MARCADORES
MOLECULARES
QUE SON LOS MARCADORES
MOLECULARES?
▪Herramientas utilizadas en varios campos de la biología.
▪Se utilizan para localizar y aislar genes de interés.
▪Permiten conocer las proporciones de genes en poblaciones de
manera indirecta.
▪Permiten detectar polimorfismos en loci único o múltiples, de tipo
dominante y codominante.
RECOPILADO POR: DRA. INÉS MALO C.
QUE PAPEL CUMPLEN?
▪Información sobre diversidad
genética es esencial para
estrategias de conservación.
▪Análisis de polimorfismos.
▪Análisis de poblaciones.
▪Conservación de individuos
con caracteres singulares o
únicos.
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CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES
BIOQUÍMICOS MORFOLÓGICOS MOLECULARES
• ISOZIMAS • Características como la • Reflejan diferencias
• Patrones de bandeo forma, tamaño, color. heredables en ADN
• VENTAJAS: requieren • VENTAJAS: disponibles homólogo.
equipos sencillos, de manera rápida, • Debidos a
complementan los requieren equipos reordenamientos,
logros morfológicos de simples, medida directa cambio en pares de
variación. del fenotipo. bases, inserciones y
• DESVENTAJAS: sujetos a • DESVENTAJAS: sujetos a deleciones, variaciones
influencias ambientales, influencias ambientales, en las repeticiones en
limitados en número. limitados en número, tándem.
requieren experticia, • EST
cobertura genómica • SNP
limitada. • DNA microarray
CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES
MODO DE ACCIÓN METODO DE DETECCIÓN
• Codominantes • Hibridación
• Dominantes • PCR
CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES
BASADOS EN
BASADOS EN BASADOS EN MARCADORES
AMPLIFICACIÓN DE
HIBRIDACIÓN DE ADN SECUENCIAMIENTO MIXTOS
ADN
• RFLP • RAPD • EST • AFLP
• VNTR • SSR microsatélites • SNP
• VNTR minisatélites • DNA microarray
• CAPS digestión de
secuencias
polimórficas
amplificadas
RAPDs
▪Polimorfismos de ADN amplificados al azar.
▪Amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una variedad de
especies.
▪Se basan en la probabilidad estadística que se presenten sitios
complementarios a oligonucleótidos de 10 pb a lo largo del genoma.
▪Polimorfismo: cambio en la secuencia de nt en los sitios de
acoplamiento, inserción o deleción.
▪Marcador de tipo dominante.
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RAPDs
▪Estimación de frecuencias indirectas por
equilibrio de Hardy Weinberg.
▪Útiles para construir mapas genéticos y
estructura poblacional.
▪Permite identificar clones, híbridos
somáticos y mutantes.
▪Detección de uniformidad genética.
▪Amplifica regiones codificantes y no
codificantes.
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RAPDs
▪PROBLEMAS PRÁCTICOS:
▪Reproducibilidad.
▪Presencia de artefactos.
▪Comigración de bandas.
▪Malinterpretación de datos.
▪Proveen menos información
de los marcadores
codominantes.
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RAPDs
Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener en cuenta
dos supuestos:
1) cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el
cual el marcador visible, el alelo dominante, está en equilibrio de
Hardy-Weinberg con un alelo recesivo, y,
2) los alelos marcados para diferentes loci no migran a la misma
posición en el gel (Lynch y Milligan, 1994).
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https://www.researchgate.net/publication/26482730_Diversidad_genetica_molecular_de_Mirabilis_expansa_mediante_Rapd
RFLPs
▪SOUTHERN BLOTS E HIBRIDACION
▪Aislamiento del ADN y purificación.
▪Corte con una o mas enzimas de restricción.
▪Separación por geles de agarosa y electroforesis.
▪Transferencia a membranas de nailon o nitrocelulosa.
▪Hibridación con sondas marcadas y detección.
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RFLPs
▪RFLP – PCR
▪Causados por re arreglos del ADN, pérdidas, inserciones, sustituciones.
▪Ganancia o pérdida de sitios de restricción.
▪Detección por diferencia en los pesos moleculares de los fragmentos de ADN.
▪Productos amplificados por PCR y cortados con enzimas de restricción.
▪Separación por electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida.
▪Utilizados para construir mapas genéticos, clonación de genes, resolución de
problemas taxonómicos y filogenéticos.
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RFLPs
▪DESVENTAJAS:
▪Requiere de grandes cantidades de ADN.
▪Requiere ADN de buena calidad.
▪Se realizan muchas manipulaciones.
▪Detecta una fracción de la variabilidad de las secuencias en el
genoma.
▪Información limitada.
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AFLPs
▪Polimorfismo de longitud de los fragmentos amplificados.
▪Combina digestión con enzimas de restricción, una de corte frecuente MseI, y
otra de corte infrecuente EcoRI.
▪Unión de secuencias especificas de 20-30 pb (adaptadores) a los extremos de
los fragmentos de restricción.
▪Amplificación por PCR, utiliza primers marcados basados en secuencias ligadas.
▪Amplificación 1: uso de iniciadores que contienen una base extra en el extremo
3’.
▪Amplificación 2: se consideran iniciadores con dos o tres bases extras.
▪Fragmentos resultantes complementarios al iniciador y a extensiones.
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AFLPs
▪Entre las ventajas que se pueden encontrar en los AFLPs está que no
requieren ninguna información previa de la secuencia para su
análisis.
▪Se producen una gran cantidad de bandas polimórficas; la técnica es
altamente reproducible y existen kits estandarizados.
▪Sin embargo, requiere gran número de pasos para producir
resultados.
▪Esta técnica detecta múltiples loci polimórficos y es útil para generar
huellas genéticas y mapeo.
▪Marcador de tipo dominante.
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MICROSATELITES
▪Secuencias hipervariables, arreglos en tándem de 1-5 pb repetidos
10 a 100 veces.
▪ Los marcadores microsatélites, también denominados Simple
Sequence Length Polymorphism (SSLP), Simple Sequence Repeat
Polymorphism (SSRP), Simple Sequence Repeats (SSR) o
SequenceTagged Microsatellite Sites (STMS) se encuentran
distribuidos por todo el genoma de la mayoría de las especies
eucariotas.
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MICROSATELITES
▪Localizados en secuencias codificantes y no codificantes del ADN.
▪Generan polimorfismos superiores al 90%.
▪Presentes en plantas y animales.
▪Estudios de variación genética intra e interespecífica.
▪Presentes en cloroplastos y mitocondrias.
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MICROSATELITES
▪Se detectan por amplificación PCR.
▪Primers específicos de 20 a 30 pb que hibridan en secuencias
flanqueantes al tándem de repeticiones.
▪Específicos para grupos de especies.
▪Los fragmentos son separados en geles de acrilamida en condiciones
desnaturalizantes.
▪Tinción con nitrato de plata, radiactividad o un fluoróforo.
▪Marcador de tipo codominante.
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(TC)14
ADN
genómico
Microsatélite
......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT......
......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA......
MICROSATELITES
▪Análisis de parámetros demográficos y evolutivos de razas, especies,
análisis de paternidad.
▪Los microsatélites han tomado ventaja sobre otros marcadores
genéticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que:
i) tienen el más alto grado de polimorfismo;
ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes;
iii) la presencia de un solo locus genético por microsatélite hace
que la lectura de las bandas sea clara y fácil de interpretar y
iv) son selectivamente neutros
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OBTENCION DE MICROSATELITES
http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm
Marcadores microsatélite 2. Electroforesis en geles
Etapas de la técnica SSR incluyen: Poliacrilamida o agarosa (casos
muy limitados)
1000 pb
1. Reacción
PCR, con dos 100 pb
iniciadores F1 F2 F3 F4 F5
P1 P2 1 2 3 4 5 6
stop 1 2 3
especificos para
4 5 6
7 8 9
Gene Amp enter 0 ce
IBT
un locus SSR
I I
I
II II
II
Huamani, 2008 III III
III
PCR en P1, 3 y 6 PCR en P2, 2 y 5 PCR en 1 y 4
VNTR
▪Repeticiones en tándem de número variable.
▪También conocidos como minisatélites.
▪Repeticiones de secuencias de 9 a 100 pb, en general menor a 1000.
▪Se pueden detectar por hibridación o por PCR.
▪Marcador de tipo codominante.
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VNTR
▪Detección por hibridación:
▪Se digiere el ADNg con enzimas de restricción que reconocen sitios
adyacentes a la región repetida.
▪Separación de fragmentos por electroforesis.
▪Inmovilización en membrana de nailon y detección por sondas.
▪La longitud del fragmento varía de acuerdo al número de
repeticiones del minisatélite.
▪VNTR regiones hipervariables, RFLP regiones únicas del genoma.
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VNTR
▪Detección por PCR:
▪Se utilizan primers que flanquean los VNTR.
▪Visualización por electroforesis y tinción.
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SNPs
▪Polimorfismo de nucleótido simple.
▪Pueden encontrarse en regiones codificantes y no codificantes.
▪Resultado del cambio de una única base en una secuencia de ADN.
▪Algunos autores consideran SNPs cuando se sustituye una base.
▪Otros autores consideran también la inserción/deleción de una base
(InDel).
▪Pasaron a tener mayor importancia con los procesos de
secuenciación.
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SNPs
▪Poseen naturaleza bialélica y son muy abundantes en el genoma.
▪Son estables desde el punto de vista evolutivo.
▪Tienen una tasa de mutación relativamente baja.
▪Se requiere diseñar primers que amplifiquen secuencias de 400 a
700 pb derivadas de genes de interés.
▪Mediante secuenciación y bioinformática se pueden detectar SNPs.
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SNPs
▪Reacción de minisecuenciación, donde la base polimórfica se
determina por la adición de desoxiribonucleótidos (los nucleótidos
antes de formar la cadena de DNA) complementarios a la base en
cuestión por la DNA polimerasa.
▪Extensión alelo-específica, dónde la DNA polimerasa amplifica sólo
si el primer (comprado en un kit comercial) se une y encaja
perfectamente con la secuencia molde.
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BIBLIOGRAFIA
▪Rentaria Alcantara Miroslava, BREVE REVISION DE LOS
MARCADORES MOLECULARES.
▪Blas Raul, MARCADORES MOLECULARES, Facultad de
Agronomia, La Molina.
▪Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Levitus,
Echenique, Rubinstein, Hopp, Mroginski, Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria INTA, 2010.
RECOPILADO POR: DRA. INÉS MALO C.
