UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE

Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides,
Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU
DETERMINACIÓN COMO ACTIVIDAD AMEBICIDA,
GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Por

M.C. Mónica Celina Ramos Guerra

Tésis Doctoral
(Microbiología)

2005
CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE
Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides,
Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU
DETERMINACIÓN COMO ACTIVIDAD AMEBICIDA,
GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Comité de Tesis

Dra. Licet Villarreal Treviño (Director)

Dr. Mario Rodolfo Morales Vallarta (Secretario)

Dr. Benito David Mata Cárdenas (Vocal Director Externo)

Dra. Azucena Oranday Cárdenas (Vocal)

Dr. Javier Vargas Villarreal (Vocal)

CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE
Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides,
Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU
DETERMINACIÓN COMO ACTIVIDAD AMEBICIDA,
GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Comité Académico de Doctorado

Dra. Julia Verde Star.

Subdirector de Estudios de Postgrado.
 TABLA DE CONTENIDO

Sección Página

1. RESUMEN Y ABSTRACT………………………………………… 1

2. INTRODUCCIÓN………………………………….. 5

3. HIPOTESIS…………………………………………. 25

4. OBJETIVOS………………………………………… 26
4.1 Objetivo general
4.2 Objetivos específicos

5. ANTECEDENTES………………………………….. 28

5.1 Efecto de los extractos de plantas sobre E. histolytica 28

5.2 Efecto de los extractos de platas sobre G. lamblia 30
5.3 Efecto de los extractos de plantas sobre bacterias 31
5.4 Importancia del presente trabajo 35
5.5 Originalidad y justificación 36
5.6 Contribución y prespectivas 36

6 MATERIAL Y MÉTODOS……………………… 38

6.1 Origen de los reactivos 38

6.2 Material biológico 38
6.2.1 Cepa de HM1: IMSS de E. hitolytica 38
6.2.2 Cepa de G. lamblia IMSS 0889 39
6.3 Cepas bacterianas 39
6.4 Preparación de suero 39
6.4.1 Suero bovino estéril 39
6.5 Preparación de los medios de cultivo 40
6.5.1 Medio basal (PEHP)……………………….. 40
6.5.2 Medio basal TYI…………………………… 40
 6.5.3 Medio completo PEHPS y TYI……………. 41
6.5.4 Caldo Soya-Tripticasa……………………… 41
6.5.5 Agar Soya-Tripticasa………………………. 41
6.6 Cultivo axénicos de protozoarios……………… 42
6.6.1 Resiembra…………………………………. 42
6.7 Cinética de crecimiento……………………….. 43
6.7.1 Entamoeba histolytica…………………….. 43
6.7.2 Giardia lamblia…………………………… 43
6.8 Cultivos bacterianos…………………………… 44
6.8.1 Ajuste de los inóculos bacterianos………… 44
6.9 Colecta de las plantas…………………………. 44
6.9.1 Localización………………………………. 44
6.10 Obtención de los extractos…………………… 46
6.10.1 Extractos acuosos……………………….. 46
6.10.2 Extractos hexánios……………………… 48
6.10.3 Extractos acetónicos……………………. 48
6.10.4 Extractos metanólicos………………….. 49
6.11 Obtención de la CI50 en E. hitolytica y G. lamblia
de los extractos de cada planta y el metronidazol…… 50
6.11.1 Incorporación de los extractos de las plantas
a los medios de cultivo y la obtención de la IC50….. 50
6.12 Análisis estadístico de la CI50 usando el método Pobit…. 52
6.13 Obtención de la CMB de los extractos de las plantas
sobre las bacterias………………………………………. 52
6.13.1 Técnicas de dilución en tubo usando los extractos
de las plantas sobre el crecimiento de las bacterias… 53
6.14 Identificación de los metabolitos secundarios de los
Extractos de las plantas por métodos químicos…………. 53
6.14.1 Prueba de Liebermann-Burchard……………………. 53
6.14.2 Prueba de Salkowski…………………………………. 54
6.14.3 Prueba del ácido sulfúrico…………………………… 54
6.14.4 Prueba de Baljet…………………………………….. 54
6.14.5 Prueba de Dragendorff……………………………… 55
6.14.6 Prueba de permanganato de potasio………………… 55
6.14.7 Prueba de cloruro férrico……………………………. 55
6.14.8 Prueba de Molisch…………………………………... 56
6.14.9 Prueba de bicarbonato de sodio……………………... 56
6.15 Cromatografía en placa fina de los extractos……………. 57
6.16 Aislamiento de las fracciones…………………………… 58
6.17 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia 59
6.18 Determinación de los grupos funcionales de las
fracciones aisladas……………………………………… 59

7. RESULTADOS…………………………………………….. 60

7.1 Relación temporal del crecimiento de las cepas………….. 60

7.1.1 Entamoeba histolytica ……………………………….. 60
 7.1.2 Giardia lamblia……………………………………….. 61
7.2 Determinación del efecto del metronidazol sobre
el crecimiento de E. histolytica y G. lamblia……………. 63
7.3 Determinación de la CI50 de los extractos de las
Plantas sobre E. histolytica y G. lamblia………………… 65
7.3.1 E. histolyitica………………………………………… 65
7.3.2 G. lamblia……………………………………………. 67
7.4 Determinación de la CMB de los extractos sobre E. coli,
S. aureus, S. cholerasuis y S. flexnieri…………………... 68

7.5 Determinación de los metabolitos secundarios presentes

en los extractos de cada planta……………………………. 69
7.6 Separación en fracciones del extracto de M. vulgare usando
cromatografía en placa fina……………………………….. 72
7.7 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia… 73
7.8 Determinación de los grupos funcionales en las bandas….. 73

8. DISCUSIÓN………………………………………………….. 74

9. CONCLUSIONES.……………………………….…………. 86

10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………… 89
CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE
Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides,
Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU
DETERMINACIÓN COMO ACTIVIDAD AMEBICIDA,
GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Comité de Tesis

Dra. Licet Villarreal Treviño (Director)

Dr. Mario Rodolfo Morales Vallarta (Secretario)

Dr. Benito David Mata Cárdenas (Vocal Director Externo)

Dra. Azucena Oranday Cárdenas (Vocal)

Dr. Javier Vargas Villarreal (Vocal)

i
CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE
Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides,
Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU
DETERMINACIÓN COMO ACTIVIDAD AMEBICIDA,
GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Comité Académico de Doctorado

Dra. Julia Verde Star.

Subdirector de Estudios de Postgrado.

ii
 A DIOS:

Que ha sido mi Fortaleza

y por permitirme seguir con vida

A mi Niña:

Victoria Ramos Guerra

Con todo mi AMOR…
Por tener la paciencia y cederme tu
tiempo para la realización de este trabajo

A mis Padres:

Ing. Juan José de Jesús Ramos Cantú

Gloria Dalia Guerra Cavazos
Con Cariño y Respeto

A mi Hermana:

Q.B.P. Viviam Soraya O. Hernández Díaz

Va por las dos!!!

A mi Amigo:

Biól. Luis Antonio Segura Tovar

Por estos veinte años de Amistad
GRACIAS!!!

iii
 AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Licet Villarreal Treviño por sus consejos, asesoría y ayuda en la realización
de la presente tesis en el área microbiológica y por la revisión y redacción de
ésta….GRACIAS.

Al Dr. Benito David Mata Cárdenas por brindarme la oportunidad de llevar a cabo la
presente tesis, por sus consejos, ayuda, asesoría y amistad. Por la dirección de la
parte experimental de protozoología.

Mi más sincero agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACYT) por la Beca No. 170465 otorgada para la realización de la presente
tesis.

Agradezco también al Programa de Apoyo a la Investigación Científica y

Tecnológica (PAICYT-UANL) por el apoyo CN 703-02 para la realización del
presente trabajo.

Al Dr. Javier Vargas Villarreal por su invaluable ayuda en la redacción de esta tesis,
por su orientación, sus atinados consejos y observaciones, y por brindarme su
amistad.

A la Dra. Azucena Oranday Cárdenas, por sus consejos y ayuda para la realización
de la parte experimental de Química Orgánica.

Al Dr. Mario Rodolfo Morales Vallarta por sus consejos y aceptar ser parte de mi
Comité de Tesis.

Al Dr. Fernando Jiménez Guzmán por permitirme realizar mis estudios de posgrado.

iv
Al Dr. Salvador Said Fernández de mi Comité Tutorial. Por sus atinadas
observaciones, orientación y por estar al pendiente que no faltara material para
trabajar; mi mas sincero agradecimiento.

Al Dr. Carlos Hernández Luna de mi Comité Tutorial por sus consejos y amistad.

Al Dr. José Antonio Heredia Rojas de mi Comité Tutorial por sus consejos, ayuda,
orientación, entusiasmo y amistad de tiempo atrás. Por estar siempre al pendiente de
la realización de la presente.

A la M en C. María del Consuelo Gonzáles De la Rosa y al Biól. Marco Antonio

Guzmán Lucio por su ayuda en la identificación de las plantas estudiadas en la
presente investigación.

Al Q.B.P. Juan José Gutiérrez García por su ayuda y mostrarme esos trucos “mitos y
realidades” que solo se adquieren con la experiencia para la realización de las
cromatografías.

A la M. en C. María Guadalupe DeWitt Sepúlveda por su amistad, apoyo y por

facilitarme literatura correspondiente a plantas medicinales.

A mis compañeros del Centro de Investigación Biomédica del Noreste, IMSS:

Manuel Gutiérrez Rueda, M en C Rebeca Palacios, Q.F.B. Leticia Navarro
Marmolejo, M.V.Z. Héctor Gerardo Lozano Garza y Dr. Francisco González Salazar
por su amistad.

Al Sr. Abel Navarro por todas las facilidades otorgadas en la recuperación de

referencias bibliográficas.

A la Dra. Gloria María Molina Salinas por su apoyo y amistad.

Al Dr. Baldemar Escobar González, “El Vaquero”, por su desinteresada amistad, por
su apoyo moral y por su ayuda incondicional.

v
A mis compañeras del Laboratorio de Parasitología: Q.B.P. Ma. Margrita González
Rivera, a mi amigocha T.L.C. Maria Elena “Nené” García De la Rosa, a Doña Leo y
Doña Marina por su apoyo, consejos y amistad.

Al Biól. Luis Antonio Segura Tovar por su apoyo y tolerancia en mis momentos
críticos durante la realización de la presente tesis.

A todas aquellas personas que no menciono pero que de alguna manera ayudaron a la
realización de esta tesis….GRACIAS!!!

vi
 El desarrollo experimental de la presente tesis se llevó a cabo
en el Laboratorio de Microbiología General y en el Laboratorio
de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Biológicas de
la Universidad Autónoma de Nuevo León, así como en el
Laboratorio de Biología Celular y Bioquímica del Centro de
Investigación Biomédica del Noreste del Instituto Mexicano del
Seguro Social.

vii
 TABLA DE CONTENIDO

Sección Página

1. RESUMEN Y ABSTRACT………………………………………… 1

2. INTRODUCCIÓN………………………………….. 3

3. HIPOTESIS…………………………………………. 21

4. OBJETIVOS………………………………………… 22
4.1 Objetivo general
4.2 Objetivos específicos

5. ANTECEDENTES………………………………….. 24
5.1 Efecto de los extractos de plantas sobre E. histolytica 24
5.2 Efecto de los extractos de platas sobre G. lamblia 26
5.3 Efecto de los extractos de plantas sobre bacterias 27
5.4 Importancia del presente trabajo 29
5.5 Originalidad y justificación 30
5.6 Contribución y prespectivas 30

6 MATERIAL Y MÉTODOS……………………… 32

6.1 Origen de los reactivos 32

6.2 Material biológico 32
6.2.1 Cepa de HM1: IMSS de E. hitolytica 32
6.2.2 Cepa de G. lamblia IMSS 0889 33
6.3 Cepas bacterianas 33
6.4 Preparación de suero 33
6.4.1 Suero bovino estéril 33
6.5 Preparación de los medios de cultivo 34
6.5.1 Medio basal (PEHP)……………………….. 34
6.5.2 Medio basal TYI…………………………… 34
6.5.3 Medio completo PEHPS y TYI……………. 34
6.5.4 Caldo Soya-Tripticasa……………………… 35
6.5.5 Agar Soya-Tripticasa………………………. 35
6.6 Cultivo axénicos de protozoarios……………… 36
6.6.1 Resiembra…………………………………. 36
6.7 Cinética de crecimiento……………………….. 36
6.7.1 Entamoeba histolytica…………………….. 36
6.7.2 Giardia lamblia…………………………… 37
6.8 Cultivos bacterianos…………………………… 37
6.8.1 Ajuste de los inóculos bacterianos………… 37

viii
 6.9 Colecta de las plantas…………………………. 38
6.9.1 Localización………………………………. 38
6.10 Obtención de los extractos…………………… 40
6.10.1 Extractos acuosos……………………….. 40
6.10.2 Extractos hexánios……………………… 41
6.10.3 Extractos acetónicos……………………. 42
6.10.4 Extractos metanólicos………………….. 42
6.11 Obtención de la CI50 en E. hitolytica y G. lamblia
de los extractos de cada planta y el metronidazol…… 44
6.11.1 Incorporación de los extractos de las plantas
a los medios de cultivo y la obtención de la IC50….. 44
6.12 Análisis estadístico de la CI50 usando el método Pobit…. 45
6.13 Obtención de la CMB de los extractos de las plantas
sobre las bacterias………………………………………. 45
6.13.1 Técnicas de dilución en tubo usando los extractos
de las plantas sobre el crecimiento de las bacterias… 46
6.14 Identificación de los metabolitos secundarios de los
Extractos de las plantas por métodos químicos…………. 46
6.14.1 Prueba de Liebermann-Burchard……………………. 46
6.14.2 Prueba de Salkowski…………………………………. 47
6.14.3 Prueba del ácido sulfúrico…………………………… 47
6.14.4 Prueba de Baljet…………………………………….. 47
6.14.5 Prueba de Dragendorff……………………………… 47
6.14.6 Prueba de permanganato de potasio………………… 48
6.14.7 Prueba de cloruro férrico……………………………. 48
6.14.8 Prueba de Molisch…………………………………... 48
6.14.9 Prueba de bicarbonato de sodio……………………... 49
6.15 Cromatografía en placa fina de los extractos……………. 49
6.16 Aislamiento de las fracciones…………………………… 50
6.17 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia 51
6.18 Determinación de los grupos funcionales de las
fracciones aisladas……………………………………… 51

7. RESULTADOS…………………………………………….. 52

7.1 Relación temporal del crecimiento de las cepas………….. 52

7.1.1 Entamoeba histolytica ……………………………….. 52
7.1.2 Giardia lamblia……………………………………….. 54
7.2 Determinación del efecto del metronidazol sobre
el crecimiento de E. histolytica y G. lamblia……………. 55
7.3 Determinación de la CI50 de los extractos de las
Plantas sobre E. histolytica y G. lamblia………………… 56
7.3.1 E. histolyitica………………………………………… 56
7.3.2 G. lamblia……………………………………………. 58
7.4 Determinación de la CMB de los extractos sobre E. coli,
S. aureus, S. cholerasuis y S. flexnieri…………………... 59

7.5 Determinación de los metabolitos secundarios presentes

en los extractos de cada planta……………………………. 60
7.6 Separación en fracciones del extracto de M. vulgare usando

ix
 cromatografía en placa fina……………………………….. 63
7.7 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia… 64
7.8 Determinación de los grupos funcionales en las bandas….. 64

8. DISCUSIÓN………………………………………………….. 65

9. CONCLUSIONES.……………………………….…………. 74

10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………… 76

x
 LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1. CI50 de los extractos de las plantas contra E. histolytica……………….. 57

2. CI50 de los extractos de las plantas contra G. lamblia………………… 58

3. CI50 de los extractos de las plantas contra ambos protozoarios………… .59

4. CMB de los extractos hexánicos, acetónicos y metanólicos

de todas las plantas contra E. coli O157:H7, S. aureus.
S. cholerasuis y S. flexnieri…………………………………………… 60

5. CMB de los extractos acuosos de todas las plantas contra

E. coli O157:H7, S. aureus. S. cholerasuis y S. flexnieri ……………. 60

6. Metabolitos secundarios presentes en los extractos…………………… 62

7. Efecto de los compuestos aislados sobre el crecimiento de

E. histolytica y G. lamblia……………………………………………… 64

xi
 LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1. Trofozoíto y quiste de Entamoeba histolytica……… 5

2. Trofozoíto y quiste de G. lamblia…………………. 7

3. Artemisia ludoviciana……………………………... 11

4. Chenopodium ambrosioides……………………….. 13

5. Flourensia cernua…………………………………… 15

6. Marrubium vulgare………………………………….. 16

7. Mentha spicata………………………………………. 18

8. Mapa del estado de Galeana, N.L:…………………… 39

9. Filtración del extracto acuoso……………………. 40

10. Liofilización del extracto acuoso…………………… 41

11. Obtención de los extractos con solventes………….. 43

12. Extractos en el sheker en agitación constante………. 43

13. Placa de porcelana con pruebas coloridas………….. 49

14. Corrimiento de las muestras en cromatoplacas

de sílica gel………………………………………….. 50

15. Cinética de crecimiento de E. histolytica…………… 53

16. Cinética de crecimiento de G. lamblia……………… 54

17. Relación entre la cantidad de metronidazol

sobre el crecimiento de E. histolytica……………… 55

18. Relación entre la cantidad de metronidazol

sobre el crecimiento de G. lamblia………………… 56
19. Cromatografía en placa fina del extracto de
Marrubium vulgare…………………………………. 63

xii
 NOMENCLATURA

ATCC American type Culture Collection

ºC Grados Celsius
CIVIN Centro de Investigación Biomédica del Noreste
CI50 Concentración Inhibitoria Media
cm Centímetros
CMB Concentración Mínima Bactericida
cols. Colaboradores
Depto. Departamento
EU Estados Unidos de América
FDA Food Drug Administation
g Gramo
h Horas
IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social
L Litro
m Metro
mg Miligramo
mL Mililitro
g Microgramos
L Microlitros
N Concentración normal
N. L. Nuevo León
Rf Factor de retardo (cociente de frentes)
SS Secretaría de Salud
TLC Thin Layer Chromatography
UANL Universidad Autónoma de Nuevo León
UV Ultravioleta
WHO World Health Organization
 Longitud de onda
 LJ Beta

xiii
+ Positivo
- Negativo
% Porcentaje

xiv
 1. RESUMEN

En la actualidad el uso indiscriminado de medicamentos y la aparición de cepas

con drogo-resistencia, han traído como consecuencia el resurgimiento de
enfermedades ancestrales como tuberculosis, ántrax, amibiasis, giardiasis y
enfermedades bacterianas que producen diarrea. Por ello, es imperante el buscar y
desarrollar otras vías para descubrir nuevos medicamentos. Una alternativa viable
son las plantas medicinales, consideradas como una importante fuente para el
desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. En México, se cuenta con una gran
diversidad botánica, y solo un bajo porcentaje ha sido estudiado científicamente. En
este trabajo nos propusimos explorar la actividad citotóxica in vitro contra
Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Escherichia coli O157:H7, Salmonella
choleraesuis, Shigella flexnieri y Staphylococcus aureus de los extractos acuosos,
hexánicos, acetónicos, y metanólicos de la parte aérea de las plantas Artemisia
ludoviciana, Chenopodium ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua y
Mentha spicata. Para determinar la actividad citotóxica de los extractos adaptamos el
modelo para obtener la CI50 in vitro para los protozoarios y la CMB para las bacterias
y recurrimos al método estadístico de Probit para este propósito. Se realizaron curvas
de crecimiento para E. histolytica donde el tiempo de duplicación fue de 33.76 h y
para G. lamblia de 10.36 h, con un inóculo de 5,000 amibas/mL y 10,000
giardias/mL y por regresión lineal definimos 3 días de incubación como máximo
para ambos protozoarios. Para el modelo de la CI50 se probó el efecto del
metronidazol en ambos parásitos. Usando Probit determinamos una CI50 para E.
histolytica de 0.124 µg/mL y para G. lamblia de 0.205 µg/mL. Por otro lado,
utilizamos el modelo de la CMB para las bacterias ya mencionadas utilizando las
técnicas de dilución en tubo y la difusión en agar. La técnica más eficaz para esta
investigación fue la dilución en tubo usando el cloranfenicol como testigo
[Link] vez probados los modelos de CI50 y CMB, analizamos la actividad
antiprotozoaria y bactericida de todos los extractos de las plantas. Obtuvimos los
extractos y usamos el poder de disolución máxima para ajustar las concentraciones.
Se observó que las CI50 en los extractos acuosos no bajaron de 100 µg/mL para
ambos protozoarios. Encontramos que la CI50 bajaron considerablemente cuando
usamos los extractos polares y medianamente polares, siendo los más bajos, el
acetónico del marrubio con 7 µg/mL para E. histolytica y el metanólico de
yerbabuena con 8 µg/mL para G. lamblia. Además encontramos que los extractos
metanólico del marrubio y el acetónico de hierbabuena fueron muy similares con una
CI50 de 12 y 13 µg/mL y el hexánico y acetónico del epazote con 57 y 58 µg/mL
respectivamente. Se probó la efectividad citotóxica de los extractos de cada planta
sobre las bacterias encontrando que solo el extracto acuosos de las plantas
Marrubium vulgare y Mentha spicata tuvieron un efecto sobre S. aureus a
concentraciones de 5 y 5.5 mg/mL. También se definió conocer los metabolitos
secundarios de los extracto de cada una de las plantas, detectando
sesquiterpenlactonas, dobles enlaces, oxidrilos fenólicos, azúcares, lactonas,
alcaloides, saponinas, triterpenos y compuestos esteroidales. Así mismo separamos
por cromatografía en placa fina el extracto metanólico de M. vulgare siendo el de
menor CI50 para ambos protozoarios. Determinamos el Rf de 5 manchas: 0.94, 0.90,
0.84, 0.25 y 0.17 La fracción con mayor % de inhibición (41%) fue para E.
histolytica con la fracción de 0.25 y para G. lamblia la fracción con Rf de 0.90 con
un 40%, las cuales pertenecen a las sesquiterpenlactonas.

1
 ABSTRACT

At the present time the indiscriminate medicine use and the appearance of stocks
with drug-resistance, have brought like consequence the resurgence of ancestral
diseases as: tuberculosis, anthrax, amibiasis, giardiasis and diseases bacterial that
produce diarrhea. For that reason, this is prevailing looking for and to develop other
routes to discover new medicines, a viable alternative are the medicinal plants,
considered like an important source for the development of new quimiotherapeutic
agents. Mexico, it is counted on a great botanical diversity, and a low percentage has
been studied scientifically. In this work we steed out to explore the cytotoxic activity
in vitro against Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Escherichia coli, Salmonella
choleraesuis, Shigella flexnieri and Staphylococcus aureus of the aqueous, hexanic,
acetonic extracts, and methanolic of the aerial part of the plants Artemisia
ludoviciana, Chenopodium ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua
and Mentha spicata. In order to determine the cytotoxic activity of the extracts we
adapted the model to obtain the CI50 in vitro for the protozoa and the CMB for the
bacteria and resorted to the statistical method of Probit for this intention. Growth
curves were made, for Entamoeba histolytica where the time of duplication were of
the 33.76 h and for 10.36 h in G. lamblia, with 5,000 amoebas/mL and 10,000
giardias/mL respectively. For the linear regression we defined 3 days of incubation
for both protozoa. For the model of the CI50 the effect of metronidazole in both
parasites was proven. Using Probit we determined a CI50 for Entamoeba histolytica
of 0.124 µg/mL and G. lamblia of 0.205 µg/mL. On the other hand, we used the
model of the CMB for the bacteria: already mentioned using the techniques of
dilution in tube and the diffusion with sensidisc. The most effective technique for
this thesis was the dilution in tube using cloramphenicol like positive control. We
obtained the extracts and the power of maximum dissolution to fit the concentrations.
It was observed that the CI50 in the aqueous extracts did not lower less than 100
µg/mL for both protozoa. We found that the CI50 lowered considerably when we
used the moderately polar extracts, polestars and, being lowest: the acetonic of
marrubio with 7 µg/mL for Entamoeba histolytica and the methanolic of hierbabuena
with 8 µg/mL for G. lamblia. In addition we found that the extracts methanolic
(marrubio) and acetonic (hierbabuena) were very similar with a CI50 of 13 and 12
and µg/mL and the hexanic and acetonic of epazote with 57 and 58 µg/mL
respectively. The cytotoxic effectiveness of the extracts of each plant was proven on
the aqueous bacteria finding that single the extract of the plants Marrubium vulgare
and Mentha spicata had an effect on S. aureus a concentrations of 5 and 5.5 mg/mL.
Also we detecting in the extract of each plant: Sesquiterpenlacton, phenolic, oxidril,
sugars, lactonas, alkaloids, saponin, triterpens and steroidal compounds. As objective
following we separated by thin layer chromatography the methanolic extract of M.
vulgare (it gave lower CI50 for both protozoa). We determined the Rf of 5 spots
(0,94, 0,90, 0,84, 0,25 and 0,17) the greater fraction with % of inhibition (41%) was
for Entamoeba histolytica with the fraction of 0,25 and for G. lamblia the fraction
with RF of 0,90 with a 40% which belongs to sesquiterpenlacton.

2
 2. INTRODUCCIÓN

Desde tiempos inmemorables (50,000 años a.c.) hasta la fecha, se han

encontrado documentos en todas las culturas: Los Vedas, Mesopotamia, Asirios,
hasta la actualidad, con publicaciones científicas, donde han usado a las plantas
medicinales para obtener remedios o medicamentos que han curado sus
enfermedades (Yesilada, 2005). Durante las últimas décadas, el uso de las plantas
medicinales ha ganado popularidad mundial y la mayoría de los países desarrollados
usan la medicina tradicional. En Europa los países como Bulgaria, Alemania y
Polonia son grandes exportadores de fitofármacos (Hoareau y DaSilva, 1999), ya que
usan como productos medicinales más de 1,500 especies de plantas pertenecientes a
200 familias y 800 géneros. Además varias naciones incluyendo a China, Nigeria,
Tailandia y México, han decidido integrar las investigaciones etnobotánicas en sus
sistemas básicos de salud y cada vez más países desarrollados están adoptando este
sistema (Hoareau y DaSilva, 1999).

El desarrollo y la comercialización de fitofármacos se basan en la

disponibilidad, facilidades e información concerniente a los procesos de extracción,
purificación, producción industrial y comercialización de productos extraídos de
plantas o desarrollados a partir de éstos (Hoareau y DaSilva, 1999). Las plantas
medicinales son un componente integral de desarrollo de investigación y constituyen
una alternativa importante para la obtención de nuevas e importantes drogas o
compuestos semisintéticos, que han servido para curar enfermedades a menor costo
(Balick y Cox, 1995).

En años recientes, la población mundial ha aumentado su interés en usar drogas

naturales y terapias alternativas obtenidas de las plantas como infusiones herbales,
extractos etanólicos, metanólicos, clorofórmicos, tinturas, suplementos alimenticios,
fitofarmacéuticos y productos farmacéuticos (American Medical Association, 1997).

3
Esta inclinación es debido a 1) que la mayoría de los microorganismos se han hecho
drogo-resistentes y la medicina convencional cada vez es más ineficiente, 2) el uso
indiscriminado e incorrecto de drogas han dado como resultado efectos colaterales a
los usuarios (intolerancia, mutagénesis, enfermedades antiinmunes) y 3) no siempre
se tiene acceso a tratamientos convencionales farmacológicos por su elevado costo o
disponibilidad (Rates, 2000).

Además se ha observado en forma muy evidente el resurgimiento de

enfermedades ancestrales como la tuberculosis, el ántrax, la amibiasis, la giardiasis y
las enfermedades diarréicas (Epidemiología, SS, 2005); ya que las drogas son menos
eficaces por la aparición de cepas drogo-resistentes. Por ello, es imperante el
desarrollar y/o buscar nuevos medicamentos que puedan ayudar a controlar a estos
microorganismos y las fuentes pueden ser a) la modificación química de los
compuestos que componen a los fármacos ya existentes, para hacerlos más efectivos
y/o menos tóxicos para el hospedero (Gubarev et al., 1998; Fabricant y Farnsworth,
2001), b) desarrollar nuevos medicamentos que estimulen los mecanismos de defensa
innatos de los hospederos (Gubarev et al., 1998; Fabricant y Farnsworth, 2001) y c)
buscar e identificar en la medicina tradicional fuentes naturales que contengan
compuestos para formar nuevos fármacos para que sean más selectivos, sin
resistencia o con mayor potencia (Gubarev et al. 1998; Fabricant y Farnsworth,
2001). Nuestro grupo de trabajo está interesado en analizar esta última fuente, sobre
microorganismos que producen diarrea como Entamoeba histolytica, Giardia
lamblia, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis y
Shigella flexnieri.

4
2.1 Características de Entamoeba histolytica.

2.1.1 Clasificación taxonómica (Carliss et al., 1969) (Levine et al., 1980).

Entamoeba histolytica
cyst

(by P.W. Pappas and S.M. Wardrop)

Figura 1. Trofozoítos de E. histolytica. Quiste de E. histolytica.

Reino: Protista
Subreino: Protozoo
Phylum: Sarcomastigophora
Subphylum: Sarcodina
Superclase: Rhizopoda
Clase: Lobosea
Subclase: Gymnamoebida
Orden: Amoebida
Suborden: Acantophodina
Familia: Endamoebidae
Género: Entamoeba
Especie: histolytica

La amibiasis es una infección parasitaria ocasionada por E. histolytica; se

distribuye universalmente y es considerada como una infección endémica con una
incidencia mundial del 12 % (Petri et al., 2000). En México constituye un problema
muy importante de salud pública por su frecuencia y mortalidad (Gutiérrez y Muñoz,
1994). El sistema nacional de vigilancia epidemiológica reportó 207,039 casos de
amibiasis durante el 2004 (Epidemiología SS, 2005).

5
 Entamoeba histolytica presenta dos fases principales en su ciclo de vida: el
quiste y el trofozoíto. El quiste es la forma infectiva de esta enfermedad, son
cuadrinucleados y rodeados por una pared celular (que los protege de medios
desfavorables). Cuando los quistes son ingeridos por el hospedero, en su intestino
grueso se liberan los trofozoítos (forma móvil, no infectiva) y son los responsable de
producir la enfermedad (Dobell, 1982). Las personas se infectan por consumir
alimentos, agua o fomites contaminados con quistes. La sintomatología se presenta a
partir de la primera a la cuarta semana con pérdida de peso, dolor abdominal,
disentería, heces sanguinolentas y fiebre. Si no hay una atención médica los
trofozoítos pueden invadir además del intestino grueso, otros órganos como el
hígado, cerebro, pulmones y si no hay una atención adecuada puede causar la muerte
del hospedero (Guerrant, 1986,; FDA, 1999).

Para el tratamiento de la amibiasis se tienen diferentes drogas, 1) las que actúan

extra-intestinalmente como cloruro de emetina, la dehidroemetina y el fosfato de
cloroquina; 2) las que actúan exclusivamente en la luz del intestino (intra-
intestinales), como las quinolinas y 3) las que actúan en ambas extra e intra-
intestinales como el metronidazol y sus derivados (Goth 1975).

6
2.2. Características de Giardia lamblia.

2.2.1 Clasificación taxonómica (Levine et al.,1980):

Figura 2. Trofozoítos de G. lamblia Quiste de G. lamblia

Reino: Protista
Subreino: Protozoo
Phylum: Sarcomastigophora
Subphylum: Mastogophorea
Clase: zoomastogophorea
Orden: Diplomonadida
Suborden: Diplomonadina
Familia: Hexamitidae
Género: Giardia
Especie: lamblia

La giardiasis es una infección parasitaria ocasionada por el género Giardia,

siendo la especie más importante G. lamblia. Este género se distribuye
universalmente e infecta intestinalmente a una variedad de mamíferos (aves, reptiles,
anfibios, peces óseos y al hombre). Este parásito es considerado entre los
protozoarios con mayor incidencia intestinal (Kulda, 1978). La giardiasis es una
infección que es adquirida por la ingestión de quistes (en alimentos o agua
contaminados). Los trofozoítos (flagelados bi-nucleados) son eclosionados de los
quistes en el intestino delgado (Dancinger, 1975). La frecuencia en México de esta
enfermedad en el 2004 fue de 9,242 casos de giardiasis (Epidemiología SS, 2005).

7
 Esta enfermedad puede ser sintomática o asintomática y esto depende de la
resistencia del hospedero, el cual puede excretar quistes por meses o años
(Dancinger, 1975). La sintomatología de la enfermedad aparece de 1 a 2 semanas de
la infección y los síntomas son: pérdida de peso, deshidratación, diarrea
(deposiciones sueltas o acuosas), calambres y trastorno estomacal ([Link]).

2.3. Características generales de las bacterias.

Las bacterias que utilizamos para la realización de esta tesis son: Escherichia
coli O157:H7 Obtenida del Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica
(INDRE) México D.F., Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella
choleraesuis ATCC 6962, y Shigella flexnieri ATCC 25931.

En la familia de las enterobacteriaceae principalmente están involucrados los

géneros que ocasionan trastornos al intestino, como Salmonella sp. Shigella sp. y
Escherichia coli. Estos son bacilos Gram-negativos, se encuentran habitualmente en
el intestino humano y algunos animales de granja, son aerobios facultativas,
fermentan diferentes carbohidratos y poseen una estructura antigénica compleja,
además pueden producir una variedad de diversas toxinas y principalmente otros
factores de virulencia como hemolisinas, citolisinas y factores moduladores de la
respuesta inmunológica (Jawetz, 1996).

2.3.1 Escherichia coli O157:H7

Es un bacilo gram-negativo y las cepas patógenas producen una poderosa

endotoxina llamada shigatoxina, su infección produce diarrea sanguinolenta y
ocasionalmente falla renal y es transmitida generalmente por alimentos (carne, pollo,
cerdo, leche) o mala higiene de personas contaminadas. Generalmente la enfermedad
desaparece entre los 5 a 10 días, donde se puede o no producir fiebre. En niños
menores de 5 años y en ancianos puede producir el síndrome urémico hemolítico,

8
donde hay una insuficiencia renal ([Link] ). Existen cuatro grupos
enterovirulentos que son: E. coli enterotoxigénica, E. coli enteropatogénica, E. coli
enterohemorrágica y E. coli enteroinvasiva. Estas bacterias son lisina (+), citrato (-),
indol (+), acetato (+) y lactosa (+) (Attisha y Clark 1995).

2.3.2 Staphylococcus spp.

Son bacterias esféricas gram-positivas con estructura de racimo de uvas y son

otra especie de bacterias importantes que producen diarrea por la ingestión de sus
toxinas en los alimentos contaminados (Jawetz et al., 1996). Produce una
enterotoxina termoestable llamada estafilocócica, que al ser ingerida causa calambres
y vómitos severos, deshidratación y si no se atiende con rapidez y eficacia puede
producir la muerte (Attisha y Clark 1995). Clínicamente, la especie más importante
de este género es S. aureus y éste se puede distinguir por ser positivo a la coagulasa;
fermenta la glucosa con producción de gas, catalasa (+) y nitrato (+).

2.3.3 Salmonella spp.:

Produce diarrea, fiebre y calambres abdominales entre las 12 y 72 h, la mayoría

de los pacientes se recuperan sin tratamiento, aunque a muchos pacientes hay que
hospitalizarlos y proporcionarles antibióticos ya que esta bacteria puede difundir de
los intestinos hacia el sistema circulatorio y alcanzar un estado de septicemia y tener
al hospedero en riesgo de muerte. Salmonella se trasmite por contaminación de
alimentos (carne, pollo, leche, huevos y vegetales), con heces fecales de personas o
animales infectados ([Link]). Esta enfermedad presenta una incidencia de
morbilidad de 55,811 casos infectadas por año en México (Epidemiología, SS, 2001).
En la actualidad se conocen 2,200 especies de Salmonella sp. y se han clasificado de
acuerdo a sus antígenos de superficie. Estas bacterias son lisina (+), sulfuro de
hidrógeno (+), reacción TSI (+/-) con gas, indol (+), citrato (+) y malonato (–)
(Attisha y Clark 1995). Salmonella choleraesuis es un patógeno hospedero-adaptado

9
del cerdo, produciéndole paratifoidea. También puede ser patógeno para los
humanos, pudiendo producir septicemia en su tracto intestinal (Chen-Hsun et al.,
2004).

2.3.4 Shigella spp.

La sintomatología se produce entre las 24 a 48 h, después de la ingestión de las

bacterias y generalmente produce diarrea. Algunas personas pueden ser
asintomáticas pero portadoras de la enfermedad. Shigella presenta varias clases:
Shigella flexnieri, (Shigella del “Grupo D”), Shigella flexnieri (Shigella del “Grupo
B”), Shigella dysenteriae (del tipo 1 ocasiona epidemias), S. flexnieri (produce
dolores en articulaciones, irritación de ojos, dolores al orinar –se le llama síndrome
de Reiter-) ([Link] Shigella está relacionada con el género de
Escherichia y es considerada por algunos autores como otra cepa de E. coli. Sin
embargo, Shigella es anaerogénica (no produce gas a partir de carbohidratos) y es
lactosa (-). Este tipo de bacterias se trasmite por heces fecales en alimentos,
legumbres y fomites. (Attisha y Clark 1995).

10
2.5 Descripción de las plantas

2.5.1 Artemisia ludoviciana Nutt. Istafiate / Estafiate.

Artemisia ludoviciana Nutt. Istafiate, Estafiate

Figura 3. Artemisia ludoviciana

Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisión: Spermatophyta
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Género: Artemisia L - sagebrush
Especie: ludoviciana Nutt – White sagebrush
Sinónimos: Artemisia ludoviciana mexicana ((Willd. Ex Spreng) Keck
Nombres comunes: Estafiate, istafiate o ajenjo ([Link]
No. de baucher: 024024.

11
 De la familia Asteraceae (Britton y Brown, 1970). Esta planta es de crecimiento
perenne llegan a medir hasta 1 metro de altura, tallos pilosos con hojas muy
aromáticas, tomentosas, bipinnadas y tripinnadas, las flores son hermafroditas de 3-4
mm de diámetro con brácteas de color verde grisáceo y numerosos flósculos
amarillos diminutos, aparecen desde finales de verano hasta finales de otoño. Los
usos medicinales que se le atribuyen son vermífugo, emenagogo y estimulante
(Stuart, 1981, Simon et al., 1984, Martínez y Martínez, 1990; Bown, 1996; Martínez,
1996); sus hojas masticadas reducen el dolor de garganta (Moerman, 1998). En
México el uso popular, es para el dolor de estómago, diarrea, parasitismo,
infecciones intestinales, afecciones bronqueales, anginas, bronquitis, resfriado, tos,
(Navarro, et al., 1996). Se han identificado como principios activos: guaianolido
crisartemina A, eudoesmanólidos, ludalbina, alfa-epoxyludalbina, arglanina,
douglanina, armexina, borneol terpenos, anfor, limoneno, alfa y beta-pelandreno y
armefolina sesquiterpenos, 8-alfa-acetoxyarmefolin y armexifolin, sesquiterpen
lactona estafiatina, artemisia-ketona, tulipinolido, y el germacranolido artemorin
([Link] En general las hojas, tallos y raíces contienen aceite y
santonina, materia nitrogenada, substancias resinosas, clorofila, albúmina, almidón,
celulosa, taninos y sales. ([Link]

12
2.5.2 Chenopodium ambrosioides L. Epazote / Pazote.

Chenopodium ambrosioides L. Epazote, Pazote

Figura 4. Chenopodium ambrosioides.

Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisión: Spermatophyta
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Caryophyllidae
Orden: Caryophyliales
Familia: Chenopodiaceae
Género: Chenopodium L
Especie: ambrosioides L – Mexican tea, wormseed
Nombres comunes: Epazote, pazote, paico, hierba de los jesuitas apazote, pazote.
Sinónimos: Teloxys ambrosioides (L.) W. A. Weber) ([Link]

No. de baucher: 024023.

Planta herbácea perenne, muy aromática, de tallo erguido de hasta 1 metro de

altura, glabro, con surcos longitudinales poco profundo, anguloso, ramoso, verde con

13
líneas blanquecinas o rosáceas. Hojas ascendentes, atenuadas en pecíolo corto,
oblongo-lanceoladas, mas o menos agudas, irregularmente sinuoso-dentadas o casi
enteras, delgadas, glabras, a veces tenuamente pubecentes, glandulosas en la cara
inferior, las hojas superiores son lanceolo-lineares, mas agudas y enteras y de color
muy intenso. Flores aglomeradas, pequeñas de 1 mm de diámetro o un poco mayor,
reunidas en racimos foliosos, espiciformes, glabros, hermafroditas por lo regular.
Fruto ovoide, de menos de 1 mm, comprimido, perfectamente envuelto por el cáliz,
semillas lisas, color negro brillante, lustrosa, lenticular, horizontal o más o menos
vertical. Las hojas tienen sabor aromático. La floración se presenta en otoño. Las
hojas tiernas son usadas como condimento en sopas y reduce la flatulencia (Facciola,
1990). Los usos medicinales son: vermífugo, estomáquico, carminativo, antimicótico
y antiasmático, (Martínez y Martínez, 1990; Linares, 1993; Chevallir, 1996; Pahlow,
1995; Bown, 1996). Otros de los usos son como insecticida (Bown, 1996). Los
componentes principales son ascaridol, componente activo del aceite esencial
(Torres, et al., 2002), p-cimeno, limoneno, alcanfor, atasona, safrol, N-docosano, N-
heptacosano, beta-pineno, metadieno, salicilato de metilo, d- terpineol
([Link] además de alfa pineno, alfa-felandreno, alfa-
terpineno, 1,8-cineol, gama-3-careno, linalol, timol, carvacrol, gama-2-careno,
limoneno, transpinocarveol, cis-para menta 2,8 dienol, pinocarvona, trans-isocarvrol,
verbenota, neoisodihidrocarveol, carvona, acetato de bornilo (Torres et al., 2002).

14
2.5.3 Fluorensia cernua DC. Hoja sé / Hoja sen

Flourencia cernua. DC. Hoja sé. Hoja sen.

Figura 5. Flourensia cernua.

Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisión: Spermatophyta
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Género: Flourensia DC. - tarwort
Especie: cernua DC. American tarwort, Tarbush. ([Link]).
Nombres comunes: Hoja sen, Hoja sé. (Martínez, 1996).
No. de baucher: 024027.

De la familia de las Asteraceae. Arbusto de 1-2 metros de altura, hojas olorosas

y de sabor amargo. Se utiliza contra la indigestión y como purgante suave (Martínez,
1996). Se le considera un arbusto perenne, sus hojas son alternas, simples y elípticas,
llegan a medir hasta 2.5 cm de largo. Las flores son compuestas, pequeñas, solitarias

15
e inconspicuas, en cabezuelas axilares; el fruto es un aquenio ([Link]).
Contiene terpenos y compuestos fenólicos (Estell et al., 2002). En comunicaciones
personales se dice que tiene propiedades vermífugas.

2.5.4 Marrubium vulgare L. Marrubio / Manrubio.

Marribium vulgare. L. Marrubio. Manrubio

Figura 6. Marrubium vulgare.

Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisión: Spermatophyta
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Lamiales
Familia: Lamiaceae
Género: Marrubium L. - horehound
Especie: vulgare L. – horehound. ([Link]
Nombres comunes: Manrubio, marrubio. (Martínez, 1996).

No. de baucher: 024025.

16
 Marrubium vulgare L. Marrubio / Manrubio De la familia Labiatae. De
crecimiento perenne llegando a medir 0.5 metros de altura. Planta leñosa, débilmente
aromática y casi toda lanosa. Ramificada cerca de la base; tallos erectos, casi
cuadrados, de 30-60 mm de alto; hojas dentadas, ovadas, opuestas, tomentosas, de
1.5-5 cm de largo, largamente pecioladas. Flores blanquecinas, de 5-8 mm de largo,
numerosas en verticilos axilares (Stuart, 1981). Los usos medicinales que se le han
dado a esta planta son: antiséptico, antiespasmódico, digestivo, diurético,
emenagogo, expectorante y como tónico (Launert, 1981; Stuart, 1981, Lust, 1983;
Bown, 1996) y además como vermífugo, (García, 1968, Simon et al., 1984; Martínez
y Martínez, 1990; Linares, 1993; Arias y Costas, 1995; Pahlow, 1995; Martínez,
1996). Como principios activos contiene: marrubina, lactona diterpénica amarga (de
núcleo labdanofurámnco), diterpenos (marrubiol, peregrinol, vulgarol), flavonoides
(apigenina, luteolina y sus derivados 7-glucósido, 7-lactato, 7-(2 glusil) lactato y 7-
(2glucurosil)-lactato), quercetina (3-glucósido y 3-ramnoglucósido, vitexina,
vicenina ll y crisoeriol), ácidos fenólicos (cafeico, clorogénico, 1-cafeilquínico,
criptoclorogénico), trazas de aceite esencial (tricicleno, beta-pineno, bisabolon, beta-
elemona e isomenton-8-tiol), taninos, saponósidos, esteroides (beta-sitosterol), ácido
ursólico, mucílagos, pectinas, sales minerales (Fe, K) y vitamina C.
([Link]

17
2.5.5 Mentha spicata Hierbabuena, yerbabuena.

Mentha spicata. L. Yerbabuena. Hierbabuena

Figura 7. Mentha spicata

Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisión: Spermatophyta
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Lamiales
Familia: Lamiaceae
Género: Mentha L. – mint.
Especie: Mentha spicata L. – spearmint ([Link]
Sinónimos: Mentha viridis L. ([Link]
Nombres comunes: Hierbabuena, yerbabuena.
No. de baucher: 024028.

De la familia Lamiaceae. Planta perenne aromática casi glabra, con estolones

subterráneos foliados. Tallos erectos, angulosos, ligeramente ramificados, de 30 a 60

18
cm de altura. Hojas suaves y verdes, opuestas, casi sésiles, lanceoladas u ovado-
lanceoladas, con bordes profundamente aserrados, de hasta 6 cm de largo. Flores de
color lila pálido, en espigas terminales cilíndricas, irregulares, de 6-10 cm de largo
(Stuart, 1981). Se utiliza como condimento, té, aromatizante y para dar sabor a
dulces y pastas dentales. Dentro de sus propiedades medicinales se le atribuyen
propiedades antihemáticas, antisépticas, antiespasmódicas, diurética, estimulante
(Briggs, 1978; Lust, 1983; Duke y Ayensu, 1985; Martínez y Martínez, 1990; Bown,
1996; Martínez, 1996) y contra el cáncer (Duke y Yensu, 1985). Las hojas de menta
contienen aceite esencial (rico en mentol) y sus estereoisómeros (neomentol,
isomentol, mentona y ésteres de mentol), que van acompañados de mentofurano y
otros monopertenos y sequiterpenos, flavonoides (aglicones, heterósidos), taninos;
ácidos, fenoles y triterpenos ([Link]

2.6. Separación de los compuestos en extractos de plantas.

En general los procedimientos más usados para la separación de los compuestos

que son los responsables de las actividades en los extractos de las plantas incluyen el
uso de i) cromatografía de alta resolución (HPLC), ii) cromatografía de gases, iii)
cromatografía en columna y iv) cromatografía en placa fina (Touchstone, 1992;
Canell, 1998; Rubinson y Rubinson, 2001 Fessenden y Fessenden, 2001;), Este
último, es el más utilizado ya que permite identificar y/o caracterizar semi-
cuantitativamente componentes individuales de los extractos de las plantas y es muy
adecuado, rápido, sencillo y extremadamente barato comparados con los otros
procedimientos mencionados (Touchstone, 1992; Canell, 1998; Fessenden y
Fessenden, 2001; Rubinson y Rubinson, 2001). La separación por esta técnica se
basa en que los compuestos del extracto de las plantas se reparten de modo
diferencial, entre una fase estacionaria y una fase móvil; el eluente (fase móvil) se
desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los
componentes individuales de la mezcla de sustancias dependiendo de su solubilidad
y/o de su comportamiento frente a la adsorción a ambas fases. La placa separativa es
plana y el recorrido particular de cada compuesto se emplea así para su
identificación. Las separaciones se realizan generalmente por el procedimiento

19
ascendente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluente,
que es succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la
superficie de cada placa.

La identificación de cada uno de los componentes se realiza de acuerdo con su

color y del denominado valor Rf (factor de retención), es decir, el cociente entre el
recorrido del compuesto (ls) y el del eluente (lT) (Rubinson, y Rubinson, 1992). Una
vez separados los componentes de los extractos, los compuestos se visualizan con luz
visible, ultravioleta o vapores de yodo, se raspa la sílica de cada banda y se extrae
con un disolvente el compuesto y para probar su actividad biológica.

20
 3. HIPÓTESIS

Considerando la utilización de las diferentes partes de las plantas de Artemisia

ludoviciana, Chenopodium ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua y
Mentha spicata dentro de la medicina tradicional para el tratamiento de pacientes con
disentería, es posible que los extractos de la corteza, tallo y hojas de estas plantas
presenten actividad citotóxica in vitro contra Entamoeba histolytica, Giardia lamblia,
Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Shigella flexnieri y
Staphylococcus aureus.

21
 4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Determinar in vitro la actividad citotóxica contra Entamoeba histolytica,

Giardia lamblia, Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Shigella
flexnieri y Staphylococcus aureus de los extractos acuosos, acetónicos, metanólicos y
hexánicos de la corteza, tallos y hojas de Artemisia ludoviciana, Chenopodium
ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua y Mentha spicata.

4.2 Objetivos Específicos:

1. Evaluar los parámetros de crecimiento (tiempo de duplicación; tiempo de

generación, intercepto en la curva, pendiente, r2, densidad máxima en tiempo
determinado) de Entamoeba histolytica y Giardia lamblia en sus medios de cultivo
originales.

2.- Colectar la corteza, tallo y hojas y obtener los extractos acuosos, hexánicos,
acetónicos y metanólicos de las plantas Artemisia ludoviciana, Chenopodium
ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua y Mentha spicata.

3.-Determinar la CI50 (concentración inhibitoria media) de los diferentes

extractos acuoso, acetónico, metanólico y hexánico de las plantas ya mencionadas
sobre E. histolytica y G. lamblia, y en Escherichia coli O157:H7, Salmonella
choleraesuis, Shigella flexnieri y Staphylococcus aureus determinar la CMB
(concentración mínima bactericida) de los diferentes extractos de cada planta.

22
 4.- Caracterizar parcialmente por cromatografía en placa fina los compuestos de
la(s) planta(s) que mayor CI50 presenten para ambos protozoarios.

5.- Evaluar los compuestos químicamente y determinar la dosis mínima

inhibitoria sobre el crecimiento de E. histolytica, G. lamblia, Escherichia coli
O157:H7, Salmonella choleraesuis, Shigella flexnieri y Staphylococcus aureus.

23
 5. ANTECEDENTES

5.1 Efecto de los extractos de plantas sobre E. histolytica.

Poco se ha estudiado sobre los efectos de los extractos de las plantas contra E.
histolytica. Las investigaciones serias comienzan desde 1990, con el extracto acuoso
de la planta Punica granatum L y el efecto de sus alcaloides y taninos. Estos
extractos y compuestos se usaron a concentraciones de 1 a 1,000 µg/mL e inhibieron
el crecimiento de E. histolytica y E. invadens (Segura et al., 1990). Después no fue
hasta 1995, cuando se estudió el efecto del extracto etanólico de Boerhavia difusa,
Berberis aristata, Tinospora cordifolia, Terminalia chebula y Zingiber officinale
(usadas en la India) contra E. histolytica demostrando que solamente los extractos de
T. cordifolia y B. aristata inhibieron el crecimiento de este protozoario in vitro.
(Sohni et al., 1990).

Mas tarde en 1996, usaron los extracto etanólico, hexánico, n-butanólico y

clorofórmico del fruto de Piper longum contra E. histolytica a una concentración de
1,000 g/mL y la fracción del cloroformo a 500 g/mL, presentando estos extractos
una actividad amebicida moderada (Ghoshal et al., 1996). Posteriormente en 1998, se
estudiaron 45 extractos de diferentes plantas usadas como antidiarréicos en la
medicina tradicional contra E. histolytica. Solo 35 de ellas presentaron una actividad
amebicida parcial, entre las plantas usadas fueron: Paropsia brazzeana, Cryptolepis
sanguinolenta, Alchornea cordifolia, Hensia pulchella, Maprounea africana,
Rauwolfia obscura, Voacanga africana; Psisium guajava, Dialum englerianum,
Harungana madagascariensis Manguifera indica; Carica papaya, Morinda
morindoides y Tithonia diversifolia (Tona et al., 1998). En este mismo año, también
se estudió el extracto metanólico de 19 plantas mexicanas, contra E. histolytica,
encontrando que los extractos de: Acalypha phleoides, Cnidoscolus tehuacanensis,

24
Geranium niveum, Helianthella quinquenervis y Teloxys graveolens presentaron
actividad parcial y los más efectivos fueron: Rubus coriifolius, Cuphea pinetorum, y
Helanthemum glomeratum (Calzada et al., 1998).

En 1999, otro grupo de investigadores estudiaron la planta Helianthemum

glomeratum particularmente los polifenoles: flavan 3-ols, (-)-epigallocatequina
galato y la (-)-epigallocatequina, sobre el crecimiento de E. histolytica. Encontraron
una actividad importante in vitro de los extractos metanólicos (Meckes et al., 1999).
Más recientemente en el 2000 se estudió 42 extractos: acuosos, etanólicos y
hexánicos de 21 géneros (18 familias) de plantas medicinales de Sudáfrica.
Encontrando que las plantas: A. calamos, A. adianthifolia, D. oblongifolia y S. birrea
mostraron actividad significativa contra E. histolytica (McGaw et al., 2000).

Posteriormente en el año 2001 Arrieta et al., trabajaron con extractos etanólicos

de las hojas de Zanthoxylum liebmannianum los cuales demostraron efectos
inhibitorios sobre el crecimiento in vitro de E. histolytica y G. lamblia. De este
extracto se aislaron asarinina, viperina, -sistoterol y el -sistoterol glucósido. La
asarinina fue la más activa contra ambos protozoarios (Arrieta et al., 2001).

Alanís y colaboradores en el 2003 realizaron un estudio de las partes aéreas de

Rubís corrifolius, planta medicinal usada por las comunidades Mayas en el sur de
México para tratar diarrea sanguinolenta, donde aislaron 7 compuestos conocidos: (-)
epicatequina, (+)-catequina, viperina, nigaichigosido F1, -sitosterol, 3-
glucopiranósido, ácido gálico y ácido egálico, los cuales se probaron contra
E. histolytica obteniendo como resultado que la epicatequina fue el compuesto que
presentó la mayor actividad antiprotozoaria con una CI50 de 1.9 g/mL (Alanís et al.,
2003).

25
5.2 Efecto de los extractos de plantas sobre G. lamblia.

En 1997 se estudiaron 25 pacientes con giardiasis (Giardia lamblia), a los cuales

se les administró una dosis diaria de 1 g tres veces al día de “Pippali Rasayana” (PR),
droga ayurvédica preparada de Butea monosperma (leguninaceae) y de Piper longum
L., (piperaceae), donde encontraron que después de 15 días de tratamiento en 23
pacientes, desaparecieron tanto los quistes y los trofozoítos de las heces así como sus
síntomas y el dolor abdominal, la presencia de moco y células con pus, mostrando
una marcada mejoría en el perfil clínico de estos pacientes (Saxena et al., 1997). En
este mismo año Calzada et al., estudiaron el extracto metanólico de 19 plantas
mexicanas contra G. lamblia, encontrando que los extractos de las plantas derivadas
de Acalypha phleoides, Cnidoscolus tehuacanensis, Geranium niveum, Helianthella
quinquenervis y Teloxys graveolens presentaron actividad significativa contra este
protozoario (Calzada et al., 1998a).

Posteriormente en 1999 Tripathi y colaboradores, estudiaron el fruto de Piper

longum usado como remedio tradicional contra desórdenes intestinales. A este fruto
lo probaron in vivo contra Giardia lamblia en ratones y estudiaron su efecto inmuno-
estimulatorio y su actividad como giardicida. Encontraron que los extractos acuosos
y etanólicos presentaron ambas actividades ya mencionadas (Tripathi, 1999). En este
mismo año Meckes et al., estudiaron la planta Helianthemum glomeratum
particularmente los polifenoles: flavan 3-ols, (-)-epigallocatequina galato y la (-)-
epigallocatequina sobre el crecimiento de G. lamblia donde encontraron que estos
últimos fueron activos a una CI50 de 8.73 g/mL (Meckes et al., 1999).

Alanís et al., en el 2003 realizaron un estudio de las partes aéreas de Rubís

corrifolius, donde aislaron 7 compuestos conocidos: (-) epicatequina, (+)-catequina,
viperina, nigaichigosido F1, -sitosterol, 3---n-glucopiranósido, ácido gálico y
ácido egálico, los cuales se probaron contra G. lamblia obteniendo como resultado
que la epicatequina fue el compuesto que presentó la mayor actividad antiprotozoaria
con una CI50 de 1.6 g/mL (Alanís et al., 2003).

26
5.3 Efecto de extractos de plantas sobre bacterias

Han sido muy diversos los estudios de los extractos de plantas sobre los efectos
inhibitorios del crecimiento de muchas bacterias. En 1995 se estudiaron los extractos
metanólicos de Camellia sinensis L y de Euphorbi hirta L, donde de observó que
estos extractos presentaron efecto contra la disentería causada por Shigella spp,
además de no ser citotóxicos sobre el hospedero (Vijaya y Nalini, 1995). Se ha
reportado que los Mayas utilizaban extractos acuosos de diferentes variedades del
chile Capsicum ssp. (C. frutescens, C. annuun, C. baccatum, C. chinense y C.
pubbescens) para controlar las infecciones causadas por bacterias. En la actualidad se
ha probado este efecto en sensidiscos contra 15 especies de ellas y una especie de
levadura, pudiéndose identificar dos compuestos: capsicina y dihidrocapsaicina;
éstos presentaron diferentes grados de inhibición contra B. cereus, B. subtilis, C.
tetani y S. pyogenes (Cichewicz y Torpe, 1996). En ese mismo año se estudiaron 20
extractos metanólicos de plantas contra S. aureus, E. coli, P. aeruginosa y C.
albicans, los resultados mostraron que los extractos de Eucalyptus globolus, Punica
granatum, Artemisia mexicana y Bocona arborea poseen actividad contra estas
bacterias (Navarro et al.,. 1996). Otros estudios en el mismo año, probaron los
extractos etanólicos de Bisa orellana contra B. subtilis, S. aureus y S. faecalis,
obteniendo una acción bactericida a dosis altas (Irobi et al., 1996). Además en el
mismo año, se probaron 101 extractos de las plantas de Scrophulariaceae y
Acanthaceae, contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y C. albicans. La actividad
antimicrobiana se detectó en más del 40% de los extractos analizados (Meurer-
Grimes et al., 1996).

En 1997, trabajaron con 15 extractos de plantas de la familia Chenopodiaceas

donde analizaron los alcaloides, antraquinonas, cumarinas, flavonoides, saponinas,
esteroles y/o terpenos y taninos. Encontraron que la mayoría de los extractos tienen
actividad antimicrobiana contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y B. subtilis (Al-
Saleh y et al., 1997). En este mismo año, también se trabajó con los extractos
acuosos, metanólicos y clorofórmicos de Argemone mexicana, Baccharis
sordenscens, Cecropia obtusifolia, Commelina coelestis, Crescentia alata, Eryngium

27
carlinae, Eysenhardtia polistachia y Ziziphus amole contra E. coli, S. aureus, S.
lutea, P. vulgaris y C. albicans siendo el extracto metanólico de E. polistachia el
más potente a una dosis de 400 g/mL contra estos microorganismos (Zavala et al.,.
1997)

En 1998, se estudió los efectos del glicoalcaloide de la planta de Solanum

(contiene solanina y chaconina), demostrando que ratones tratados con bajas dosis de
los extractos, sobrevivieron a dosis letales de S. typhimurium (Gubarev et al., 1998).
Por otro lado, también se investigó 109 plantas procedentes de Baja California Sur,
México, usando extractos etanólicos, éstos se probaron contra S. aureus, B. subtilis,
S. faecalis, E. coli y C. albicans y se encontró que 64 plantas fueron activas contra
una o mas de estas bacterias. Entre las plantas estudiadas se encuentran Artemisia
absinthium L. y Ch. ambrosiodes L y tuvieron muy poca actividad contra S. aureus y
B. subtilis y a Mentha spicata a quien no se le observó actividad alguna contra estas
bacterias (Dimayuga et al., 1998).

Mas recientemente en el año 2000, se investigó en los extractos con éter de

petróleo, benceno, cloroformo, acetona y metanol de la planta Ficus racemosa, los
cuales fueron probados contra E. coli, B. pumilis, B. subtilis, P. aeruginosa y S.
aureus, y se encontró que éstos extractos inhibieron medianamente el crecimiento de
las bacterias (Mandal et al., 2000). En este mismo año, evaluaron los extractos
metanólicos de Picralima nitida sobre bacterias gram-positivas y gram-negativas,
encontrando una concentración mínima inhibitoria para S. aureus muy similar al
control (ampicilina) (Fakeye et al., 2000). También en ese mismo año, se evaluaron
los aceites esenciales y extractos etanólicos de Phlomis fruticosa L. con su poder
antimicrobiano y se encontró que los aceites esenciales presentaron actividad
inhibitoria en el crecimiento sobre S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, B. subtilis, S.
faecalis, K. pneumoniae y M. luteus y los extractos etanólico presentaron actividad
contra S. aureus y B. subtilis (Ristic et al., 2000).

En el 2001 se probó la actividad inhibitoria de la fracción etil acetato insoluble

del extracto metanólico de Cleistropholis patens (una hierba medicinal Nigeriana
utilizada para la fiebre tifoidea) contra S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa,
S. typhinium, A. níger y C. albicans y se observó que la fracción esteroidal fue 20 y

28
15 veces mas potente que la penicilina y el cloramfenicol contra B. subtilis y dos
veces más activa contra K. pneumoniae (Ebi y Kamalu 2001). En este mismo año se
investigó al extracto etanólico de Streblus asper sobre el crecimiento de S. mutans, S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa, S. marscenses, K. pneumoniae, Enterobacter y C.
albicans, encontrando que este extracto solo, es muy activo contra S. mutans
(Wongkhm et al., 2001). También se determinó la actividad antibacteriana de
diferentes fracciones del extracto metanólico de Ailanthus excelsa contra B. subtilis,
S. typhimurium, P. aeruginosa, E. coli y P. cichorii, encontrando que la fracción de
etil acetato inhibió el crecimiento de todas las bacterias probadas (Shrimali et al.,
2001).

En el 2003 se estudiaron las actividades antimicrobianas de los extractos

metanólicos y la fracción alcaloidea de Tabernaemontana catharinensis A. DC., por
el método de difusión de Kirby-Bauer (Pinheiro et al., 2003), donde encontraron
actividad moderada contra B subtilis, S. aureus, E. coli, S. faecalis, S. entiritidis, S.
flexnieri, S. epidermedis, Acynetobacter iwoffil (Guida et al., 2003). También se
estudió en este mismo año, las xantonas de Kielmeyera variabilis (un árbol de Brasil
usado contra enfermedades tropicales severas como schistosomiasis, leishmaniasis,
malaria, hongos y bacterias). Encontraron que los extractos metanólicos fueron muy
activos contra S. aureus y B. subtilis (Pinheiro et al., 2003).

5.4 Importancia del presente trabajo.

México cuenta con una gran diversidad etnobotánica debido a su clima, suelo y
actividad orogénica por lo que existen más de 30,000 especies de plantas (Lugo,
1992) y solo un bajo porcentaje de éstas ha sido estudiado tanto en su bioactividad
como en sus compuestos químicos. Los microorganismos, tanto enterobacterias como
protozoarios han comenzado a mostrar drogo-resistencia a los antibióticos y
medicamentos de elección. Es indispensable buscar nuevas alternativas para encontrar
compuestos que puedan matar a estos microorganismos. El trabajar con la productos
naturales nos puede proporcionar nuevas drogas o compuestos que se requieren
urgentemente para combatir estas enfermedades. Por ello, el interés de este trabajo es

29
investigar si en los extractos acuosos, acetónicos, metanólicos y hexánicos de la
corteza, tallos y hojas de las plantas Artemisia ludoviciana, Chenopodium
ambrosioides, Marrubium vulgare, Flourensia cernua y Mentha spicata existe la
presencia de principios activos citotóxicos contra: Entamoeba histolytica, Giardia
lamblia, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis, Shigella flexnieri y
Staphylococcus aureus causantes de disentería en el humano.

5.5 Originalidad y Justificación

Las plantas medicinales son consideradas como una importante fuente de

estructuras potencialmente útiles para el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos. El primer paso hacia esta meta, es la determinación de los efectos
biológicos de extractos de plantas preparados en forma tradicional. La estrategia
exitosa para la investigación de estas preparaciones involucra la selección de
extractos crudos basados en una combinación de prácticas etnofarmacológicas y en
este caso poder usarlas contra microorganismos que producen diarrea como:
Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis,
Shigella flexnieri y Staphylococcus aureus. Debido a los escasos trabajos científicos
realizados con estas plantas nos dimos a la tarea de investigar sus propiedades
bactericida y antiprotozoarias.

5.6 Contribución y prespectivas del presente trabajo

Consideramos que las principales contribuciones de este trabajo a los campos de

la etnobotánica experimental y a la de etnofarmacobiología son las siguientes: i)
hallazgos de 7 extractos que presentaron actividad citotóxica para Entamoeba
histolytica y 4 para Giardia lamblia (tablas 1 y 2); ii) las plantas de Marrubium
vulgare y Mentha spicata tuvieron un efecto sobre S. aureus (tabla 4); iii) evidencia
de que la mayoría de las plantas presentaron indicios de sesquiterpenlactonas, dobles
enlaces, oxidrilos fenólicos, azúcares y lactonas (tabla 5); iv) el extracto metanólico

30
de la planta de M. vulgare fue el que menor CI50 presentó para E. histolytica y G.
lamblia (tabla 3). Por cromatografía en placa fina se determinaron 5 fracciones, las
cuales presentaron menos del 50% de inhibición para ambos protozoarios (tabla 6).

Las perspectivas de este trabajo consisten en que a partir de los extractos de

cada planta que dieron mejor efecto sobre ambos protozoarios, extraer los
compuestos activos y analizar su contribución relativa de cada una de ellos sobre las
bacterias y los protozoarios y evaluar su citotoxicidad sobre células humanas y
animales de experimentación.

31
 6. MATERIAL Y MÉTODOS

6.1 Origen de los reactivos

Todos los compuestos usados en esta tesis, fueron grado reactivo y sus orígenes
fueron los siguientes: de Bioxon de México: extracto de levadura y peptona de
caseína; de Sigma Chemical Co. (St. Louis Mo, USA), glucosa y L-cisteína; de
Reactivos Monterrey: cloruro de sodio, ácido ascórbico, citrato férrico amónico e
hidróxido de sodio; de JRH Biosciences. (Lenexa, KS), vitaminas de Diamond; de
Control Técnico y Representaciones: el hexano, acetona, metanol y etanol; de
Bioxon, Becton Dikenson de México. S. A. de C. V: caldo soya tripticaseína y agar
granulado marca BBL. Cockeysville, Maryland. USA. Div. Becton Dickinson and
Company el cloramfenicol y de Sigma el metronidazol.

6.2 MATERIAL BIOLÓGICO

6.2.1 Cepa de HM1: IMSS de Entamoeba histolytica.

Proviene del cepario del laboratorio de Bioquímica y Fisiología Celular, de la

División de Biología Celular y Molecular del Centro de Investigación Biomédica del
Noreste. En este laboratorio se ha cultivado por 16 años en el medio PEHPS (Saìd-
Fernández et al., 1988).

32
6.2.2 Cepa de Giardia lamblia IMSS:0889.

Proviene del cepario del laboratorio de Bioquímica y Fisiología Celular, de la

División de Biología Celular y Molecular del Centro de Investigación Biomédica del
Noreste. En este laboratorio se ha cultivado por 9 años en el medio TYI-S-33
(Diamond et al., 1978).

6.3 Cepas bacterianas.

Las cepas bacteriana fueron proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología

General de la Facultad de Ciencias Biológicas de la U. A. N. L. y son: a) Escherichia
coli O157:H7 obtenida del Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica
(INDRE) Méx, D. F. b) Staphylococcus aureus ATCC 25923, c) Salmonella
choleraesuis ATCC 6962 y d) Shigella flexnieri ATCC 25931.

6.4 Preparación de suero.

6.4.1 Suero bovino estéril.

El suero se descongeló en baño de agua a 37 ºC y se descomplementó a 56 ºC

por 30 min, agitándolo suavemente cada 5 min. Se transferió asépticamente 10 mL
del suero a tubos estériles de borosilicato con tapón de rosca y se incubaron a 37 ºC
por 5 días para comprobar su esterilidad y se almacenaron a –20 ºC hasta su uso.

33
6.5 Preparación de los medios de cultivo.

6.5.1 Medio basal (PEHP) (Said-Fernández et al., 1988).

Peptona de caseína 10.0 g, D-Glucosa 6.0 g, L-cisteína 1.0 g, ácido ascórbico

0.1 g, KH2PO4 1.0 g, K2HPO4 0.6 g, extracto de hígado y páncreas 250 mL. Se
mezcló y se disolvieron los componentes en 950 mL de agua desionizada. Se ajustó
el pH a 7.0 con NaOH 10 N y se aforó a 1,000 mL con agua desionizada. El medio se
distribuyó en alícuotas de 5 mL en tubos para cultivo de 13 X 100 mm con tapón de
rosca y se esterilizó en autoclave a 121 ºC por 15 min. Posteriormente se almacenó el
medio a temperatura ambiente hasta su uso.

6.5.2 Medio basal TYI (Diamond et al., 1978).

Tripticasa 20.0 g, extracto de levadura 10.0 g, glucosa 10.0 g, NaCl 3.30 g, L-

cisteína 1.0 g, ácido ascórbico 0.2 g, KH2PO4 0.6 g, K2HPO4 1.0 g y citrato férrico
amónico 0.028 g. Los componentes se disolvieron en 950 mL de agua desionizada,
se ajustó el pH a 7.0 con NaOH 10 N y se aforó a 1,000 mL con agua desionizada. El
medio se distribuyó en alícuotas de 5 mL en tubos de 13 X 100 mm con tapón de
rosca. Se esterilizó en autoclave a 121 ºC por 15 min y los tubos se almacenaron a 4
ºC hasta su uso.

6.5.3 Medio completo PEHPS y TYI.

Se adicionó a los tubos conteniendo 5 mL de los medios PEHPS y TYI 10% de

suero bovino 48 h antes de inocularse con amibas y giardias respectivamente
(adicionado con vitaminas 107 de Diamond’s -25 mL de vitaminas; JRH
Bioscienses, Lanexa, KS por cada 1,000 mL de suero-). Al TYI-S además se le
agregó 1% de bilis bovina (0.5 g/10 mL de agua desionizada y esterilizada por

34
filtración de 0.22 micras Millex-GS, Millipore, Molsheim, France) (Keister, 1983).
Se incubó por 72 h a 37 ºC para comprobar su esterilización. Este material se usó
posteriormente para las resiembras de los protozoarios.

6.5.4 Caldo Soya-Tripticasa

Para la preparación del caldo soya-tripticasa, se siguieron las especificaciones

del fabricante (BBL), se agregó 30.0 g de caldo soya tripticasa a 1,000 mL de agua
desionizada. El caldo disuelto se distribuyó en alícuotas de 5.5 mL en tubos de 13 X
100 mm con tapón de rosca. Se esterilizó en autoclave a 120 ºC por 15 min.
Posteriormente se almacenó en refrigeración hasta su uso.

6.5.5 Agar Soya-Tripticasa

Se procedió de la misma forma que en el 6.5.4 pero con la siguiente

modificación: se agregó al caldo soya-tripticasa, 20.0 g de agar bacteriológico en
1000 mL de agua desionizada. Se calentó el medio a 70 ºC para disolver el agar. Una
parte del medio se distribuyó en tubos de 13 X 100 mm colocando alícuotas de 5 mL
y la otra parte en un matraz de vidrio. Se esterilizó en autoclave a 121 ºC por 15 min.
Después de este tiempo los tubos se colocaron en forma inclinada, y el medio del
matraz se vertió en cajas de petri de 100 X 15 mm estériles, se dejó enfriar a
temperatura ambiente y se almacenó el material en ambiente húmedo a 4 ºC hasta su
uso.

35
6.6 Cultivo axénicos de protozoarios.

6.6.1 Resiembra

Las cepas de Entamoeba histolytica HM1-IMSS y de Giardia lamblia

IMSS:0889 se mantuvieron a 37 ºC en una incubadora (Napco, modelo 5100,
Pórtland Oregón, USA). Antes de cada resiembra se observaron los cultivos en un
microscopio invertido (Reich, No. de serie WI-54220) para comprobar el buen
aspecto morfológico y la movilidad de estos protozoarios. Se colocaron los cultivos
de cada cepa en agua-hielo por 10 min, posteriormente se determinó la concentración
celular con un hemacitómetro y se inocularon 5 X 103 amibas y 1 X 104 giardias por
mL en cada uno de otros tres tubos (5.5 mL de medio suplementados con 10% de
suero bovino) en medio de cultivo PEHPS (Saìd-Fernández et al., 1988) o TYI-S-33
(suplementado 10% de suero bovino y 0.1 % de bilis bovina, Keister, 1983) fresco.
Se conservaron los cultivos de la penúltima resiembra hasta comprobar el
crecimiento celular de las amibas y las giardias. Las resiembras se realizaron cada 72
h.

6.7 Cinética de crecimiento

6.7.1 Entamoeba histolytica

Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado para cada cepa. Se

colocaron los tubos de la última resiembra en agua-hielo por 10 min, se agitaron
suavemente y se determinó la densidad celular de cada tubo con un hemacitómetro.
Se inocularon 5,000 trofozoítos/mL a 63 tubos de 13 X 100 mm conteniendo 5.5 mL
de medio PEHPS. Cada 24 h se determinó en 3 tubos el número de trofozoítos por
mL por tubo.

36
6.7.2 Giardia lamblia:

Se utilizó el procedimiento antes descrito para E. histolytica con la siguiente

modificación: de los mejores tubos de la última resiembra, se enfriaron en agua-hielo
por 10 min, se agitaron suavemente y se determinó la densidad celular haciendo una
dilución de 1:10 para contar a las giardias (usando 100 L de medio de cultivo
enfriado y homogenizado en 900 L de formalina al 10%), se obtuvo usando un
hemacitómetro el número de trofozoítos por mL por tubo. Se inoculó 45 tubos (por
triplicado) con 5.5 mL de cultivo TYI-S-33 y un inóculo de 1 X 104 trofozoítos/mL,
los cuales se contaron cada 24 h.

6.8 Cultivos bacterianos

Los cultivos bacterianos se activaron, inoculándolos en caldo soya-tripticasa a

37 °C/24 h. Posteriormente se reincubaron en agar soya tripticasa y se incubaron
nuevamente a 37 ºC/24 h, para enseguida almacenarse a 4 ºC/30 días hasta su
utilización.

6.8.1 Ajuste de los inóculos bacterianos

De un cultivo activado en agar soya tripticas se tomó un inóculo y se

resuspendió en un tubo con solución salina al 0.85%, hasta obtener una absorbancia
de 0.098-0.1 equivalente al tubo 0.5 de la escala de MacFarland. La lectura se llevó
a cabo en un espectrofotómetro (TURNER Sp830) a una longitud de onda de 600
nm.

37
6.9 Colecta de las plantas

6.9.1 Localización

Las plantas se colectaron en el municipio de Galeana. Este municipio se

encuentra en la parte central del Estado de Nuevo León, en las coordenadas 24º 50’
latitud norte y 100º 04’ longitud oeste, a una altura de 1,655 metros sobre el nivel del
mar. Limita al Norte con Rayones y con el estado de Coahuila; al Sur con Aramberri
y Doctor Arroyo; al Este con Rayones, Montemorelos, Linares e Iturbide, y al Oeste
con los estados de Coahuila y San Luis Potosí. Su extensión territorial es de 7,154.6
kilómetros cuadrados y presenta los siguientes cerros: El Cerro del Potosí con 3,715
(de los más altos de Nuevo León), El Pañuelo, El Orégano y las Sierras de Cateado y
Mazmorras. Galeana tiene los ríos: Pablillo, Potosí y Pilón, la Laguna de Labradores
y las presas: el Vikingo y el Carmen. Su clima es seco, estepario y frío; es templado
con lluvias de verano y una precipitación media de 393 mm. Galeana presenta una
temperatura media anual de 19 ºC. Su flora se compone de pinos, encinos, oyameles,
cedros, mezquites, palmas, lechuguillas, magueyes, nopales, carrizos y nogales
([Link]

38
 Figura 8. Mapa del Estado de Galeana, N.L.

Las plantas se colectaron del ejido San Antonio del Salero, municipio de
Galeana. Obtuvimos corteza, tallo y hojas de Artemisia ludoviciana Nutt.,
Chenopodium ambrosioides L., Marrubium vulgare L., Mentha spicata L y
solamente las hojas de Fluorensia cernua DC. Parte de cada planta, se colocó en una
prensa botánica y se identificaron en el Departamento de Fanerógamas del
Laboratorio de Botánica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Autónoma de Nuevo León. Esto con el objeto de obtener su identificación correcta y
tener la certeza de que las plantas fueron las auténticas para hacer las pruebas de
actividad antiprotozoaria y antimicrobiana. Otra parte del material colectado se
deshidrató en una estufa a 37 °C. Después se trituró cada parte seca de las plantas,
con un molino manual y se almacenó el material en frascos oscuros de vidrio. De

39
cada muestra se obtuvieron los extractos, hexánicos, acetónicos, metanólicos y
acuosos. La preparación de los extractos se realizó en el laboratorio de Bioquímica y
Fisiología Celular del CIBIN, IMSS.

6.10 Obtención de los extractos

6.10 1 Extractos acuosos

A partir de la muestra seca y molida se agregaron 60.0 g a 600 mL de agua

bidestilada y se llevó a ebullición/20 min. Después de este tiempo, se retiró del fuego
y se dejó reposar hasta que la infusión alcanzó la temperatura ambiente. El extracto
resultante se filtró a través de filtros de 8.0, 4.0, 0.8 y 0.45 micras e inmediatamente
se llevó a sequedad usando una liofilizadora (LABCONCO, Freeze Dry System,
Frezone 12 USA). Una vez liofilizadas las muestras, se colocaron en frascos de
vidrio oscuro y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso.

Figura 9. Filtración del extracto acuoso

40
 Figura 10. Liofilización de los extractos acuosos

6.10.2 Extractos hexánicos.

Se colocaron en matraces erlenmeyer con tapón de rosca, 300 mL de hexano y

150.0 g de la muestra seca de las plantas de Artemisia ludoviciana Nutt.,
Chenopodium ambrosioides L., Marrubium vulgare L., Mentha spicata L y solo las
hojas en el caso de Fluorensia cernua. Se mantuvieron los matraces en un agitador
shaker (Controlled Environment Incubator Shaker, New Brunswick Scientific, N.J.,
USA) por 7 días a temperatura ambiente. Después de este tiempo se filtró cada
extracto en filtros Wathman No. 1. El filtrado se dejó evaporar hasta sequedad a
temperatura ambiente usando una campana de extracción. Se obtuvo el extracto
mediante un raspado de los residuos y se almacenaron en frascos de vidrio oscuro
hasta su uso. Para el análisis de cada extracto, se pesó 0.3 g de cada extracto y se
resuspendió en 3 mL de etanol absoluto (solución madre). Posteriormente se
esterilizó cada solución madre usando filtros de 0.22 micras (Millipore, Molsheim,
France), y se almacenó cada solución del extracto estéril a - 20 ºC hasta su uso.

41
6.10.3 Extractos acetónicos.

Al residuo vegetal hexánico de cada planta se agregaron 300 mL de acetona. Se

colocaron en agitación constantemente por 7 días a temperatura ambiente en un
agitador sheker. Después de este tiempo, se filtró con papel Wathman No. 1. A los
filtrados los evaporamos a sequedad y se conservaron en frascos de vidrio oscuro a
temperatura ambiente hasta su uso. Se resuspendieron 0.3 g de cada extracto en 3 mL
de etanol absoluto, se esterilizó por filtración y se almacenaron a -20 ºC hasta su uso.

6.10.4 Extractos metanólicos.

A los residuos vegetales acetónicos de cada planta se les agregó 300 mL de

metanol. Se agitaron los extractos de cada planta en forma constante por 7 días a
temperatura ambiente usando un agitador sheker. Después de este tiempo, se filtró
cada extracto en papel Wathman No. 1. El filtrado se evaporó a temperatura
ambiente en una campana de extracción. Se rasparon los residuos de cada extracto y
se conservaron en frascos oscuros hasta su uso. Resuspendimos 0.3 g de cada
extracto en 3 mL de etanol absoluto, se esterilizó por filtración y se almacenó cada
extracto a -20 ºC hasta su uso.

42
 Figura 11. Obtención de los extractos con solventes

Figura 12. Extractos en el sheker en agitación constante.

43
6.11 Obtención de la CI50 en E. histolytica y G. lamblia de los extractos de cada
planta y el metronidazol.

La CI50 es la concentración inhibitoria necesaria para obtener el 50 % de los

microorganismos vivos cuando se trabaja en condiciones de citotoxicidad de algún
fármaco.

6.11.1 Incorporación de los extractos de las plantas a los medios de

cultivo PEHP (Amibas) y TYI (Giardias) y la obtención de sus
CI50

[Link] Acuoso.

Tubos con tapón de rosca conteniendo 5 mL de medio PEHP, TYI y Soya-

Tripticasa-Caldo se esterilizaron a 121 ºC por 15 min y se dejaron enfriar. A los
tubos con medio PEHP y TYI les añadimos 10 % de suero (con vitaminas y al TYI-
S-33 1 % de bilis bovina)., se añadió 50 µL de cada uno de los extracto acuosos de
cada planta previamente esterilizados por filtración con filtros de 0.22 , ajustando
las concentraciones desde 10 a 0.5 mg/mL. Se inocularon los tubos de PEHPS con 5
X 103 amibas/mL y en el caso de TYI-S 1 X 104 giardias/mL y las bacterias con 1.5
X 106 bacterias/mL. Se determinó el número de trofozoítos en los medios PEHPS y
TYI-S-33 cada 72 h con un hemacitómetro y en el caso de las bacterias a las 24 h, se
seleccionaron los tubos con ausencia de turbidez y se corroboró la ausencia de
crecimiento inoculando 10 L en cajas petri con agar soya tripticasa. Como control
positivo usamos al cloranfenicol (a concentraciones de 0.001 a 20 mg/mL) y como
control negativo 50 µL de etanol absoluto. Con estos datos determinamos la
Concentración Mínima Bactericida.

[Link] Hexánico, acetónico y metanólico.

A partir de los diferentes extractos obtenidos con diferentes polaridades de cada

planta, se procedió de igual manera que en el extracto anterior, solo que las
concentraciones de cada extracto se ajustaron desde 5.0 a 0.009 mg/mL. Los tubos

44
con medio PEHPS y TYI-S-33 se inocularon con la misma concentración de cél/mL
que en el caso anterior; de la misma forma se procedió con las bacterias. El número
de trofozoítos y de bacterias se determinó de igual forma que en el caso anterior.

En todos los experimentos con los extractos de las plantas, se usó como control
positivo al metronidazol (0.4 a 0.05 µg/mL) disuelto en los medios PEHPS (amibas)
o TYI-S-33 (giardias) y al cloramfenicol (20 mg/mL a 10 µg/mL) para las bacterias.
Como control negativo usamos 50 µL de etanol absoluto (Sigma). Se incubó durante
72 h, después de este tiempo se determinó el número de trofozoítos con un
hemacitómetro y el número de bacterias a las 24 h. Posteriormente se inoculó en
cajas Petri con agar soya tripticasa para descartar crecimiento bacteriano.

6.12 Análisis estadístico de la CI50 usando el método PROBIT

(Finney, 1971).

Se obtuvo la CI50 de cada experimento del logaritmo base 10 del número de

trofozoítos vivos de cada dosis probada en los extractos de cada planta; el
metronidazol (control positivo) y el etanol (control negativo); estos datos los
comparamos con el número de trofozoítos contra el control negativo. Los datos se
procesaron y analizaron en el paquete estadístico SPSS versión 10. Se graficó el
número encontrado en Probit contra el logaritmo base 10 de las concentraciones
probadas de cada extracto (Finney, 1971).

6.13 Obtención de la CMB de los extractos de las plantas sobre las bacterias

La actividad antimicrobiana se mide determinando la cantidad más pequeña del

agente que se necesita para inhibir el crecimiento de un organismo control, valor que
se conoce como concentración mínima bactericida (CMB). Se determinó las CMB de
los extractos de cada planta en tubos con 5 mL de Caldo-Soya-Tripticasa, a los
cuales se les añadió diferentes concentraciones de cada extracto. Se inocularon tubos
con 10 µL de la suspensión bacteriana y se incubó por 24 h. Después de la

45
incubación se observó la ausencia de crecimiento, indicado por la ausencia de
turbidez visible y se corroboró depositando en placas con agar soya tripticasa.

6.13.1 Técnica de dilución en tubo usando los extractos de las plantas sobre el
crecimiento de las bacterias.
-

[Link] Acuosos

Se procedió igual que el inciso [Link]

[Link] Hexánico, acetónico y metanólico

Se procedió igual que el inciso [Link]

6.14. Identificación de metabolitos secundarios de los extractos de las pantas por

métodos químicos. (Domínguez, 1973).

Se identificaron los metabolitos secundarios en cada extracto de cada planta y

determinamos los posibles grupos funcionales por los métodos de pruebas coloridas.

6.14.1 Prueba de Liebermann-Burchard

Para triterpenos y compuestos esteroidales. En una placa de porcelana se añadió

una gota del extracto, 1 gota de cloroformo y tres gotas del reactivo de Liebermann-
Burchard (20 µL de ácido sulfúrico más 1 mL de ácido acético anhidro y 1 mL de
cloroformo), un viraje de color hacia azul, verde, rojo o anaranjado es una prueba
positiva para estos compuestos.

46
6.14.2 Prueba de Salkowski

Para esteroles y metilesteroles. A 1 gota de cada muestra de extracto de cada

planta se le añadió 1 mL de cloroformo y 1 mL de ácido sulfúrico, al contacto se
observa un viraje de color hacia el amarillo o rojo en la presencia de estos
compuestos.

6.14.3. Prueba de ácido sulfúrico

Para flavonoides. A una gota del extracto, se le agregó 3 gotas de ácido sulfúrico
concentrado. Si la coloración varía corresponde a: amarillo para flavonas y
flavonoles; naranja-guinda para flavonas; rojo-azuloso para chalconas y roja-púrpura
para quinonas.

6.14.4. Prueba de Baljet

Para sesquiterpenlactonas. Se utilizaron dos soluciones mezcladas en volúmenes

iguales antes de usarse, reactivo 1: solución A: se disolvió 1.0 g de ácido pícrico en
100 mL de etanol; y la solución B: 10.0 g de hidróxido de sodio en 100 mL de agua
bidestilada. A 3 gotas de los extractos, se agregaron 4 gotas del reactivo 1, la
coloración naranja a roja obscura representa una prueba positiva.

6.14.5. Prueba de Dragendorff

Para alcaloides. Modificación de Meunier y Machelobuf. Se obtuvo el reactivo

2: solución A: A 10 mL de ácido acético glacial y 40 mL de agua bidestilada, en la
cual se le disolvieron 0.85 g de nitrato de bismuto; y solución B: se disolvieron 8.0 g
de yoduro de potasio en 20 mL de agua bidestilada. El reactivo 2 lo preparamos
cuando mezclamos 5 mL de la solución A con 4 mL de la solución B y aforamos a

47
100 mL con agua bidestilada. A 1 gota del extracto se le agregaron 80 µL del
reactivo 2, al contacto las muestras que se tornaron a una coloración rojas o naranjas
persistentes por 24 horas nos indica una prueba positiva.

6.14.6. Prueba de permanganato de potasio

Para dobles enlaces. Se disolviero 2.0 g de permanganato en 100 mL de agua

bidestilada. Pesamos 0.2 mg de cada extracto y agregamos 3 gotas del permanganato.
Si se observa precipitado café la prueba es positiva.

6.14.7. Prueba de cloruro férrico

Para oxhidrilos fenólicos. A 1 gota del extracto le agregamos 3 gotas de etanol

y 20 µL de una solución de cloruro férrico (2.5% en agua bidestilada). Al contacto, si
aparece una coloración o precipitado rojo, azul, violeta o verde se considera positiva.

6.14.8. Prueba de Molisch

Para azúcares. Se añadiieron a tubos de ensaye de 13 X 100 mm 2 gotas del

extracto con 60 µL de reactivo de Molisch (1 g de alfa naftol en 100 mL de etanol al
95%), se agitaron los tubos y se añadió a cada tubo 2 ml de ácido sulfúrico
concentrado por las paredes. La prueba se consideró positiva si se observa un anillo
coloreado en la interfase.

48
6.14.9. Prueba de bicarbonato de sodio

Para saponinas. Se mezclaron 2 gotas de cada extracto de cada planta con 3

gotas de una solución de bicarbonato al 10% y la aparición de burbujas en los tubos
indica la presencia de estos compuestos.

Figura 13. Placa de porcelana con pruebas coloridas

6.15. Cromatografía en placa fina de los extractos de las plantas.

Los extractos se separaron en fracciones usando cromatografía en placa fina

(silica gel GHL, F-254 de 250 m, Universal Cientific Incorporated Merck Inc.).

Se aplicaron 3 mL del extracto (1 g en 10 mL de etanol), gota a gota con una

jeringa de 10 mL a 1.5 cm del borde inferior de una cormatoplaca. Se secaron las
muestras con calentamiento ligero con aire de un secador de pelo industrial. Se
colocó verticalmente las cromatoplacas dentro de cámaras porta cromatoplacas. Se
usó como disolvente una mezcla de cloroformo-acetona (9.5:0.5). Se cerraron las
cámaras y se dejó ascender el disolvente hasta 0.5 cm antes de terminar las

49
cromatoplacas. Se evaporó el disolvente a temperatura ambiente y se observaron las
fracciones usando luz visible y luz ultravioleta. En base a las separaciones de las
fracciones se obtuvieron los Rf de cada fracción: el cociente entre el recorrido de la
fraccion (ls) y el del eluente (lT).
ls (cm)
Rf =
lT (cm)

Figura 14. Corrimiento de las muestras en cromatoplacas de

sílica gel.

6.16 Aislamiento de las fracciones.

Se aislaron las fracciones de las cromatoplacas que mayor separación tuvieron,

se raspó cada fracción y se colocaron en tubos de poliestireno de 50 ml. A cada tubo
se le agregó 10 mL de etanol absoluto y se agitaron en un vórtex 15 min, después se
centrifugaron 2,500 r.p.m. por 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante
se colocó en tubos de vidrio 15 X 150 mm (previamente pesados) y se llevaron a
sequedad en una estufa a 45 ºC. Se determinó por diferencia de peso la cantidad de

50
cada muestra y se ajustaron las concentraciones entre 111 y 123 µg/mL en etanol
absoluto.

6.17 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia.

Se obtuvieron las fracciones de las cromatoplacas a partir de los extractos. Cada

fracción se probó contra el porcentaje de viabilidad en E. histolytica y G. lamblia. A
tubos con tapón de rosca y 5 mL de medio PEHPS (amibas) y TYI-S-33 (giardia), se
les añadieron 50 µL de cada fracción y se ajustaron las fracciones a la máxima
concentración. Se inocularon los tubos de PEHPS con 5 X 103 amibas/mL y en el
caso de TYI-S 1 X 104 giardias/mL. Se determinó el número de trofozoítos en los
medios PEHPS y TYI-S-33, después de incubarlos por 72 h con un hemacitómetro y
los resultados se comprobaron contra el control negativo (etanol absoluto).

6.18 Determinación de los grupos funcionales de las fracciones aisladas

A fracciones aisladas de la cromatografía se les realizó las pruebas coloridas de

acuerdo a lo descrito por Domínguez, 1973 tal y como se describe en el punto 6.14

51
 7. RESULTADOS

En esta investigación se decidió explorar el efecto de los extractos, hexánicos,

acetónicos, metanólicos y acuosos de las siguientes plantas: corteza, tallo y hojas de
Artemisia ludoviciana Nutt., Chenopodium ambrosioides L., Marrubium vulgare L.,
Mentha spicata L y solamente las hojas de Fluorensia cernua DC, sobre el
crecimiento in vitro de E. histolytica, G. lamblia y sobre las bacterias: E. coli, S.
aureus, S. choleraesuis y S. flexnieri.

7.1 Relación temporal del crecimiento de la cepa HM1:IMSS de

E. histolytica y la cepa IMSS:0989 de Giardia lamblia.

Se determinó matemáticamente por medio de regresión lineal en curvas de

crecimiento de E. histolytica y G. lamblia los parámetros de crecimiento como el
tiempo de duplicación, inóculo y días de incubación necesarios para obtener cultivos
creciendo en la fase exponencial y en buenas condiciones fisiológicas para cada
protozoario (fig. 15 y 16).

7.1.1 E. histolytica cepa HM1:IMSS.

La fig. 15 corresponde a una curva típica de crecimiento de la cepa HM1:IMSS,

en donde se observa una ausencia de la fase lag de crecimiento. La función que
encontramos en la fase exponencial de crecimiento de la cepa HM1:IMSS
correspondió a la siguiente ecuación:
Número de amibas/mL = em X + b.
Correlación con la recta r2 = 0.95

52
 A partir de esta ecuación se determinó un tiempo de duplicación de 33.76 h, un
inóculo de 5 X 103 amibas/mL y el tiempo de cultivo de 3 días necesario para
obtener cultivos creciendo en la fase exponencial y en buenas condiciones
fisiológicas.

1000000

100000
Amibas/mL

10000

1000
0 1 2 3 4 5
Días de incubación

Figura 15. Relación temporal del crecimiento de la cepa HM1:IMSS de E.

histolytica. Cada punto corresponde a tres determinaciones independientes en tres
ensayos diferentes. El coeficiente de correlación con la recta (r2) = 0.95; P< 0.001.

53
7.1.2 G. lamblia cepa IMSS:0989.

La fig. 16 corresponde a una curva típica de crecimiento de la cepa de G.

lamblia cepa IMSS:0989. La función que se encontró en la fase exponencial de
crecimiento de G. lamblia correspondió a la siguiente:
Número de trofozoítos/mL = em(x)+b.
Correlación con la recta r2 = 0.996
A partir de esta ecuación se determinó un tiempo de duplicación de 10.36 h, un
inóculo de 1 X 104 giardias/mL, y un tiempo de cultivo de 3 días necesario para
obtener cultivos creciendo en la fase exponencial y en buenas condiciones
fisiológicas.

10000000

1000000
Giardias/mL

100000

10000

1000
0 1 2 3 4
Días de incubación

Figura 16. Relación temporal del crecimiento de la cepa IMSS:0989 de G. lamblia.

Cada punto corresponde a tres determinaciones independientes de tres experimentos
diferentes. El coeficiente de correlación con la recta (r2) = 0.996; P< 0.001.

54
7.2 Determinación del efecto del metronidazol sobre el crecimiento
de E. histolytica y G. lamblia.

Una vez obtenido los parámetros de crecimiento y las condiciones óptimas de

cultivo de ambos protozoarios, determinamos la CI50 del metronidazol (control
positivo), ya que este medicamento se usa por excelencia para matar a ambos
parásitos. Para ello adaptamos un método de ensayo que nos permitiera evaluar con
precisión y reproducibilidad la CI50 en ambos protozoarios usando extractos de
plantas, para después identificar el ó los compuestos responsables de este efecto.

Se encontró que las concentraciones crecientes de 0.05-0.4µg/mL del

metronidazol en los medios de cultivo, disminuyeron el crecimiento tanto de E.
histolytica (fig. 17) como G. lamblia (fig. 18). Con el uso de la prueba estadística de
Probit determinamos una CI50 para E. histolytica que fue de 0.124 µg/mL y para G.
lamblia fue de 0.205 µg/mL; es decir el metronidazol fue 1.65 veces más activo
contra las amibas que contra las giardias.

6.5
6
5.5 CI50= 0.124g/mL
Probit

5
4.5
4 y = 1.51x + 6.27
3.5 R2 = 0.8635
3
-0.5 -0.7 -0.9 -1.1 -1.3 -1.5
Log de la concentración del metronidazol
(g/mL)

Figura 17. Relación entre la cantidad de metronidazol y el crecimiento de E.

histolytica. Estos resultados se procesaron y analizaron por el método de Probit,
usando el paquete estadístico de SPSS-10. Cada punto corresponde a tres
determinaciones independientes en tres experimentos diferentes.

55
 6.5
6
5.5
• CI50= 0.205g/mL
Probit

5
4.5
4
y = 1.7457x + 6.0813
3.5
R2 = 0.8889
3
0 -0.5 -1 -1.5
Log de la concentración del metronidazol
(g/mL)

Figura 18 Relación entre la cantidad de metronidazol y el crecimiento de G.

lambla. Estos resultados se procesaron y analizaron por el método de Probit, usando
el paquete estadístico de SPSS-10. Cada punto corresponde a tres experimentos
independientes y tres determinaciones en cada experimento.

7.3 Determinación de la CI50 de los extractos de las plantas sobre

E. histolytica y G. lamblia.

Una vez que se determinó la CI50 con el metronidazol sobre E. histolytica y G.

lamblia se detectó y cuantificó el efecto de los extractos; hexánicos, acetónicos,
metanólicos y acuosos de las plantas; corteza, tallo y hojas de Artemisia ludoviciana
Nutt., Chenopodium ambrosioides L., Marrubium vulgare L., Mentha spicata L y
solamente las hojas de Fluorensia cernua DC.

56
7.3.1 E. histolytica.

Se encontró que las CI50 de todas las plantas en sus extractos acuosos resultaron
con valores mayores de 100 µg/mL como se puede ver en la tabla 1. En los extractos
obtenidos con los diversos disolventes encontramos que las CI50 más bajas fueron:
acetónico de marrubio con 7 µg/mL y el metanólico de yerbabuena con 8 µg/mL. El
metanólico del marrubio y el acetónico de la yerbabuena fueron muy similares con
una CI50 de 12 y 13 µg/mL y el hexánico y acetónico del epazote con 57 y 58 µg/mL
respectivamente (tabla 1).

TABLA 1
CI50 DE LOS EXTRACTOS DE LAS PLANTAS CONTRA E. histolytica. µg/mL

PLANTA ACUOSO HEXÁNICO ACETÓNICO METANÓLICO

A. ludoviciana 2,243 122 117 322
(ISTAFIATE)
Ch. ambrosioides 3,274 57 58 186
(EPAZOTE)
F. cernua 1,067 264 232 236
(HOJASEN)
M. vulgare 534 230 7 12
(MARRUBIO)
M. spicata 357 17 13 8
(YERBABUENA)

METRONIDAZOLa 0.124
a
control positivo.

57
7.3.2 G. lamblia.

Se encontró que las CI50 de los extractos acetónicos y metanólicos del marrubio
y del hojasen dieron valores menores de 100 µg/mL y (tabla 2). Las cantidades
encontradas de sus CI50 fueron muy similares 34 a 42 µg/mL a excepción del
acetónico del marrubio que fue de 90 µg/mL.

TABLA 2
CI50 DE LOS EXTRACTOS DE LAS PLANTAS CONTRA G. lamblia. µg/mL

PLANTA ACUOSO HEXÁNICO ACETÓNICO METANÓLICO

A. ludoviciana
1,905 137 496 298
(ISTAFIATE)
Ch. ambrosioides
3,039 597 135 580
(EPAZOTE)
F. cernua
943 119 42 35
(HOJASEN)
M. vulgare
960 502 90 34
(MARRUBIO)
M. spicata
982 185 110 380
(YERBABUENA)

METRONIDAZOLª 0.205
a
Control positivo

58
 La tabla 3 nos muestra el resumen de los extractos de las plantas y la CI50
para E. histolytica y G. lamblia

TABLA 3
CI50 DE LOS EXTRACTOS DE LAS PLANTAS
CONTRA E. histolytica/G. lamblia µg/mL

PLANTA ACUOSO HEXÁNICO ACETÓNICO METANÓLICO

A. ludoviciana 2,243 122 117 322
(ISTAFIATE) 1,905 137 496 298
Ch. ambrosioides 3,274 57 58 186
(EPAZOTE) 3,039 597 135 580
F. cernua 1,067 264 232 236
(HOJASEN) 943 119 42 35
M. vulgare 534 230 7 12
(MARRUBIO) 960 502 90 34
M. spicata 357 17 13 8
(YERBABUENA) 982 185 110 380
0.124
METRONIDAZOLa
0.205
a
Control positivo

7.4 Determinación de la CMB de los extractos sobre E. coli, S. aureus,

S. choleraesuis y S. flexnieri.

Los extractos hexánicos, acetónicos y metanólicos de las plantas no mostraron

actividad citotóxica a 900 g/mL contra el crecimiento de las bacterias (tabla 4). Se
encontó que solo el extracto acuoso de las plantas Marrubium vulgare y Mentha
spicata tuvieron un efecto sobre S. aureus observándose una CMB de 5 y 5.5 g/mL
respectivamente (tabla 5). Se usó el cloranfenicol como control positivo.

59
 TABLA 4
CMB DE LOS EXTRACTOS DE A. ludoviciana, Ch. ambrosioides, F. cernua, M.
vulgare y M. spicatha contra E. coli O157:H7, S. aureus,
Salmonella choleraesuis y Shigella flexnieri.

E. coli S. aureus S. choleraesuis S. flexnieri

Extractos CMB µg/mL CMB µg/mL CMB µg/mL CMB µg/mL
HEXÁNICOS > 900 > 900 > 900 > 900

ACETÓNICOS > 900 > 900 > 900 > 900

METANÓLICOS > 900 > 900 > 900 > 900

CLORAMFENICOL 40 µg/ mL

TABLA 5
CMB DE LOS EXTRACTOS ACUOSOS DE LAS PLANTAS CONTRA E. coli
O157:H7, S. aureus, Salmonella choleraesuis y Shigella flexnieri.

E. coli S. aureus S. choleraesuis S. flexnieri

Extractos CMB mg/mL CMB mg/mL CMB mg/mL CMB mg/mL
A. ludovisiana > 10 > 10 > 10 > 10

Ch. ambrosioides > 10 > 10 > 10 > 10

F. cernua > 10 > 10 > 10 > 10

M. vulgare > 10 5 > 10 > 10

M. spicata > 10 5.5 > 10 > 10

CLORAMFENICOL 40 µg/ mL

7.5 Determinación de los metabolitos secundarios presentes en los

extractos de cada planta.

Se determinaron los metabolitos secundarios de cada extracto; hexánico,

acetónico, metanólico y acuoso de las plantas Artemisia ludoviciana Nutt.,
Chenopodium ambrosioides L., Marrubium vulgare L., Mentha spicata L y
Fluorensia cernua usando las pruebas coloridas. Se encontraron
sesquiterpenlactonas, dobles enlaces, oxidrilos fenólicos, azúcares y lactonas (tabla

60
6). Algunos extractos presentaron alcaloides, saponinas y solo un extracto, el acuoso
de Artemisa ludoviciana presentó triterpenos y compuestos esteroidales, como se
puede observar en la tabla 6.

61
 TABLA 6
METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN LOS EXTRACTOS

Extractos de las plantas

Pruebas realizadas Artemisia Chenopodium Flourensia Marrubium Mentha
ludoviciana ambosioides cernua vulgare Spicata
+1 -1 +1 ±1 +1
+2 +2 +2 +2 +2
Sesquiterpenlactonas
+3 +3 +3 +3 +3
+4 -4 +4 -4 +4
-1 +1 -1 -1 -1
+2 -2 -2 -2 -2
Alcaloides
-3 -3 -3 -3 -3
-4 +4 +4 -4 -4
+1 +1 +1 +1 +1
+2 +2 +2 +2 +2
Dobles enlaces
+3 +3 +3 +3 +3
+4 +4 +4 +4 +4
-1 +1 +1 +1 +1
+2 +2 +2 +2 +2
Oxidrilos fenólicos
-3 +3 +3 +3 +3
+4 -4 +4 -4 +4
-1 +1 +1 +1 -1
+2 -2 +2 +2 +2
Azúcares
-3 +3 +3 +3 +3
+4 +4 +4 -4 -4
-1 -1 -1 -1 -1
-2 -2 -2 -2 -2
Saponinas
-3 -3 -3 -3 -3
-4 +4 +4 -4 +4
-1 -1 -1 -1 -1
Triterpenos y -2 -2 -2 -2 -2
Comp. esteroidales -3 -3 -3 -3 -3
+4 -4 -4 -4 -4
+1 +1 +1 +1 -1
+2 +2 +2 +2 +2
Lactonas
-3 -3 +3 +3 +3
+4 +4 +4 +4 +4

1) Extracto hexánico, 2) acetónico, 3) metanólico, 4) acuoso

62
7.6 Separación en fracciones del extracto de M vulgare usando cromatografía
en placa fina.

Se seleccionó el extracto metanólico de la planta de M. vulgare ya que este

extracto fue el que menor CI50 presentó para E. histolytica y G. lamblia (tabla 3). El
extracto metanólico se separó por cromatografía en placa fina y se observaron las
manchas con luz visible y luz ultravioleta (fig. 19). Se determinó el Rf de cada una y
se aislaron 5 fracciones cuyos Rf fueron los siguientes: 0.94, 0.90, 0.84, 0.25 y 0.17
(fig. 19).

CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA DEL EXTRACTO METANÓLICO

DE Marrubium vulgare

Rf
0.94
0.90
0.84

0.25
0.17

L. VISIBLE L. ULTRAVIOLETA

Figura 19. Separación y aislamiento del extracto metanólico de M. vulgare usando

cromatografía en placa fina.

63
7.7 Efecto de las fracciones sobre E. histolytica y G. lamblia.

Se analizó el efecto de las fracciones sobre el porcentaje de inhibición en ambos

protozoarios, se encontró que todas las fracciones presentaron menos del 50% de
inhibición. La fracción con mayor % de inhibición (41%) fue para E. histolytica con
un Rf de 0.25 y para G. lamblia la fracción con Rf de 0.90 con un 40% de inhibición
(tabla 6). Las de menor % de inhibición fueron la de 0.90 para E. histolytica (12%) y
para G. lamblia fue la de 0.17 (7%) tabla 6.

Tabla 7.
EFECTO DE LOS COMPUESTOS AISLADOS SOBRE EL
CRECIMIENTO DE E. histolytica y G. lamblia

Concentración E. histolytica G. lamblia

Rf
máxima (µg/ml) % inhibición % inhibición
0.94 123 34 20
0.90 117 12 40
0.84 121 14 20
0.25 111 41 23
0.17 119 31 7

Tabla 6. Efecto de las compuestos aislados sobre el crecimiento de E. histolytica

y G. lamblia

7.8 Determinación de los grupos funcionales en las bandas .

Se realizaron las pruebas coloridas descritas en el número 6.14 y se encontró

que ambas bandas con Rf de 0.90 y 0.95 mostraron la presencia de
sesquiterpenlactonas.

64
 8. DISCUSIÓN

En todos los pueblos del mundo el proceso de salud-enfermedad es una realidad

concreta presente en el ciclo de vida de todos los individuos. Desde siempre ha sido
una preocupación básica del hombre la observación de sus padecimientos hasta llegar
a elaborar complejas concepciones sobre la vida y la muerte, las enfermedades y sus
tratamientos. Parte importante del patrimonio cultural de cada pueblo es este
desarrollo conocedor, y a partir de él, se han conformado sistemas médicos empíricos
teniendo como base la retención y uso de los recursos naturales del entorno biótico.

Estos conocimientos se han transmitido de generación en generación para

preservar la vida y permitir la reproducción y florecimiento de la propia cultura.
Miles de años de observación y experimentación empírica han sido necesarios para la
evolución de los diversos sistemas médicos empíricos alrededor del mundo, de las
concepciones que los fundamentan, así como del conocimiento de plantas, animales
y minerales que constituyen los nichos ecológicos. Se han seleccionado los
elementos útiles con potencialidades curativas y elaboradas taxonomías y diferentes
tratamientos para las necesidades de salud que afrontan las sociedades.

Frecuentemente se piensa que la medicina tradicional abarca sólo el manejo de

medicamentos naturales o más específicamente, la curación herbolaria. EI concepto
de medicina tradicional es una nominación convencional adoptada recientemente por
investigadores de los procesos de salud-enfermedad para referirse a los sistemas
médicos empíricos, organizados y fundamentados en las diversas culturas del mundo.
Aunque existen generalidades compartidas, cada sociedad ha elaborado un sistema
terapéutico complejo que engloba concepciones ideológicas y prácticas terapéuticas,
al igual que el desarrollo de especialistas que saben cómo aplicarlas.

65
 Muchos de los pacientes que hoy en día usan terapias herbales han manifestado
el uso de la medicina tradicional desde los años 90, donde el uso de medicina no
convencional no difiere de sexos o estatus social, pero sí por grupos étnicos, ingresos
y edades (Eisenberg et al., 1993; Goldman, 2001).

La Organización Mundial de la Salud ha publicado que de las 252 drogas

consideradas como básicas y esenciales que existen, 28 son exclusivamente
originarias de las plantas y un número significativo son drogas sintéticas obtenidas
de precursores naturales (WHO, 2005). En éstos últimos años ha ido creciendo el
interés en las terapias alternativas y del uso terapéutico derivados de plantas (Rates,
2000).

En este entorno, México cuenta con una gran diversidad de plantas por lo que es
común que sean empleadas para tratar ciertas enfermedades, por lo que se han
realizado estudios etnobotánicos para conocer el uso de ellas. Por ello, nuestro
interés en detectar y caracterizar compuestos de origen herbolario que presenten
grupos químicos activos que puedan ser efectivos contra microorganismos
importantes que ocacionan diarrea. Con este enfoque nosotros usamos en este trabajo
las siguientes cepas bacterianas: a) Escherichia coli O157:H7, b) Staphylococcus
aureus, c) Salmonella choleraesuis y d) Shigella flexnieri. Elegimos estas cepas por
ser altamente patógenas (Alanís et al., 2005). Además seleccionamos a los
protozoarios parásitos E. histolytica HM1:IMSS y G. lamblia IMSS:0989, por ser las
cepas que producen mayor rendimiento en los cultivos, porque en ellas se han
detectado y caracterizado varias actividades biológicas y porque son usadas en los
laboratorios de referencia en todo el mundo para realizar estudios contra estos dos
parásitos (Calzada et al., 1998; Meckes, 1999, Alanís et al., 2003). También debido a
que son los más representativos en las estirpes que producen diarrea en el humano
([Link] Además debido a que ya existen cepas que han comenzado a
mostrar resistencia a las drogas que comúnmente se emplean para combatirlas, es de
vital importancia el buscar alternativas y una de ellas es el estudio de las plantas, las
cuales son utilizadas como remedios para enfermedades gastrointestinales (Borst y
Ouellette, 1995).

66
 Para tal propósito montamos el modelo para obtener la CI50 in vitro para los
protozoarios y la CMB para las bacterias. Adaptando a estos resultados el método de
Probit.

Para ello, el desarrollo de nuestro modelo experimental consistió primero en

determinar el inóculo y los días de incubación necesarios para tener a E. histolytica y
G. lamblia en buenas condiciones fisiológicas. Desarrollamos curvas de crecimiento
donde encontramos lo esperado, un tiempo de duplicación para E. histolytica y G.
lamblia de 33.76 h y 10.36 h y con un inóculo de 5,000 amibas/mL y 10,000
giardias/mL respectivamente. También definimos 2 días de incubación para ambos
protozoarios como el tiempo necesario para tener a estos parásitos en fase
logarítmica (fig. 15 y 16).
En segundo lugar, una vez obtenido los parámetros de crecimiento y las
condiciones óptimas de los cultivos para ambos protozoarios (los cuales eran
necesarios para obtener la CI50), analizamos en nuestro modelo los efectos de una
droga cuyos resultados fueran predecibles y que nos sirviera como un testigo positivo
en todas nuestras pruebas donde usamos a estos dos protozoarios. Caracterizamos el
efecto del metronidazol para ambos parásitos. Esta droga es la de excelencia para
eliminar a ambos microorganismos (Sohni et al., 1995., Samarawickrema et al.,
1997., Tona et al., 1998., Uperoft et al., 1999., Meckes et al., 1999). Cuando usamos
concentraciones crecientes de metronidazol en los cultivos de ambos protozoarios,
encontramos lo esperado, que usando concentraciones crecientes (0.05-0.4µg/mL)
del metronidazol, disminuyó el crecimiento tanto de E. histolytica (fig. 17) como G.
lamblia (fig. 18). Con el uso de la prueba estadística de Probit determinamos una
CI50 para E. histolytica de 0.124 µg/mL y para G. lamblia de 0.205 µg/mL; es decir
el metronidazol es 1.65 veces más activo contra las amibas que contra las giardias.
Con esto confirmamos que nuestro método tiene solidez y confiabilidad y se puede
usar para probar cualquier agente que se sospeche que pueda matar a estos parásitos.

Usamos el método de análisis Probit ya que nos permite evaluar la CI50

ajustando los datos de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar
los valores que siguen una distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de
organismos afectados o muertos por la acción tóxica de una sustancia, se transforma
a unidades Probit. Esta transformación permite el ajuste a una línea de regresión, en

67
la cual la concentración perteneciente al Probit 5 corresponderá a la cantidad de
sustancia capaz de generar el efecto estudiado en la mitad de la población.

Además, solamente una de las restricciones es que para el cálculo de la CI50

deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad, la mortalidad en
el control negativo no debe exceder el 10% y la CI50 para el tóxico de referencia
deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos por el control sin
embargo, nosotros no tuvimos ningun problema debido a que nuestros resultados
estaban dentro de los rangos o límites de confianza como se puede apreciar en las
figuras 17 y 18.

Después adaptamos y analizamos en un modelo parecido al anterior (CI50), la

actividad antimicrobiana in vitro que llevamos a cabo mediante la determinación de
las concentraciones mínimas bactericidas (CMB) usando las bacterias: Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis y Shigella flexnieri. Para ello,
usamos dos técnicas para observar inhibición de crecimiento: i) dilución en tubo
(Vanden y col., 1991) y 2) difusión en agar (Murray et al., 2003). La técnica más
eficaz fue la dilución en tubo para nuestros extractos. No tuvimos mucho éxito
cuando usamos la difusión con sensidiscos ya que en las zona de inhibición la
apreciación fue casi imperceptible (1 mm de diámetro) con esta técnica. Esto se
debió probablemente a que el diámetro de la zona de inhibición es influenciado por
el rango de la difusión del agente antimicrobiano a través del agar y estos pueden
variar de acuerdo al tamaño de la molécula de la droga y su hidrosolubilidad en el
medio.
Cuando usamos esta técnica, encontramos que la técnica en dilución en tubo fue
con la que pudimos detectar inhibición sobre el crecimiento de las bacterias.
Una vez adaptado y probado los modelos experimentales (CI50 y CMB),
analizamos la actividad antiprotozoaria y bactericida de los extractos acuosos,
hexánicos, acetónicos y metanólicos de Artemisia ludoviciana, Chenopodium
ambrosioides, Flourensia cernua, Marrubium vulgare, Mentha spicata. A estas
plantas las seleccionamos debido a su importancia en la etnobotánica por ser
utilizadas en casos de diarrea humana (comunicaciones personales y Cortés, 2000;
Ankli et al., 2002, [Link]

68
 Para esta parte del trabajo experimental, se usaron dos criterios para la elección
de los disolventes y la estrategia para la obtención de los extractos de cada planta: 1)
por la polaridad en donde usamos: i) el hexano por ser un disolvente no polar, por lo
que extrae compuestos hidrofóbicos, anillos aromáticos y cadenas alquílicas; ii) la
acetona que es medianamente polar, por lo que extrae metabolitos de este tipo y iii)
el metanol por ser polar y extraer metabolitos hidrofílicos como de grupo hidroxilos
y aminas, mayoritariamente polares y 2) porque esta estrategia ya se ha usado con
gran éxito en la extracción de metabolitos secundarios y obtener los principios
activos en extracto de planta (Touchstone, 1992., Cannell, 1998). Además decidimos
usar el extracto acuoso en forma de infusión debido a que el uso cotidiano de estas
plantas es mediante tes o infusiones para tratar enfermedades gastrointestinales y con
ello nos apegamos lo más posible a como lo usan la gente (Heinrich, 2000 y Ankli et
al., 2002).

En cuanto a las concentraciones usadas de los extractos de cada planta, en el

caso de los extractos acuosos usamos el criterio descrito por Tona et al., en 1998, el
cual consiste en tomar la dosis máxima a probar como lo usa la gente. Para los
extractos hexánicos, acetónicos y metanólicos, nos basamos en el poder de
disolución máxima de cada extracto en 1 mL de etanol con 1.0 g de muestra, ya que
este último disolvente lo usamos como vehículo en todos nuestros ensayos. Estos
criterios los usamos ya que no existe en la literatura un método estandarizado que
nos indique las concentraciones máximas a las que se deben de probar los extractos a
estudiar, generalmente se tienen rangos desde miligramos a nanogramos (Tona et al.,
1998) y la máxima disolución fue el criterio lógico probado en este trabajo.

Una vez probado el modelo para obtener la CI50 con el metronidazol sobre E.
histolytica y G. lamblia pudimos confirmar que las CI50 de todas las plantas en la
presentación de sus extractos acuosos no bajaron a menos de 100 µg/mL como se
puede ver en la tabla 1 para E. histolytica y en la tabla 2 para G. lamblia lo cual nos
indica que el extracto acuoso de estas plantas no presenta actividad significativa
sobre el crecimiento de ambos protozoarios. Este resultado fue adverso a lo esperado
por nuestro grupo, pero son activos cuando son extraídos por disolventes con
polaridad. Por ello, obtuvimos por extracción de cada planta, los extractos con las
diferentes polaridades y los probamos contra ambos protozoarios. Encontramos que

69
la CI50 bajó considerablemente cuando usamos los extractos polares y medianamente
polares, siendo los más bajos: el extracto acetónico del marrubio con 7 µg/mL para
E. histolytica y el metanólico de yerbabuena con 8 µg/mL para G. lamblia (tabla 3).
Estos resultados fueron muy alentadores ya que se demostró que los extractos de
estas plantas obtenidos por extracción de polaridad fueron activos y comprobamos lo
que está descrito en la literatura más reciente (Ríos y Recio, 2005), acerca de que
algunas actividades que se pierden por el calor y otras se preservan en disolventes
polares. Además se pudo observar que los extractos metanólicos de marrubio y
acetónico de hierbabuena fueron muy similares con una CI50 de 12 y 13 µg/mL y el
hexánico y acetónico del epazote con 57 y 58 µg/mL respectivamente para ambos
protozoarios (tabla 3).

Para continuar la caracterización parcial de los extractos de cada planta,

investigamos si estos podrían ser efectivos contra las bacterias E. coli O151:H7, S.
aureus, S. choleraesuis y S. flexnieri. Usamos la determinación de las
concentraciones mínimas bactericidas (CMB) empleando el método de dilución en
tubo y difusión en agar (Vanden et al., 1991 y Murray [Link]., 2003). Para ello,
definimos el inóculo y las condiciones de tiempo de incubación y número de
bacterias por tubo según las propuestas por Murray y Baron, 1999.

Los extractos hexánicos, acetónicos y metanólicos de A. ludoviciana, Ch.

ambrosioides, F. cernua, M. vulgare y M. spicata no mostraron ser activos contra el
crecimiento de Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Shigella
flexnieri y Staphylococcus aureus a la máxima concentración recomendada que es de
900 g/mL. Ya que algunos investigadores consideran inactivos a los extractos con
valores de 1000 g/mL (Ríos y Recio, 2005). Solamente el extracto acuoso de las
plantas Marrubium vulgare y Mentha spicata tuvo efecto sobre S. aureus (tabla 5) a
una concentraciones relativamente alta de 5 y 5.5 mg/mL como CMB
respectivamente, tabla 5.

Posteriormente durante la identificación de los metabolitos secundarios

(Domínguez, 1974), pudimos encontrar indicios de: sesquiterpenlactonas en los
cuatro extractos de A. ludovisiana, F. cernua y M. spicata; en las extractos acetónico
y metanólico de Ch. ambrosioides y en los extractos hexánicos, acetónicos y

70
metanólicos de M. vulgare. Los dobles enlaces se presentaron en todos los extractos
de todas las plantas. Los oxidrilos fenólicos, en los cuatro extractos de F. cernua y
M. spicata; en los extractos hexánicos, acetónicos y metanólicos de Ch.
ambrosioides y M. vulgare y solamente en el extracto acetónico y acuoso de A.
ludovisiana. Los azúcares se manifestaron en los cuatro extractos de F. cernua, en
las extractos hexánico, acetónico y metanólico del M. vulgare, en el acetónico y
metanólico de F. cenua, en los extractos hexánico, metanólico y acuoso de Ch.
ambrosioides y en el metanólico y acuoso de A. ludovisiana y las lactonas en los
cuatro extractos de F. cernua y M. vulgare, en el acetónico metanólico y acuoso de
M. spicata y en los hexánicos, acetónicos y acuosos de A. ludovisiana. (tabla 5).
Algunos extractos presentaron indicios de alcaloides como el acetónico de A.
ludovisiana, el hexánico y acuoso de Ch. ambrosioides y el acuoso de F. cernua. Las
saponinas solamente en los extractos acuosos de Ch. amrosioides, F. cernua y M.
spicata. y solo un extracto, el acuoso de Artemisa ludoviciana presentó triterpenos y
compuestos esteroidales, como lo demostramos en la tabla 5.

Por otro lado, la cromatografía en placa fina es considerada como un

procedimiento simple, rápido y de bajo costo que dá una rápida respuesta de cuántos
componentes están en una mezcla; también es usado para soportar la identidad de un
compuesto en una mezcla cuando el Rf de un compuesto es comparado con el Rf de
un compuesto conocido (Fessenden et al., 2000). De acuerdo a nuestros resultados
seleccionamos el extracto metanólico de la planta de M. vulgare ya que este extracto
fue el que menor CI50 presentó para E. histolytica y G. lamblia (tabla 3). Al separar
en fracciones el extracto metanólico de esta planta por cromatografía en placa fina,
observamos las manchas con luz visible y luz ultravioleta (fig. 19) obtuvimos su Rf y
de las 5 mas gruesas cuyos Rf fueron de 0.94, 0.90, 0.84, 0.25 y 0.17 (fig. 19), se
ajustó las concentraciones de cada fracción entre 111 y 123 µg/mL y al probarlo
contra el % de inhibición sobre E. histolytica y G. lamblia, pudimos observar que
todas las fracciones presentaron menos del 50% de inhibición. La fracción con Rf de
0.25 fué la que mayor % de inhibición (41%) presentó para E. hitolytica, y para G.
lamblia la fracción con Rf de 0.90 con un 40% de inhibición (tabla 7). Las de menor
% de inhibición fueron la de 0.90 para E. histolytica (12%) y para G. lamblia fue la
de 0.17 (7%) tabla 7. Cabe mencionar que en la zona media de la cromatografía
observamos una zona de bandas muy tenues y con poca separación, por lo que no nos

71
fue posible aislar más bandas y por ello, no se probaron sobre el crecimiento de estos
protozoarios. Cabe la posibilidad de que estas bandas podrían contribuír en la
actividad total contra estos protozoarios, o más aun que pudiera darse el caso, en el
que existiera un sinergismo entre todos los compuestos debido a la actividad
citotóxica que mostró el extracto crudo. Pero esta pregunta la podemos discernir
cuando se intente purificar los compuestos activos de esta planta. Por otro lado, los
valores de Rf encontrados en las bandas de las cromatoplacas nos pueden estar
indicando que se trata de dos compuestos diferentes debido a la diferencia del Rf y al
color de las bandas ya que en luz visible, una presenta color verde oscuro y en luz
ultravioleta presenta un color casi negro, mientras que la otra banda presenta un color
verde tenue en luz visible y rosa fosforescente en luz ultravioleta.

En esta investigación decidimos considerar como extractos activos a los

extractos de cada planta que tuvieran ≤ 10 mg/mL para los extractos acuosos y
realizar la cromatografía en placa fina al extracto que fuera ≤ 50 g/mL pero que
mostrara actividad para E. histolytica y G. lamblia.

De acuerdo con los resultados obtenidos, los extractos acuosos de Ch.

ambrosioides, A. ludoviciana y F. cernua fueron los que presentaron una mayor CI50
con 3,274 g/mL, 2,243 g/mL y 1,068 g/mL respectivamente sobre el crecimiento
de E. histolytica mientras que el de Ch. ambrosioides con 3,274 g/mL y A.
ludoviciana con 1,905 g/mL fueron los extractos que tuvieron el menor efecto sobre
el crecimiento de G. lamblia. Sin embargo, los extractos acuosos de M. spicata y M.
vulgare fueron los que presentaron una CI50
n
mas baja, con 357 g/mL y 534
g/mL contra el crecimiento de E. histolytica, por lo que podría decirse que son
considerados interesantes ya que al compararlos con el valor del Ch. ambrosioides
son 9 y 6 veces mas citotóxicos.

De los extractos hexánicos que presentaron una CI50 mayor fueron los del Ch.
ambrosioides con 597 g/mL y M. vulgare con 502 g/mL sobre el crecimiento de
G. lamblia mientras que los valores mas bajos los mostraron los extractos de Ch.
ambrosioides y M. spicata con 57 g/mL y 17 g/mL pero en este caso fue sobre el
crecimiento de E. histolytica. Estos extractos presentan actividad significativa sobre

72
dicho protozoario debido a que están dentro del rango que proponen Ríos y Recio en
el 2005, abajo de 100 g/mL para el extracto crudo, por lo tanto podrían ser
candidatos para realizar fraccionamiento biodirigido buscando compuestos no
polares como es el caso de los compuestos hidrofóbicos, anillos aromáticos y
cadenas alquílicas y observar el efecto sobre E. histolytica (Touchstone, 1992.,
Cannell, 1998).
El extracto acetónico de A. ludoviciana fue el que presentó una CI50 mayor, 496
g/mL, comparada con el de las demás plantas sobre el crecimiento de G. lamblia
mientras que los extractos de Ch. ambrosioides, M vulgare y M. spicata fueron mas
activos contra el crecimiento de E. histolytica a concentraciones de 58 g/mL, 13
g/mL y 7 g/mL respectivamente, así mismo el extracto acetónico de F. cernua,
presentó una CI50 de 42 g/mL sobre G. lamblia. Estos extractos también mostraron
concentraciones por debajo de los 100 g/mL de acuerdo con Ríos y Recio en el
2005 por lo que sería interesante seguir realizando fraccionamientos biodirigidos y
probarlos sobre el crecimiento de los protozoarios. Estos fraccionamientos deberán
ser mediante el uso de solventes medianamente polares debido a la naturaleza del
extracto.

De los extractos metanólicos, los que presentaron una CI50 mas alta fueron los
que actuaron sobre el crecimiento de G. lamblia, siendo el de Ch. ambrosioides con
580 g/mL y el de M. spicata con 380 g/mL, sin embargo, los extractos que
presentaron una CI50 menor sobre el crecimiento de E. histolytica fueron el M.
vulgare con 12 □ g/mL y la M. spicata con 8 g/mL. Estos extractos también
mostraron concentraciones por debajo de los 100 g/mL por lo que sería interesante
seguir realizando fraccionamientos biodirigidos y probarlos sobre el crecimiento de
los protozoarios. Dichos fraccionamientos deberán ser mediante el uso de solventes
polares buscando compuestos hidrofílicos como del grupo hidroxilos y aminas
mayoritariamente polares (Touchstone, 1992., Cannell, 1998).

73
 9. CONCLUSIONES

1) Se determinaron los parámetros de crecimiento y condiciones óptimas de

cultivo para Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, siendo éstos: tiempo de
duplicación 33.76 h y 10.36 h respectivamente; inóculo, 5,000 y 10,000
cél/mL y un período de 48 h para iniciar la fase logarítmica.

2) Se determinó que de acuerdo a su IC50 el extracto hexánico y acetónico de

Chenopodium ambrosioides de 57 y 58 g/mL, el acetónico y metanólico de
Marrubium vulgare de 7 y 12 g/mL y el hexánico acetónico y metanólico de
Mentha spicata de 17, 13 y 8 g/mL respectivamente, fueron los extractos
que presentaron mayor actividad citotóxica contra el crecimiento de
Entamoeba histolytica comparados con el metronidazol.

3) Los extractos acetónicos y metanólicos de Flourensia cernua y Marrubium

vulgare fueron los que presentaron mejor actividad citotóxica contra el
crecimiento de Giardia lamblia comparados con el metronidazol al presentar
una IC50 de 42, 35, 90 y 34 g/mL respectivamente.

4) Los extractos hexánicos acetónicos y metanólicos de todas las plantas no

presentaron efecto citotóxico sobre las bacterias enteropatógenas: [Link], S.
aureus, S, choleraesuis y S. flexnieri.

5) Los extractos acuosos de Flourensia cernua y de Mentha spicata presentaron

efecto citotóxico en una concentración de 5.5mg/mL y 5 mg/mL
respectivamente sobre el crecimiento de S. aureus.

6) Se determinó los grupos funcionales presentes de todos los extractos de cada

planta donde encontramos que A. luviciana mostró tener sesquiterpenlactonas,

74
 dobles enlaces, oxidrilos fenólicos, azúcares y lactonas, solamente el extracto
hexánico presentó alcaloides y el acuoso, triterpenos y compuestos
esteroidales. En Ch. ambrosioides se presentaron dobles enlaces, oxidrilos
fenólicos, azúcares, sesquiterpenlactonas, lactonas en todos los extractos, y
solo los extractos hexánico y acuoso mostraron la presencia de alcaloides y
solo el acuoso mostró la presencia de saponinas. En los 4 extractos de
Flourensia cernua estuvieron presentes las sesquiterpenlactonas, los dobles
enlaces, los oxidrilos fenólicos, los azúcares y las lactonas, solo los extractos
acuosos presentaron saponinas y alcaloides. El Marrubio vulgare presentó
dobles enlaces y lactonas en los cuatro extractos; sesquiterpenlactonas,
oxidrilos fenólicos y azúcares en los extractos hexánico, acetónico y
metanólico; y. La Menha spicata mostró sesquiterpenlactonas, dobles enlaces
y oxidrilos fenólicos en los cuatro extractos; lactonas en los extractos
acteónico, metanólico y acuoso: azúcares en los extractos acetónico y
metanólico; y solamente el extracto acuoso mostró la presencia de saponinas.

7) Se obtuvieron 5 fracciones a partir del extracto metanólico de Marrubium

vulgare en donde la fracción con un Rf de 0.25 presentó un 41% de actividad
contra E. histolytica y la de Rf de 0.90 mostró una actividad del 40% contra
G. lamblia. Las otras bandas no presentaron mayor actividad sobre estos
protozoarios.

8) En las fracciones aisladas con Rf de 0.25 y 0.90 se determinó la presencia de

sesquiterpenlactonas.

75
 10. BIBLIOGRAFÍA

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 PRESPECTIVAS

El efecto que se detectó in vitro en los extractos de la planta M. vulgare, nos

lleva a tomar acciones para purificar el o los compuestos activos contra ambos
protozoarios; ya que una vez aislados se puede determinar con precisión su posible
papel como droga alternativa para combatir a estos protozoarios que puedan tener
resistencia al metronidazol.

Los resultados de esta investigación constituyen un avance en el proceso de

identificación de drogas alternativas provenientes de medicina alternativa. Los
modelos experimentales y la información que obtuvimos de él abren la posibilidad
inmediata de intentar purificar el o los compuestos activos para ver su potencia y
eficacia contra E. histolytica y G. lamblia.

84
 RESUMEN CURRICULAR

Mónica Celina Ramos Guerra

Candidato para el Grado de

Doctor en Ciencias con Especialidad en Microbiología

Tesis: CARACTERIZACION PARCIAL DE LOS EXTRACTOS DE

Artemisia ludoviciana, Chenopodium ambosioides, Flourensia cernua,
Marrubium vulgare, Mentha spicata Y SU DETERMINACIÓN COMO
ACTIVIDAD AMEBICIDA, GIARDICIDA Y BACTERICIDA

Campo de Estudio: Microbiología

Datos Personales: Nacida en Monterrey, Nuevo León el 20 de Abril de 1963, hija de

Juan José de J. Ramos Cantú y Gloria Dalia Guerra Cavazos.

Educación: Egresada de la Universidad Autónoma de Nuevo León con la

Licenciatura de Químico Bacteriólogo Parasitólogo en 1987, obteniendo
posteriormente el grado de Maestría en Ciencias con Especialidad en
Parasitología en 1998.

Experiencia Profesional: Profesional No Docente tiempo Completo.

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