Universidad Autónoma de Chiriquí

Facultad de Medicina
Licenciatura en Doctor en Medicina
“Electroforesis de Proteínas del Suero Humano en Gel de Poliacrilamida
Bajo Condiciones Desnaturalizantes”
Integrantes: Medina, Franklin 4-815-1246; Aguilar, Melanie PE-14-2362
V Semestre, 2019
Master: Roberto Guevara
Resumen
En este experimento se busca llevar a cabo el procedimiento de electroforesis, se indicarán
los materiales necesarios para llevarlo a cabo y parte de su preparación, pero se hará énfasis
en explicar que significa el revelado final de la electroforesis en sí ya que este nos hablará
sobre proteínas que se encuentran presentes en el suero sanguíneo, que en este caso se
utilizará para compararla con el suero de clara de huevo y de la leche; en cuanto a los
resultados, lo primero que observamos es la gran diferencia en cuanto a cantidad de
proteínas se encuentran presentes y aunque se observan algunos errores, unión de dos
columnas la de la lecha y la clara de huevo, el suero de la sangre se obtuvo con un buen
nivel de calidad y allí observamos como fue de esperarse solo proteínas A,F,C y estas se
encontraban de forma cualitativa en valores normales, además de que no se dio la presencia
de proteína S principalmente debido a la baja probabilidad de que un paciente con tipaje
“+A” lo presente.
el año 1937 (García 2000). Raymond y
Weintraub en 1959 emplearon como
Palabras Clave: Electroforesis, Cátodo, soporte para la electroforesis un gel de
Ánodo, campo eléctrico. poliacrilamida (PAGE), posteriormente el
método fue perfeccionado por varios
investigadores como Davis y Ornstein
Objetivos (García 2000). El dodecil sulfato de
 Comprender la utilidad o sodio (SDS) se introduce en esta técnica
situaciones en las cuales es en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes
requerida la realización de una reductores y SDS en la determinación del
electroforesis. peso molecular de proteínas en lo que se
denominó electroforesis en geles de
 Entender que nos dice los “datos”
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
observados en el gel revelado por
(García 2000). El método de
electroforesis.
electroforesis se basa en la migración de
solutos iónicos bajo la influencia de un
Marco teórico campo eléctrico; estas partículas migran
hacia el cátodo o ánodo, dependiendo de
su combinación de cargas, peso molecular
La electroforesis es un método muy y estructura tridimensional (García
analítico, en el que se separan 2000). La velocidad de migración de las
biomoléculas según su carga y bajo la partículas también depende del tamaño y
acción de un campo eléctrico; fue la forma de estas; y del coeficiente de
empleado por primera vez por Tiselius en fricción que presente el soporte en el que
se realiza. El objetivo principal de este hizo que el gel polimerizara rápidamente
experimento, consiste en el desarrollo de así que su aplicación tuvo que ser rápida y
la técnica de electroforesis SDS-PAGE efectiva la ventaja de él es que es soluble
para estimar el peso molecular de en agua y pierde su función como
distintas muestras proteicas y compararlo polimerizador cuando entra en contacto
con los valores que brinda la teoría y con con ella (Gonzales, 1985).
estas comparaciones, concluir cuán
preciso y eficiente es esta técnica para el En nuestra experiencia realizamos un
análisis de proteínas. proceso de electroforesis discontinua, es
decir con 2 geles a diferentes
concentraciones de poliacrilamida, el
primero que es el gel espaciador
(concentración 4%) en cual contenía los
Resultados
pozos donde se colocaban las muestras de
suero, este gel permitía un acomodo de
las cadenas de proteínas desnaturalizadas
para que pasaran al segundo gel, o gel
separador a una concentración de 10% el
cual es el encargado de separar las
moléculas de proteínas de acuerdo a sus
cargas y a su masa molecular.
Después de colocar las capas de vidrio
con el gel discontinuo se realizó la
electroforesis y en los pozos del gel
separador, se colocó en el primero de
ellos azul de bromofenol, un tinte azul
con carga negativa que sería un indicativo
de finalización de la corrida
electroforética, una vez este llegara a la
parte inferior donde se encontraba el polo
negativo, en el resto de los pozos se
colocó las muestras de sueros a las cuales
se les deseaba separar las proteínas, y se
aplicó una tensión eléctrica de 200
voltios, la cual permitió que las proteínas
con cargas negativas migraran hacia el
polo positivo.
Discusión
Con respecto al gel de poliacrilamida,
Existen detergentes iónicos con fuerte este gel es químicamente inerte, de
carácter desnaturalizante; el más propiedades uniformes y reproducibles,
empleado es el dodecilsulfato sódico forma geles transparentes con estabilidad
(SDS). El persulfato de amonio es un mecánica, insolubles en agua y que
agente polimerizador en el laboratorio permiten buena visualización de las
bandas durante tiempo prolongado. La Con respecto a la leche: La fracción de
polimerización se inicia con la formación suero de leche es un derivado filtrado de
de radicales libres del monómero, que se suero. Contiene pequeñas cantidades de
producen por radicales libres de oxígeno, albúmina, transferrina y lactoferrina.
por causa de la acción de iones persulfato Estas proteínas deberían ser visualizadas
(Lehninger, 2001). como bandas de tinción débilmente entre
los marcadores 67.000 y 94.000. La
Las aminas terciarias como el
transferrina se une y transporta el hierro a
tetrametilen-diamina (TEMED) se
los diversos tejidos del plasma sanguíneo
emplean como catalizadores de esta
(Kroschwitz,1994).
reacción, porque causan la formación de
radicales libres del persulfato. Esta En el caso de la sangre se cree que el
reacción es muy inhibida por altos niveles plasma sanguíneo para contener más de
de oxígeno, por lo que la solución debe 100 proteínas diferentes. El perfil
ser desgasificada para lograr una electroforético de las proteínas
formación de gel reproducible por el cual plasmáticas debe revelar bandas que van
se empleó el butanol para eliminar las desde 200.000 a 15.000 daltons. La
burbujas de aire y para evitar el contacto primera banda corresponde a la α2-
de la superficie del gel con el oxígeno macroglobulina, un inhibidor de la
una vez que era vertido entre las capas de proteasa involucrado en la coagulación de
vidrio, para la correcta polimerización la sangre y las cascadas del complemento.
total de la acrilamida a poliacrilamida Otra proteína vista en la electroforesis es
(Laguna, 1960). la transferrina, una proteína de plasma
mayor, que comprende 3% de la proteína
Por otra parte, las proteínas tienen la
total; según Guyton (1997): “la albumina
propiedad de poder migrar o desplazarse,
es la proteína más abundante que se
al presentar una carga eléctrica neta si se
encuentra en el organismo, en el cual
encuentran en un medio con un pH que
representa entre el 58 al 74% (4,3-5,1
difiera al de su punto isoeléctrico.
g/dL) de las proteínas totales” por lo que
Luego de la electroforesis separamos el sabemos que esta región pertenece a la de
gel de las capas de vidrio, y fue colocado albumina, en cuanto a la franja de la
en una solución de metanol al 50% el cual sangre, sin embargo la franja que contó
permitía fijar las proteínas al sitio de gel con más proteínas fue la de la leche. Esta
donde se encontraban a finalizar la técnica es de suma importancia en la
corrida, durante la experiencia al separar medicina para la detección de
el gel de los vidrios. Después de haber enfermedad, un aumento o disminución
fijado las proteínas al gel realizamos el de una de las franjas es indicativo del
lavado con solución etanol al 50% y agua aumento o disminución de una proteína
destilada, el cual destiño todo el gel, con de suero perteneciente a esta franja
excepción de aquellas regiones que (Kroschwitz,1994).
contenían la proteína las cuales
Por último en el huevo, la mayoría de la
permanecían de un color azul. Al finalizar
proteína de clara de huevo se compone de
los procesos de fijación y tinción se
la ovoalbúmina. La proteína consiste en
observaron las franjas:
una cadena polipeptídica única globular 1. Presente las diferencias y
que tiene un peso molecular de 45.000. aplicaciones de la electroforesis
Una de las funciones de la ovoalbúmina vertical y la electroforesis horizontal.
es actuar como una forma de R= La diferencia principal está en el gel
almacenamiento de los aminoácidos para utilizado para realizar las mismas en la
el embrión en desarrollo. La ovoalbúmina horizontal se usa gel de almidón o de
contiene un oligosacárido unido agarosa, mientras que en la vertical se
covalentemente a un residuo de usa casi exclusivamente gel de
asparagina (Kroschwitz,1994). poliacrilamida (más resistente y no se
desliza). En cuanto a su aplicación de
manera general el gel horizontal se usa
para realizar estudios con sustancias que
poseen proteínas de muy alto peso
Conclusión molecular, mientras que la vertical se usa
El papel del butanol en esta técnica para sustancias con proteínas de bajo
fue permitir la alineación del gel y peso molecular, para evitar que a
evitar el contacto con el oxígeno, que proteínas con mayor peso molecular
impide la falta de polimerización de puede afectarlas la gravedad y termine
los geles. alterándose los resultados.
El gel espaciador permitió formar los
pozos y adaptar las proteínas a las 2. Por qué para asegurar la unión
condiciones desnaturalizantes del gel estequiométrica del SDS a las
separador. proteínas es necesario reducir sus
La electroforesis puede verse puentes disulfuro tratándolas con 2-
afectada por la temperatura durante la mercaptoetanol.
polimerización y la corrida del gel, R= El rompimiento de la molécula de
pureza del reactivo, tiempo de corrida SDS por acción del 2-mercaptoetanol
velocidad de la polimerización, permite que esa se una a ala proteínas
niveles de catalizador, y preparación debido a que deja a la molécula de SD
de las muestras. con dos extremos uno el de cadena que
La velocidad de polimerización de es apolar y otro el del sulfato que es
los geles se determinó por la polar y la molécula se vuelve anfipática,
concentración de un catalizador como la carga del sulfato es negativa y la
(persulfato) y de un iniciador de las proteínas la sumatoria de sus
(TEMED). cargas es negativa esta repulsión
Cada proteína migró en función de su desequilibra las uniones de la proteína y
carga sea ánodo (-) o cátodo (+) y su le permite al extremo a polar de la
tamaño. A mayor carga y menor molécula de SDS unirse a la cadena de
tamaño, más velocidad de migración. carbonos del aminoácido.

Cuestionario 3. Discuta la influencia del pH del gel

espaciador sobre la calidad de las
bandas.
R= La elección del pH para PAGE edition , Editorial John Wiley &
depende de dos consideraciones Sons.
opuestas, a pH cercanos al punto 5. Laguna J. (1960) Bioquímica
isoeléctrico de las proteínas a separar, la editorial La prensa medica mexicana,
diferencia de carga entre ellas es grande, (Veracruz, México).
aumentando la posibilidad de separación, 6. Lehninger A (2001), Bioquímica.
sin embargo al ser pequeña la carga, los Las bases moleculares de la
tiempos de corrido son largos llevando a estructura y función celular”. ;
un aumento en el ensanchamiento de segunda edición Ediciones
banda. Si las moléculas tienen un voltaje OmegaS.A (Barcelona, España).
alto es posible que el tiempo de recorrido 7. Lozano J. (1998) Prácticas de
sea mucho más rápido debido a que hay Bioquímica. Experimentación y
una mayor atracción entre los campos Simulación. Editorial Nación
opuestos, sin embargo, una molécula (Madrid, España)
cargada débilmente realiza el recorrido
en un tiempo mucho mayor.

4. La cuantificación de las bandas

suele realizarse densitométricamente.
Consulte en qué consiste el método.
R= Consiste en la determinación de la
densidad de las bandas reveladas de los
recorridos, este método es útil porque es
el que nos brinda toda la información
necesaria para determinar anomalías, si
este fuera el caso de las cadenas
polipeptídicas de la hemoglobina.

Bibliografía
1. García, H.M. 2000. Electroforesis en
geles de poliacrilamida:
fundamentos, actualidad e
importancia, p.1-10. Laboratorios
Beterá, La Habana, Cuba.
2. González, B. (1985) Bioquímica
Clínica, primera edición. Editorial
McGraw Hill (Madrid, España).
3. Guyton, A.; Hall, J. (1997) Tratado
de la Fisiología Medica. Novena
edición, Editorial Mc Graw, (Ciudad
de México, México).
4. Kroschwitz J. (1994) Encyclopedic
of Chemical Technology, cuarta