
nutrientes del medio de cultivo. En este punto se cosecha la totalidad del volumen
del medio agotado para recuperar el producto. Una vez vacío el biorreactor se
limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente biorreacción.

De esta manera, después de inocular un medio de cultivo para desarrollar un CL

las concentraciones de células (x), de sustrato residual (s) y de producto (p)
evolucionarán de una forma determinada con respecto al tiempo de la
biorreacción.

Una representación gráfica de dicha evolución se observa en las figuras 1 y 2.

40 18

35 16

14
30
Biomasa (x) y Sustrato "s" (g/l)

12
25 "s" g/l
10
20
8

15 Biomasa
6 (g/l)

10
4

5 2

0 0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)

Figura 1. Evolución de la concentración celular o biomasa (x) y del sustrato (s) con
el tiempo en un CL.
 x, p
P (a)

Tiempo

Figura 2. Evolución de la concentración celular o biomasa (x) y del producto (P)

con el tiempo en un CL.

La evolución con respecto al tiempo de dichas concentraciones estará apegada al

modelo matemático al que la biorreacción se ajuste. En dichos modelos se
establecen ciertos parámetros cinéticos que caracterizarán a la biorreacción tales
como la velocidad específica de crecimiento (), la velocidad específica de
crecimiento máxima (max), la velocidad específica de consumo de sustrato (qs), la
velocidad específica de formación de producto (qp), el rendimiento celular con
base en el consumo del sustrato (Yx/s), la productividad celular (Prodx), la
productividad del producto (Prodp), etc.

La determinación de los parámetros cinéticos durante un cultivo por lote tiene la

finalidad de conocer, predecir y controlar la biorreacción. Una característica de
este tipo de cultivo es que todos los parámetros cinéticos varían con el tiempo de
la biorreacción.
Con los resultados experimentales de x, s, y p VS t obtenidos en un CL, se pueden
obtener prácticamente todos los parámetros cinéticos. Los valores obtenidos son
lo suficientemente confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente
durante la biorreacción.

2.0 OBJETIVO

El alumno propagará en un biorreactor de nivel laboratorio una cepa de levadura

Cándida Utilis o Saccharomyces cerevisiae en un CL y obtendrá
experimentalmente sus parámetros cinéticos.

3.0 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1 PREPARACIÓN Y DESARROLLO DEL INÓCULO

Se preparan 200 ml de medio de cultivo para desarrollo del inóculo (ver cuadro 3),
los cuales se reparten en dos matraces Erlenmeyer de 500 ml de capacidad con
100 ml de medio cada uno. Se tapan con tapón de algodón y gaza (de acuerdo a
las indicaciones de trabajo microbiológico). Se esterilizan a 121°C durante 15 min.
Ya fríos y estériles, de uno de los 2 matraces se toman 10 ml del medio estéril en
condiciones asépticas y se adicionan sobre la cepa crecida en PDA y contenida en
tubo inclinado. Se resuspende el crecimiento del tubo con un vórtex y en
condiciones asépticas se agregan 5 ml (aproximadamente) a cada uno de los 2
matraces. Estos se incuban en una agitadora a 150 rpm y a una temperatura de
350C durante 20 horas. El crecimiento obtenido servirá para inocular el medio de
cultivo (1800 ml) contenido en el biorreactor. De esta manera la relación de inóculo
es de 1/10 V/V.

3.2 PREPARACIÓN, ESTERILIZACIÓN E INOCULACIÓN DEL BIORREACTOR.

Se preparan 1800 ml de medio de cultivo para el cultivo por lote (ver cuadro 3) y
se ajusta el pH a 4.0 con una solución de NH4OH, 2N. Este medio se adiciona al
biorreactor previamente preparado (de acuerdo a las indicaciones del profesor) y
se esteriliza en una autoclave a 121°C durante 15 min. Pueden esterilizarse de
manera conjunta los recipientes que contienen el antiespumante y el álcali. Se
enfría siguiendo las indicaciones del profesor.

El fermentador se conecta adecuadamente para ajustar la agitación, aireación y

temperatura a los valores de trabajo. Ya ajustados a estos valores se procede a
inocularlo, en condiciones asépticas, con el crecimiento obtenido en los dos
matraces en los que se propagó el inóculo. En este momento inicia el CL (tiempo
cero). El cultivo operará bajo las condiciones de operación especificadas en el
cuadro 1.

Cuadro 1. Condiciones de operación en el biorreactor.

velocidad de agitación 500 rpm
Aireación 1 vvm
Temperatura 35 °c
pH 3.8 (ajustar con NH4OH, 2N)
Antiespumante Adicionar sólo si hay formación
de espuma.

3.3 SEGUIMIENTO DE LA BIORREACCIÓN.

Se tomarán muestras de aproximadamente 10 ml del medio agotado cada hora (a
las que denominaremos “mma:0,1,2,3,4,etc.”) para determinar la concentración celular
(x) y la de glucosa residual (s) [ver punto 3.3.1]. Las determinaciones se harán por
duplicado. El cultivo por lote durará aprox. 12 horas durante las cuales se
controlará el pH a 3.8 con una solución de NH4OH, 2N y la temperatura a 35°C.

La bitácora que se llevará durante el seguimiento de la biorreacción se muestra en

el cuadro 2.
 Cuadro 2. Bitácora de la biorreacción.
Fecha Hora Edad Determinación de la concentración Determinación de la concentración
de celular. de glucosa residual.
cultivo As Dilución Concentración As Dilución Concentración
(610 celular “x” (g/l) (540 de “s” (g/l)
nm) nm)

3.3.1 Procesamiento de muestras.

Las muestras “mma” que se toman cada hora se tratarán bajo el esquema de la
figura 3.

MUESTRA “mma” (10 ml)

Determinación de la concentración Centrifugar y en el sobrenadante “mmac”

(5mL) (5mL)
celular mediante lectura de la determinar de la concentración de glucosa
absorbancia (ver punto 4.4.1). residual (ver punto 4.4.2.3).

Figura 3. Procesamiento de las muestras.

4.0 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Equipo
 Autoclave (15 L de capacidad)
 Incubadora rotatoria de temperatura controlada
 Fermentador con ambiente controlado (de 2 litros)
 Electrodo de pH esterilizable
 Medidor controlador de pH
  Bombas peristáltica (0 a 2 L/h)
 Placas de calentamiento y agitación
 Espectrofotómetro (rango: visible y UV)
 Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm)
 Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad.)
 Estufa
 Equipo de filtración con vacío

4.2 Microorganismo
El microorganismo a emplear en la presente práctica podrá ser: Cándida utilis o
Saccharomyces cerevisiae.
La cepa se proporciona en un tubo con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) sobre el que ha crecido.

4.3 Medios de Cultivo

Los 2 medios de cultivo a emplear en esta práctica se muestran en el cuadro 3.
Cuadro 3. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA MEDIO PARA
EL INOCULO EL CULTIVO
(g/L) POR LOTE
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365
NaH2PO4 1.2637 1.2637
Extracto de 0.990 0.990
levadura
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Nota: Emplear agua destilada para la formulación del medio para el inóculo
y agua de la llave para la formulación del medio para el CL.
(*) Las sales se encuentran disueltas en una solución concentrada preparada
previamente. El volumen (en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente
relación:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio a emplear (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inóculo).

4.4 Métodos analíticos

4.4.1 Determinación de la concentración celular (x)

Procedimiento: Se toma una alícuota de la muestra “mma” tomada del biorreactor.
Se agrega en una cubeta para espectrofotometría. Se lee la absorbancia (As) a
610 nm utilizando como blanco un determinado volumen de medio de cultivo
estéril. Mediante la curva tipo que se les proporcionará previamente, obtenga la
concentración celular “x” (en g/l) de la muestra.

Si la absorbancia de la muestra “mma” está por arriba del máximo valor mostrado
en la curva tipo, realice una dilución apropiada a la muestra “mma” para que la
nueva absorbancia esté comprendida dentro del intervalo reportado en dicha curva
(anote la dilución). Con ayuda de la curva tipo obtenga la concentración celular de
la muestra diluida. Multiplique el valor de la concentración celular obtenida por la
dilución realizada para obtener la de la muestra original que será la que deberá
anotarse en el cuadro 2.

4.4.2 Determinación de la concentración de glucosa residual.

Para la determinación de glucosa, se empleará el método del DNS. Para ello
deberán preparar los reactivos necesarios así como una curva tipo de glucosa.

4.4.2.1 Preparación de la solución del ácido DNS:

Pesar 1g de ácido 3,5- dinitrosalicílico y disolverlo, con cuidado y lentamente, en
20 ml de una solución de NaOH 2N. Se le agregan en el siguiente orden: 50 ml de
agua destilada y 30 g de tartrato de sodio y potasio. Se afora a un volumen final de
100ml con agua destilada.

4.4.2.2 Curva tipo de glucosa.

Se prepara una solución estándar de glucosa que contenga una concentración lo
más exactamente posible de 1 g/l. Se preparan una serie de tubos de ensaye
siguiendo las indicaciones del cuadro 4.

Cuadro 4. Preparación de tubos para la curva tipo de glucosa.

Tubo No. 1 2 3 4 5 6
Volumen de agua destilada (ml) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
Volumen de la solución de glucosa de 1 g/l 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
(ml).
Volumen final (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

Al volumen final de cada uno de los tubos, se les agrega 0.25 ml de la solución de
DNS. Se someten a ebullición durante 5 minutos en un baño María. Transcurrido
este tiempo, se enfrían los tubos de ensaye rápidamente al chorro de agua. Se
adicionan a cada uno de ellos 5 ml de agua destilada. Se lee la absorbancia de
cada tubo a 540 nm utilizando como blanco el tubo número 1 que es el blanco de
reactivo.

4.4.2.3 Procesamiento de las muestras para la cuantificación de glucosa residual

(s).
Se centrifugan 5 ml de la muestra “mma” (que contiene células y glucosa no
consumida) a 5000 rpm durante 10 minutos. Se recolecta cuidadosamente el
sobrenadante “mma,0,1,2,3,4,etc” en el que se encuentra la glucosa residual. El
paquete celular se desecha disponiéndolo adecuadamente.

Se adicionan 0.25 ml del sobrenadante anterior debidamente diluido a cada uno

de 2 tubos de ensaye (duplicado) y se le agregan 0.25 ml de la solución de DNS.
Se someten a ebullición durante 5 minutos en un baño María. Se enfrían
rápidamente al chorro de agua y se adicionan 5 ml de agua destilada. Se lee la
absorbancia a 540 nm utilizando como blanco un “blanco de reactivo” (de acuerdo
a la sección 4.4.2.2). Se recomienda emplear 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa.

La concentración de glucosa residual (en g/l) se puede obtener con la As obtenida

y con la curva tipo de glucosa o con los 2 controles empleados, tomando en
consideración, en los dos casos, la dilución realizada.

NOTA IMPORTANTE: Se debe asegurar que la concentración de glucosa residual

en la muestra a tratar “mma,0,1,2,3,4,etc.” no esté por arriba de 1.0 g/l dado que esta es
la máxima concentración establecida en la curva tipo. Para ello, se debe realizar la
dilución apropiada de dicha muestra para que la concentración de glucosa de la
misma sea menor a 1.0 g/l. Estas muestras diluidas serán a las que se le
practicará el método del DNS, tal como se describió líneas arriba para que la
absorbancia (As), una vez desarrollado el color, esté comprendida dentro del
intervalo de la curva tipo (anote la dilución). Con este valor de As y con ayuda de
la curva tipo se obtiene la concentración de glucosa residual de la muestra diluida.
Al multiplicarse por el valor de la dilución, se obtiene la de la muestra original. Esta
será la concentración a reportar en el cuadro 2.

5.0 FORMULACIÓN DE RESULTADOS

5.1 Presentar los resultados en el cuadro 2.

5.2 Presentar la curva tipo de glucosa.
5.3 Elaborar los siguientes gráficos:
a) Concentración celular (x) vs. Tiempo “t” (identificar las fases del
crecimiento).
b) Concentración de glucosa residual (s) vs. Tiempo “t”.
c) Concentración celular (x) vs concentración de glucosa residual (s).
 d) Logaritmo natural de la concentración celular (Ln x) vs. Tiempo “t” (solo
para la fase exponencial)
5.4 Determinar los siguientes conceptos:
a) Velocidad específica de crecimiento máxima (max).
Esta se obtiene de la pendiente de la gráfica del punto 5.3 b.
b) Velocidad específica de crecimiento () a cada tiempo de cultivo.
Esta se obtiene al obtener la tangente de la gráfica 5.3 a (dx/dt) y dividir
este valor entre la concentración celular (x) a cada tiempo [ = ( / )/ ].
c) Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yx/s) a cada tiempo
de cultivo.
( )
Esta se obtiene con la siguiente ecuación: / = ( )
. En la que x2 es la

concentración celular a un tiempo dado y x1 es la concentración celular en

el tiempo anterior. Se aplica en el sentido inverso para s 1 y s2.
d) Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s (global)).
Este parámetro se obtiene de la pendiente de la gráfica del punto 5.3 c.
e) Velocidad específica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de
cultivo.
Este parámetro se obtiene al dividir la m obtenida en el punto 5.4 b entre
el rendimiento obtenido en el punto 5.4 c, a los mismos tiempos.
f) Productividad celular global (Rx global).
Este parámetro se obtiene al dividir la máxima concentración celular (x max)
obtenida en la figura 5.3 a, entre el tiempo requerido para alcanzarla.

Finalmente, el alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica y elaborará

un resumen de la misma.

BIBLIOGRAFÍA

1.- Dunn, I. J. Y J. R. Mor (1975). "Variable-volumen continuous cultivation".

Biotechnol. Bioeng. 17: 1805-1822.
2.- Pirt, S. J. (1975) "Principles of microbial and cell cultivation". Black Well
Scientific Publications, London.
3.- Whitaker, A. (1980). Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.
4.- Yamané, T., y S. Hirano (1977). Semibatch culture of microorganism with
constant feed of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol.
55:156-165.

Actividades previas a realizar (en una sesión anterior al desarrollo del CL).

1. Preparación del reactivo DNS y elaboración de la Curva Tipo de glucosa.

2. Preparación del medio de cultivo para el inóculo en matraces Erlenmeyer.
Esterilización y enfriamiento de los mismos. Inoculación de los matraces con la
cepa a emplear. Incubación durante 20 horas.
3. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote. Agregarlo al
biorreactor. Preparación del biorreactor. Esterilización y enfriamiento del mismo
con el medio de cultivo. Esterilización del álcali y del antiespumante.

Al finalizar la fermentación deberá vaciarse el biorreactor y lavarlo adecuadamente

para finalizar la Práctica.
PRÁCTICA 9

Producción de biomasa en
Cultivo por lote alimentado

1.0 INTRODUCCIÓN

Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: sistemas cerrados,

abiertos y semicerrados. Al primer grupo pertenece el Cultivo por Lote (CL), en el
cual una vez iniciada la fermentación ya no existe entrada ni salida de materiales.

Los cultivos continuos pertenecen al segundo grupo. En estos existe un flujo

constante de entrada de medio fresco y una salida de mosto agotado al mismo
flujo que el de entrada, de tal manera que el volumen en el interior del biorreactor
permanece constante.

A diferencia de los sistemas abiertos, en los semicerrados sólo existe un flujo de

entrada (Fa) de nutrientes sin que exista una salida, de tal manera que el volumen
en el interior del biorreactor incrementará en función del tipo y valor del flujo
manejado (dV/dt = Fa). Se pueden manejar flujos constantes (F a = cte), lineales
(Fa = Fa0 + gt), exponencial (Fa = Fa0emt).
El medio de alimentación contiene todos los nutrientes incluida la fuente de
carbono. La concentración de la misma se denominará como “S F”. A estos
sistemas también se les conoce como de volumen variable y se les denomina
genéricamente como cultivos Fed-batch (término introducido por Yoshida en 1973)
o “Cultivos por Lote Alimentado (CLA)” porque operativamente parten de un
volumen inicial “V0” (que generalmente es menor al volumen máximo de operación
del biorreactor “Vop”) que se trabaja primeramente en cultivo por lote hasta que en
un cierto tiempo se inicia la alimentación de nutrientes. La biorreacción termina
una vez que se alcanza el “Vop” (ver figura 1). Este tipo de cultivo se clasifica de
acuerdo al tipo de flujo utilizado en la alimentación en: a) alimentación constante
(CLA-AC); b) alimentación lineal (CLA-AL); c) alimentación exponencial (CLA-AEx)
y d) alimentación variable (CLA-AV). La corriente de alimentación tiene por objeto
mantener el crecimiento del microorganismo o la producción de un metabolito
proporcionando los materiales necesarios.

Figura 1. Esquema típico de una fermentación en cultivo por lote alimentado.

Hasta antes de la mitad de la década de los setentas, el CLA-AC se empleaba de

manera empírica por ser más productivo que el cultivo por lote. Fue hasta 1975
cuando Pirt reportó un tratamiento matemático de este sistema, el cual consiste en
el conjunto de ecuaciones diferenciales que describen las velocidades de
formación de biomasa, sustrato y producto conocidos como balances de masa de
cada uno de ellos (Acumulación = Entrada - Salida + Generación – Desaparición
<consumo o muerte>).

La solución de las ecuaciones diferenciales en conjunto con los modelos

matemáticos a los que se ajusten las biorreacciones, proporcionarán la forma en la
que variarán la biomasa (x), el sustrato (s) y el producto (p) en función del tiempo.

Una representación gráfica de la evolución de un CLA-AC se observa en la Figura

2.

Al variar el volumen en este tipo de cultivo, debe tenerse presente que la evolución
de la “concentración” (masa/volumen) de x, s y p con respecto al tiempo quedará
sujeta a la forma con la que variarán la masa total de cada una de ellas (X, S y P)
y el volumen con respecto del tiempo. Habrá de notarse que existirán casos en los
que la concentración celular pueda permanecer constante (x = cte) si la velocidad
con la que varía la masa total de células (X) con respecto al tiempo (t) es de la
misma forma y magnitud que con la que varía el volumen total (V). En síntesis: si
X y V son una función del tiempo [X = f(t) y V = f(t)] y ambas varían en la misma
forma y magnitud, entonces X/V = cte. = x

La evolución con respecto al tiempo de dichas variables estará apegada al modelo

matemático al que la biorreacción se ajuste y al tipo y valor del flujo utilizado. En
dichos modelos se establecen ciertos parámetros cinéticos que caracterizarán a la
biorreacción tales como la velocidad específica de crecimiento (), la velocidad
específica de crecimiento máxima (max), la velocidad específica de consumo de
sustrato (qs), la velocidad específica de formación de producto (qp), el rendimiento
celular con base en el sustrato (Yx/s), la productividad celular (Prodx), la
productividad del producto (Prodp), etc.
La determinación de los parámetros cinéticos durante un CLA tiene la finalidad de
conocer, predecir y controlar la biorreacción.

Con los resultados experimentales de x, s, y p VS t obtenidos en un CLA, se

pueden obtener prácticamente todos los parámetros cinéticos. Los valores
obtenidos son lo suficientemente confiables si las determinaciones se realizan
adecuadamente durante la biorreacción.

2.0 OBJETIVO

El alumno realizará un cultivo por lote alimentado con alimentación constante

(CLA-AC) empleando una cepa de levadura Candida Utilis o Saccharomyces
cerevisiae y comparará la productividad de este sistema respecto a un cultivo por
lote.

3.0 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1 Medios de Cultivo

Los medios de cultivo a emplear en esta práctica se muestran en el cuadro 1.
Cuadro 1. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA MEDIO PARA EL MEDIO PARA LA
EL INOCULO CULTIVO POR LOTE (g/L) ALIMENTACIÓN (g/L)
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 60.0 (sF)
(NH4)2SO4 2.73 1.365 5.46
NaH2PO4 1.2637 1.2637 5.055
Extracto de levadura 0.990 0.990 3.96
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
 Nota: Emplear agua destilada para la formulación del medio para el inóculo
y agua de la llave para la formulación del medio para el CL.

X
X
ON

DN

DN0

to tt t

 S
S


to tt t

Figura 2. Variación de X, S, , ON y DN VS. t, en un CLA-AC en el que ON>DN0.

(*) Las sales se encuentran disueltas en una solución concentrada preparada

previamente. El volumen (en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente
relación:
 Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio a emplear (L)
Todos los medios se ajustan a un pH de 4.0 (excepto el medio para el inóculo).

3.2 PREPARACIÓN Y DESARROLLO DEL INÓCULO

Se preparan 100 ml de medio de cultivo para el desarrollo del inóculo (ver cuadro
1), en un matraz Erlenmeyer de 500 ml de capacidad. Se tapa con tapón de
algodón y gaza (de acuerdo a las indicaciones de trabajo microbiológico). Se
esteriliza a 121°C durante 15 min. Ya frío y estéril, se toman en condiciones
asépticas 10 ml de este medio y se adicionan en un tubo con PDA inclinado que
contiene el crecimiento de la cepa. Se resuspende el crecimiento del tubo con
agitación vigorosa y en condiciones asépticas se agrega al matraz. Se incuba en
una agitadora a 150 rpm y a una temperatura de 35 0C durante 20 horas. El
crecimiento obtenido servirá para inocular el medio de cultivo (900 ml) contenido
en el biorreactor. De esta manera la relación de inóculo es de 1/10 V/V.

3.3 PREPARACIÓN, ESTERILIZACIÓN E INOCULACIÓN DEL BIORREACTOR.

Se preparan 900 ml de medio de cultivo para el cultivo por lote (ver cuadro 1) y se
ajusta el pH a 4.0 con una solución de NH4OH, 2N. Este medio se adiciona al
biorreactor y este se esterilizará (de acuerdo a las indicaciones del profesor) en
una autoclave a 121°C durante 15 min (pueden esterilizarse de manera conjunta
los recipientes que contienen el medio de cultivo fresco a alimentar -ver sección
3.4-, el antiespumante y el álcali). Se enfría el biorreactor siguiendo las
indicaciones del profesor.

Se ajustan la agitación, la aireación y la temperatura a los valores de trabajo

establecidos. El medio en el biorreactor se inocula en condiciones asépticas con el
crecimiento obtenido en el matraz en el que se propagó el inóculo. En este
momento (tiempo cero) inicia el cultivo por lote (CL). Este cultivo operará bajo las
condiciones de operación especificadas en el cuadro 2 y durará aproximadamente
10 horas. Se tomarán muestras sólo al inicio y al final del CL.
 Cuadro 2. Condiciones de operación en el biorreactor.
velocidad de agitación 500 rpm
Aireación 1 vvm
Temperatura 30 °c
pH 4.0 (ajustar con NH4OH, 2N)

3.4 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A ALIMENTAR.

Se preparan 3000 ml de medio de cultivo para la alimentación (ver cuadro 1) y se
ajusta el pH a 4.0 con una solución de NH 4OH, 2N. Este medio se agrega a un
matraz Erlenmeyer de 5 litros de capacidad. Se le coloca una manguera de silicón
esterilizable de longitud y diámetro adecuado al cabezal de la bomba peristáltica
que se utilizará para alimentar el CLA (seguir las indicaciones del profesor), se le
coloca una pinza de laboratorio y el extremo exterior de la manguera se cubre con
algodón, gaza y aluminio (ver figura 3). Se esteriliza en una autoclave a 121°C
durante 15 min. Se enfría y queda listo para conectarse al biorreactor (siguiendo
las indicaciones del profesor) para iniciar el CLA.

Figura 3. Preparación del matraz con el medio de cultivo para la alimentación.

3.5 CALIBRACIÓN DE LA BOMBA PERISTÁLTICA DE ALIMENTACIÓN.
Previo al inicio de la alimentación, la bomba peristáltica a emplear se debe calibrar
con el cabezal adecuado al diámetro de la manguera utilizada, a un punto en el
que el flujo sea constante e igual a 300 ml/h (la calibración puede realizarse con
agua siguiendo las indicaciones del profesor).

3.6 INICIO Y DESARROLLO DEL CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO CON

FLUJO DE ALIMENTACIÓN CONSTANTE.
Aproximadamente una hora antes de finalizar el cultivo por lote, en condiciones
asépticas se conecta el extremo final de la manguera del matraz que contiene el
medio a alimentar a la bomba peristáltica y al biorreactor. Al transcurrir 10 horas
del cultivo en lote (o cuando se considere finalizado el mismo) se inicia la
alimentación al flujo ya mencionado (300 ml/h). El CLA finalizará cuando se agote
el medio de alimentación. Este cultivo operará bajo las mismas condiciones de
operación que el cultivo por lote (cuadro 2) y se tomarán muestras cada hora las
cuales serán procesadas de acuerdo a la figura 4.

MUESTRA “mma” (10 ml)

Determinación de la concentración Centrifugar y en el sobrenadante “mmac”

(5mL) (5mL)
celular mediante lectura de la determinar de la concentración de glucosa
absorbancia (ver punto 4.4.1). residual (ver punto 4.4.2.3).

Figura 4. Procesamiento de las muestras.

3.7 SEGUIMIENTO DE LA BIORREACCIÓN.

Se tomarán muestras de aproximadamente 10 ml del medio agotado cada hora (a
las que denominaremos “mma”) para determinar la concentración celular (x) y la de
glucosa residual (s). Las determinaciones se harán por duplicado. La alimentación
en el cultivo por lote alimentado durará aprox. 10 horas durante las cuales se
controlará el pH a 4.0 con una solución de NH4OH, 2N y la temperatura a 30°C.
La bitácora que se llevará durante el seguimiento de la biorreacción se muestra en
el cuadro 3.

Cuadro 3. Bitácora de la biorreacción.

Fecha Hora Edad Volumen Determinación de la Determinación de la
de total concentración celular. concentración de glucosa
cultivo alimenta residual.
(h) do* (Va = As (610 Concentra
D As (540 Concentra
D
Fa*t). nm) ción
i nm) ción
i de “s”
(l) celular
l “x” (g/l)
l
(g/l)
u u
c c
i i
ó ó
n n

Condiciones de desarrollo de la
biorreacción:
Agitación: 500 rpm
Aireación: 1 vvm
Temperatura: 30 ºC
pH : 4.0
Velocidad de flujo (cte): 0.3 l/h
*El volumen total alimentado se obtiene “graduando” el matraz de alimentación del
medio fresco (figura 3).

4.0 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Equipo
 Autoclave (15 L de capacidad)
Incubadora rotatoria de temperatura controlada
Fermentador con ambiente controlado (de 2 ó 6 litros)
Electrodo de pH esterilizable
Medidor controlador de pH
Electrodo de oxígeno disuelto
Medidor de oxígeno disuelto.
2 Bombas peristáltica (0 a 2 l/h)
2 Placas de calentamiento y agitación
Espectrofotómetro (rango: visible y UV)
Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm)
Balanza analítica (0 a 200 g de capac.)
Estufa con vacío
Equipo de filtración con vacío

4.2 Microorganismo utilizado: La cepa será Cándida Utilis o Saccharomyces

cerevisiae.

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-

dextrosa-agar) a una temperatura de 40C.

4.3 Medios de Cultivo

Los medios de cultivo a utilizar están descritos en la sección 3.1. Cuadro 1.

4.4 Métodos Analíticos

4.4.1 Determinación de la concentración celular (x)

Se sigue el mismo procedimiento reportado en la sección 4.4.1 de la Práctica 8.

4.4.2 Determinación de la concentración de glucosa residual.

Se sigue el mismo procedimiento reportado en la sección 4.4.2 de la Práctica 8.

5.0 FORMULACIÓN DE RESULTADOS

5.1 Presentar los resultados obtenidos en el Cuadro 3.

5.2 Presentar la curva tipo de glucosa.
5.3 Con los resultados del Cuadro 3, elaborar el Cuadro 4.
Cuadro 4.- Resumen de resultados del CLA-AC.
Edad Concentr Concentr Volumen Masa total Masa total Cantidad
ación ación de total (VT = celular “X” de glucosa de sustrato
celular “x” sustrato (x* VT) residual alimentado
V0 + Fa*t)
(h) residual (g) (“Sr“ = “Sal =
(g/l) “sr”
(l) sr* VT) FasFt)
(g/l)
(g) (g)

5.4 Elaborar los siguientes gráficos:

e) Volumen del medio de cultivo en el biorreactor (V) vs. Tiempo “t”.
f) Concentración celular (x) vs. Tiempo “t”.
g) Concentración de glucosa residual (sr) vs. Tiempo “t”.
h) Masa total celular (X) vs. Tiempo “t”.
i) Masa total de glucosa residual (Sr) vs. Tiempo “t”.
5.5 Determinar los siguientes conceptos:
g) Velocidad específica de crecimiento () a cada tiempo de cultivo.
Esta se obtiene al obtener la tangente de la gráfica “5.4d” (dX/dt) y dividir
este valor entre la Masa celular total (X) a cada tiempo [ = ( / )/ ].
h) Rendimiento celular con base en el sustrato consumido (Y x/s) a cada
tiempo de cultivo.
 ( )
Esta se obtiene con la siguiente ecuación: / =( ) (
. En la
)

que X2 es la masa celular total a un tiempo dado y X1 es la masa celular

total en el tiempo anterior. Se aplica en el mismo sentido para Sal y Sr. Sal
es la masa de sustrato alimentado y Sr es la masa de sustrato residual.
i) Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Y x/s (global)).
( )
Este parámetro se obtiene con la siguiente ecuación: / =( )
.

Ecuación en la que Xf es la masa celular total al final de la biorreacción y

Xi es la masa celular total con la que inicia el cultivo por lote alimentado.
Sal es la masa total de sustrato alimentado durante todo el CLA y Sr es la
masa total de sustrato residual al final de la biorreacción.
Sal = Va*sF
Va = Volumen total de sustrato alimentado [l].
sF = Concentración de sustrato en el medio de alimentación [g/l]
j) Velocidad específica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de
cultivo.
Este parámetro se obtiene al dividir la  obtenida en el punto “5.5 a” entre
el rendimiento obtenido en el punto “5.5 b”, a los mismos tiempos.
k) Productividad celular global volumétrica (Rx global).
Este parámetro se obtiene al dividir la máxima concentración celular (xmax)
obtenida en la figura “5.4 b”, entre el tiempo requerido para alcanzarla.
l) Productividad celular másica global másica (R x global).
Este parámetro se obtiene al dividir la máxima concentración celular (x max)
obtenida en la figura “5.4 d”, entre el tiempo requerido para alcanzarla.

Finalmente, el alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica y elaborará

un resumen de la misma.
6.0 BIBLIOGRAFÍA

1.- Dunn, I. J. Y J. R. Mor (1975). "Variable-volume continuous cultivation".

Biotechnol. Bioeng. 17: 1805-1822.

2.- Pirt, S. J. (1975) "Principles of microbial and cell cultivation". Black Well
Scientific Publications, London.

3.- Whitaker, A. (1980). Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.

4.- Yamané, T., y S. Hirano (1977). Semibatch culture of microorganism with

constant feed of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol.
55:156-165.