Los resultados demuestran que según el proceso de producción aplicado a una misma cepa de levadura, tanto

la viabilidad durante la inoculación como las capacidades de multiplicación o vitalidad pueden ser controladas.
La LSA TD2 aparece como el producto más eficiente a nivel de vitalidad y viabilidad en comparación con LSA
TD1. La independencia de Torulaspora delbrueckii 291 con respecto a las carencias de micronutrientes, es
decir
de esteroles debido a la baja turbidez, también es visible.
La viabilidad es importante para llevar a cabo una presión ecológica sobre las levaduras indígenas y permitir la
implantación, pero la capacidad de multiplicación también es fundamental, ya que es durante la fase de
multiplicación
cuando las levaduras sintetizan los principales aromas fermentativos. Además, se ha demostrado que
para contribuir al perfil sensorial de los vinos las levaduras no-Saccharomyces deben alcanzar una población
importante, de alrededor de 106 - 107 células por mililitro (Heard y Fleet, 1986).
Nuestras adaptaciones de los procesos de producción permiten hoy en día producir levaduras no-
Saccharomyces
que responden a las exigencias de viabilidad y vitalidad de forma tan fiable como las levaduras secas activas de
Saccharomyces cerevisiae.

valuación de las necesidades de nitrógeno de la pareja optimizada y utilizada para la

inoculación secuencial.
Se efectuaron fermentaciones en medio sintético carente de nitrógeno asimilable, con el fin de determinar las
necesidades de nitrógeno durante la utilización de los 2 inóculos en inoculación secuencial. De acuerdo con
Julien et al., 2001, la duración de la fermentación en un medio
carente de nitrógeno es “proporcional” a los requerimientos de nitrógeno necesarios para mantener una
velocidad
de fermentación constante en este mismo medio. Se compararon levaduras que se caracterizaban por unos
“requerimientos de nitrógeno bajos”, “medios” y “elevados” con la pareja de levaduras utilizada en la
inoculación
secuencial. Las cinéticas fermentativas nos permitieron clasificar T. delbrueckii 291 dentro del grupo de las
levaduras con elevadas necesidades de nitrógeno.

Nutrición de la pareja de levaduras optimizada para la inoculación secuencial .

Los resultados obtenidos en laboratorio, que muestran las elevadas necesidades de nitrógeno de la pareja de
levaduras
utilizada en inoculación secuencial, han sido confirmados por observaciones efectuadas durante ensayos
a nivel industrial. Por tanto se estudiaron en laboratorio estrategias de nutrición adaptadas que, a continuación,
fueron validadas mediante ensayos en bodega.
En laboratorio, el medio utilizado carecía de factores anaeróbicos (factores de supervivencia), simulaba una
ausencia total de esteroles y lípidos, y los contenidos de nitrógeno asimilable eran de alrededor de 100 mg/l. La
temperatura de fermentación se mantuvo constante a 20 °C y el contenido inicial de azúcares era de 220 g/l.
Se realizaron dos tipos de nutrición:
• Una adición de nutrientes denominados “complejos” para unos contenidos equilibrados de nitrógeno orgánico
e inorgánico. Estos nutrientes contenían también vitaminas y levaduras inactivadas que son fuente de
esteroles y de ácidos grasos insaturados (Fermaid® E).
• Una adición de nutrientes 100% orgánicos, que contenían nitrógeno sólo en forma de aminoácidos
(
Fermaid® O).
Estas 2 estrategias de nutrición se realizaron durante fermentaciones efectuadas con inoculación secuencial de

Conclusión
Nuestras investigaciones han conducido a la puesta a punto de una pareja de levaduras complementarias,
Level2
® TD, que se utiliza en inoculación secuencial. Se trata de una levadura no-Saccharomyces de la especie
Torulaspora delbrueckii 291, combinada con una cepa específica de Saccharomyces cerevisiae. Gracias a las
numerosas mejoras a nivel del proceso de producción, esta levadura seleccionada por Lallemand es inoculada
en el mosto con una nivel de supervivencia de 1010 ufc/mL. A continuación, durante la fermentación
alcohólica
y tras una caída de densidad de 15 puntos, se inocula una levadura Saccharomyces cerevisiae específica por su
complementariedad con la levadura Torulaspora, siguiendo el protocolo de rehidratación de las LSA.
Estos 5 años de investigación a nivel de laboratorio, y de desarrollo en condiciones de bodega, han confirmado
el interés para el enólogo de esta aplicación.
Esta aplicación en inoculación secuencial permite efectuar fermentaciones alcohólicas seguras garantizando el
consumo total de los azúcares. Pero el efecto más evidente de la sinergia de estos dos inóculos sigue siendo la
complejidad y la intensidad aromática. Es esta alternancia de poblaciones de levaduras no-Saccharomyces y
a continuación de levaduras del género Saccharomyces, como se ha observado en numerosos estudios sobre
ecología de las levaduras de los sistemas fermentativos no inoculados, la que contribuye a la intensidad y
complejidad
de los vinos.
Las investigaciones efectuadas a nivel de procesos de producción de levaduras permiten la utilización hoy en
día
de un inóculo no-Saccharomyces en el mosto, con un nivel de supervivencia durante toda la primera fase de la
fermentación superior al normalmente
obtenido con los inóculos Saccharomyces. De esta forma, mediante su utilización secuencial con una levadura
Saccharomyces complementaria, el enólogo puede hoy reproducir, de forma segura y eficaz, la sucesión natural
de predominio de poblaciones de levaduras.

DESCRIPCIÓN
Biomasa estable a base de células de levadura y de bacterias lácticas y procedimiento de preparación.
La invención tiene por objeto una biomasa estable a base de células de levadura y de bacterias lácticas.
Se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de esta biomasa.
Según la invención, se asocian conjuntamente, con un mínimo de materias extrañas y bajo forma seca,
células de
levaduras y de bacterias lácticas para asegurarles una alta supervivencia durante el procedimiento de
fabricación, así
como durante la conservación y la utilización en las aplicaciones alimenticias para las cuales están
destinadas.
Las prácticas tradicionales de adición de microorganismos durante la fabricación de productos
alimenticios han
sido estudiadas a lo largo del tiempo y mejoradas con la aparición de microorganismos seleccionados y
cultivados en
estado puro con el fin de inocular masivamente los preparados alimenticios.
El objetivo es, por lo tanto, producir alimentos con unas cualidades organolépticas y nutritivas constantes.
Estas
prácticas se utilizan principalmente en los sectores de lechería, salazones, vinificación y panificación.
Las levaduras y bacterias son también utilizadas en forma activa (es decir, en forma de células vivas) en
la alimentación
del ganado; las biomasas correspondientes son llamadas probióticas.
El usuario encuentra en la práctica:
- cultivos puros de especies conocidas de bacterias o levaduras; cada cepa seleccionada se cultiva de
forma
intensiva y pura por procedimientos adaptados y optimizados que permiten alcanzar tras la cosecha
concentraciones
celulares muy elevadas por gramo o mililitro de producto, pudiendo llegar a 1010 gérmenes
por gramo para las levaduras y 1012 gérmenes por gramo para las bacterias, o bien
- asociaciones de diferentes géneros o especies cuya composición exacta es indeterminada, surgidas de
propagaciones
tradicionales llamadas “naturales o espontáneas” a partir de alimentos que dan masas fermentadas
con baja concentración de microorganismos, en las cuales el substrato de fermentación es ponderalmente
muy preponderante.
Estos preparados de una sola o de varias cepas son poco estables, ya sea a temperatura ambiente o bien en
frío
a 4ºC. Su conservación es por lo tanto muy corta. Se exceptúan las levaduras de panificación las cuales se
pueden
conservar hasta 2 meses a 4ºC.
Para permitir una conservación superior a un mes de estos preparados constituidos por células vivas de
bacterias
y/o levaduras, se utiliza generalmente el secado a más del 90% de materia seca.
El secado de levaduras de panificación y de levaduras enológicas es una técnica bien conocida. Se cultiva
la cepa en
forma de una biomasa pura, se cosecha la levadura y se mezcla con auxiliares tecnológicos a razón de
algunas unidades
porcentuales de la materia seca utilizada como, en particular, monostearatos de sorbitán, se extrae y seca
por diferentes
procesos: fluidización, secado sobre cinta transportadora en túnel, secado en tambor rotativo. Estos
procesos están
especialmente descritos en manuales básicos como YEAST TECHNOLOGY, REED AND
NAGODAWITHANA,
segunda edición, an AVI book, VAN NOSTRAND REINHOLD. La fluidización es hoy en día la técnica
más utilizada.
De manera general, la atomización es una técnica que da malos resultados para el secado de biomasas
vivas. La
liofilización es una técnica que no conviene para el secado de levaduras.
El secado de bacterias lácticas es igualmente una técnica bien conocida, pero es más delicada. En la
práctica se
realiza siempre por liofilización en presencia de una cantidad importante de agentes de soporte o de
secado, los cuales
juegan un papel crucial. En efecto, el artículo de Lou C. Lievense y otros -INACTIVATION OF
LACTOBACILLUS
PLANTARUM DURING DRYING, Bioseparation I, 161-170, 1990, muestra que la inactivación de las
bacterias
lácticas durante el secado se debe a dos mecanismos: la inactivación térmica y sobre todo la inactivación
debida al
secado en sí.
La elección de la naturaleza y cantidad del soporte que protege a las bacterias lácticas de pérdidas de
actividad
debidas al secado es, por lo tanto, muy importante. Esto se explica, por ejemplo, en la Patente USA
4956295 que
muestra que numerosas sustancias secantes son utilizadas durante el secado y luego en mezcla con las
bacterias lácticas
para estabilizarlas.
El estado de la técnica muestra que las condiciones óptimas para secar las levaduras y las bacterias
lácticas son
muy diferentes. Esto se debe especialmente al hecho ya indicado de que la única técnica utilizada
industrialmente para
el secado de bacterias lácticas es la liofilización, técnica que conduce a altas tasas de inactivación de las
levaduras.
En la práctica, las levaduras y las bacterias se secan siempre separadamente. La única excepción es el
secado de
masas fermentadas cultivadas sobre harinas u otros substratos tras, la inoculación controlada o no de
bacterias y de
levaduras. Estas masas fermentadas tienen generalmente contenidos muy bajos de células revivificables.
de tales masas fermentadas se describe en la patente EP 0 339 750 en la cual se cultiva sobre harina una
inoculación
conocida de cepas de levaduras y de bacterias; luego se deshidrata el cultivo mezclándolo con harina seca,
y acabando
el secado de la mezcla con una corriente de aire caliente.
Según la invención, se asocian bacterias a la levadura con un aporte muy débil de auxiliares tecnológicos,
haciendo
desempeñar a la biomasa de células de levaduras vivas un papel protector de cara a las bacterias durante
la desecación.
La presente invención es interesante para todo tipo de aplicación en el cual se necesiten levaduras y
bacterias
lácticas asociadas. La ventaja que presenta es, por una parte, la obtención de productos homogéneos
compuestos
de partículas secas que asocian levaduras y bacterias y, por otra parte, que no comporta el uso de soporte
extraño
al utilizar estas partículas. La invención soluciona especialmente el problema planteado por la mezcla de
partículas
secas heterogéneas que contienen, por una parte, levaduras y, por otra parte, bacterias lácticas sobre
soporte. Permite
suprimir la utilización de cualquier soporte que diluya de forma significativa la biomasa de células vivas.
La biomasa conforme a la invención comprende, en forma de pequeñas partículas sustancialmente
regulares e
idénticas con un contenido de materia seca superior al 92%, preferentemente del 93%, por un lado al
menos 1.109
células revivificables de bacterias lácticas, preferentemente al menos 3.109 y mejor todavía al menos
1.1010 células
revivificables de bacterias lácticas por gramo y, por el otro lado, al menos 5.109, preferentemente al
menos 1.1010
células revivificables de levaduras por gramo, conteniendo tales partículas secas menos del 5%,
preferentemente menos
del 3%, de soporte extraño compuesto por auxiliares tecnológicos clásicos que protegen las células vivas
durante el
secado.
Esta biomasa estará compuesta:
- por una parte, por una o varias cepas de bacterias lácticas, es decir, bacterias que pertenecen
preferentemente
a los géneros Lactobacillus o Streptococcus o Leuconostoc y preferentemente a las especies Lactobacillus
brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus San
Francisco, Streptococcus faecium, Leuconostoc oenos,
- y, por otra parte, por una o varias cepas de levaduras que pertenecen preferentemente a la familia de las
Saccharomycetaceae, preferentemente al género Saccharomyces y más preferentemente todavía a la
especie
Saccharomyces cerevisiae, siendo preferente para su utilización en panificación una variedad que no
fermente la maltosa, como la Saccharomyces cerevisiae chevalieri.
La biomasa que asocia cepas de levaduras y de bacterias, tras su cultivo industrial y recogida, en forma de
pequeñas
partículas secas sustancialmente regulares e idénticas con forma de gránulos o esférulas, con al menos un
92% de
materia seca que contenga al menos un 95% de biomasa celular (células de levadura y de bacterias sobre
materia seca
total) podrá ser preparada según la invención por uno de los dos procedimientos siguientes, que utilizan la
levadura
como agente protector de bacterias lácticas durante la desecación.
Así, conforme a la invención,
- se mezcla en una amasadora una crema de bacterias con levadura prensada que contiene un porcentaje
de
materia seca comprendido entre el 30% y el 33%,
- se añaden si fuera necesario a esta mezcla pastosa auxiliares tecnológicos que protejan la biomasa
durante
el secado como, por ejemplo, el monoestearato de sorbitán asociado o no con carboximetilcelulosa o con
cualquier emulsificante o espesante que tenga las mismas propiedades,
- se extrae la biomasa en elementos filares de diámetro inferior a 3 mm y preferentemente inferior a 1
mm,
- se secan los elementos filares en una corriente de aire caliente como, por ejemplo, secado por
fluidización
hasta llegar al menos a un 92% de materia seca y preferentemente al menos a un 93% de materia seca.
Igualmente, según la invención, se procede de la siguiente manera:
- se seca separadamente la levadura para obtener finos gránulos de diámetro inferior a 1 mm,
preferentemente
con al menos un 95% de materia seca en presencia de auxiliares tecnológicos de secado utilizados en la
producción de levaduras secas instantáneas como, por ejemplo, el monoestearato de sorbitán,
- se pulveriza sobre dichos gránulos de levadura en movimiento en un mezclador o en fluidización una
crema
de bacterias lácticas con al menos 14% de materia seca que contenga si es necesario auxiliares
tecnológicos
que la protejan durante el secado como, por ejemplo, el glicerol o cualquier otro producto con un efecto
protector equivalente,
- eventualmente se efectúa un secado complementario en una corriente de aire caliente como secado por
fluidización, de forma que los gránulos lleguen a tener un 92% de materia seca y preferentemente al
menos
un 93% de materia seca.
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ES 2 239 315 T3
El primer procedimiento anteriormente mencionado según la invención, permite obtener gránulos o
esférulas seco,
homogéneos. Permite especialmente obtener gránulos o esférulas lisos y no porosos que proporcionan
probióticos con
propiedades nuevas gracias a técnicas de secado como el secado en lecho fluido con gran altura de capa o
el secado en
secadero rotativo o tambor.
El segundo procedimiento anteriormente mencionado según la invención que proporciona gránulos
sustancialmente
idénticos constituidos por células de levaduras recubiertas en su periferia por células de bacterias lácticas
es
preferible para la obtención de fermentos para pan o para vino.
La invención se podrá entender todavía mejor con la ayuda de los ejemplos siguientes no limitativos y
relativos a
modos de realización ventajosa; permite obtener productos muy concentrados en levaduras y bacterias
vivas con una
carga protectora extraña muy reducida, que presentan una larga conservación, superior a 3 meses a 20ºC y
a 6 meses
a menos de 10ºC, preferentemente 12 meses a menos de 10ºC (aproximadamente 4ºC).
Ejemplo 1
Procedimiento de fabricación de un fermento para panificación
Las cepas trabajadas son:
- por un lado una levadura: Saccharomyces cerevisiae de la variedad chevalieri NCYC 935,
- por otro lado dos bacterias aisladas de masas fermentadas naturales de panificación francesa de trigo:
Lactobacillus casei
Lactobacillus brevis.
Etapa 1
Propagación de las cepas
Las cepas de levadura y bacterias son cultivadas y producidas en cantidades importantes paralelamente en
equipos
diferentes según los siguientes procedimientos:
1. La levadura se produce según los métodos habituales de propagación de levaduras de panificación bien
conocidos y que están descritos en YEAST TECHNOLOGY, segunda edición, REED AND
NAGODAWITHANA,
AVI BOOK (ISBN 0-442-51892-8) 1991. Normalmente el mosto de fermentación es separado
de la crema de levadura y filtrado para la obtención de un producto pastoso con 33% aproximadamente de
materia seca que será almacenado a 4ºC a la espera de la siguiente etapa 2.
2. Las dos cepas de bacterias son propagadas separadamente en fermentadores según los procedimientos
clásicos bien conocidos utilizando un medio del tipo MRS para los precultivos y los cultivos finales,
como
los descritos en “BERGEY’S Manual of systematic bacteriology - volumen 2”, SNEATH, P.H.A.; MAIR,
N.S.; SHARPE, M.E. y HOLT, J.G. (Eds.), WILLIAMS AND WILKINS (Publ.), 1986, Baltimore. Al
final
de la fermentación se obtienen concentraciones celulares aproximadamente de 1010 cfu/ml (cfu = número
de células viables por unidad, en este caso por ml); luego se centrifuga cada mosto para conseguir dos
cremas de bacterias que tengan las siguientes características:
Materia seca cfu*/ml cfu*/g materia seca
Lactobacillus casei 20% 1,5.1011 7,5.1011
Lactobacillus brevis 26% 5,5.1011 2,1.1012
* : cfu = colonies forming unit = número de colonias que forman unidad = número de células
revivificables.
Las dos cremas se conservan en frío a 4ºC a la espera de la siguiente etapa 2:
Etapa 2
Cosecha conjunta de levaduras y bacterias
Las dos cremas de bacterias obtenidas en la etapa (1) son añadidas a la levadura obtenida de la misma
etapa con
las siguientes proporciones ponderales:
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA

11 Número de publicación: 2 239 315

51 Int. Cl.7:C12N
1/04
A21D 8/04
A23K 1/00
C12G 1/022
12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86 Número de solicitud europea: 94401741 .7
86 Fecha de presentación: 28.07.1994
87 Número de publicación de la solicitud: 0636692
87 Fecha de publicación de la solicitud: 01.02.1995
54 Título: Biomasa estable a base de células de levadura y de bacterias lácticas y procedimiento de preparación.
30 Prioridad: 29.07.1993 FR 93 09373
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.09.2005
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
16.09.2005
73 Titular
Inmovilización de enzimas.
Fundamentos, métodos y aplicaciones
Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications
DR. MIGUEL ARROYO
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid
Tfno: 34-1-3944150 Fax: 34-1-3944672 e-mail: [email protected]

INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus
aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y
farmacéutica.
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que
presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
Presentan una gran actividad catalítica;
Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad);
Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos
químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones
de
trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es
difícil,
y por tanto, no se pueden reutilizar.
Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes,
permitiendo
que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una
región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad
catalítica yque pueden ser reutilizadas repetidamente (1). Posteriormente esta definición se ha
ampliado a aquel
proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento
de
enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (2).
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (3):
1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la
aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen
en la Figura 1. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas
pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son (4):
1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones
de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

En general, los métodos de inmovilización (5) se suelen clasificar en dos grandes categorías: 1)
Retención física (Figura 2) y 2) Unión química (Figura 3).
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN FÍSICA
III.1. Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida
porosa
constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo
poliacrilamida,
colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a
cabo
mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la
polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El
atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el
primer
caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima
se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de
gran
sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener
derivados
activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De
todas
formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así
como
la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la
proteína.

Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:

1) Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas
semipermeables
que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no
permanentes
(generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas
son de
forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 m de diámetro. Mediante este método
se
pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas,
permitiendo
que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos (6).
2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas
atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas
permeables
al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima.
Mediante
una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor.
En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre la
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA
IV.1. Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor
información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento
posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por
el
sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles
contaminaciones
microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de
operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser
reutilizado. Se
han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de
numerosas
enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque
generalmente nos
los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas.
Los
soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
1. Soportes inórganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que
pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales
manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso,
alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
2. Soportes órganicos. Se pueden clasificar en:
Polímeros naturales: a su vez divididos en:
polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina,
chitosan, etc).
proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Polímeros sintéticos: divididos en:
Poliolefinas (como el poliestireno)
Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión covalente (Figura)

ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN

Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos
enzimas,
se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas en todos los casos.
No
obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se pueden hacer
generalizaciones
sobre cada método de inmovilización (Tabla 2) y así, podremos seleccionar el más adecuado
para cada
aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la reacción
biocatalizada,
el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros
factores

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores

más
estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la
adsorción,
donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que
presentan
pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más
conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones
establecidas
por el Working Party on Immobilized Biocatalysts (16):

APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:
1. Aplicaciones analíticas: biosensores
2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento
de residuos.
Obtención y uso de
las enzimas en la
industria
Dra. Ana Blandino Garrido
Actualización en conocimientos de Biología
Molecular y
Biotecnología

3.1 Enzima amilasa: Acción y clasificación

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando
como productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por
unidades de glucosa1 Esta familia de enzimas hidrolíticas esta compuesta por a
proteínas catalíticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se
encuentran ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol
muy importante en la degradación del almidón en la germinación de las

1
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food
Enginnering. P 950
semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en diversas
especies de microorganismos como hongos y bacterias 2.
3.2 Usos y aplicación de las enzimas

Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos

casos, a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves
condiciones de trabajo). Además, lograr más material procesado con el mismo
equipo y menos consumo de energía también ahorra costos. Al utilizar enzimas
en la industria alimentaria nos ofrece la ventaja de:
 Reducir viscosidad (hidrólisis).
 Mejorar extracciones (degradación de pectina).
 Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).
 Causar separaciones (separación del suero en queso).
 Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos.
 Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos subproductos
indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento
de producto.
 Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto único
(jarabe de alta concentración de fructosa).3

Las enzimas amilasas por su capacidad hidrolítica han tenido gran significancia
en las últimas décadas en diversas industrias que han visto una mejor manera
de optimizar sus procesos aplicando técnicas biotecnológica extensivas
basadas en enzimas. Industrias como la panadería, repostería, alimentaria,
textilera, cervecera, papel, azucarera entre muchas más han visto en estas
proteínas una gran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un
25% en el mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de
hidrolisis química en la industria del almidón. Esto se debe a una característica
esencial dentro de esta familia de proteínas. La termoestabilidad de esta

2
TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha,
Arvind. apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary
structureby homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623.
3
MUNDO ALIMENTARIO. Aplicación de las enzimas en la producción industrial. Consultado en:
http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de
febrero de 2008]
enzima, industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad
en diversos procesos.4

3.1 Procesos industriales que aplican enzimas5

3.1.1 Industria del almidón y del azúcar. Dependiendo de las enzimas

utilizadas, a partir del almidón se pueden obtener jarabes de diferente
composición y propiedades físicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de
alimentos tales como gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas,
alimentos para bebés, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas básicas en
la conversión enzimática del almidón: licuefacción, sacarificación e
isomerización.

Productos Lácteos. La aplicación de enzimas en el procesamiento de leche

está bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la producción de
queso, que tal vez representa el empleo más antiguo de enzimas en alimentos.
Otras enzimas que participan en la producción de quesos son las lipasas
presentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso,
proporcionando cambios característicos en el sabor. Para algunos quesos se
pueden aumentar las lipasas naturales, añadiendo enzima extra. Por otra parte,
también se recomienda agregar enzimas exógenas de tipo proteolítico para
acelerar el proceso de maduración de algunos quesos.
3.3 Producción y sustrato

Fuentes de enzimas. Las células microbianas son la fuente usual de enzimas

para uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales y
plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papaína, ficina y
bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina,
empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayoría de los enzimas
microbianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos,
incluyendo una docena de hongos, pero se ha calculado que sólo
aproximadamente el 2 ^o de los microorganismos existentes en el mundo han
sido estudiados como fuente de enzimas6.
4
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food
Enginnering. P 950.
5
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista
de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13
6
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985.
p.281
Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasa
pancreática y tripsina) debido a que éstas pueden ser reemplazadas por otras
similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos
microbianos, aunque catalíticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en
sus propiedades que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicación. Los
recientes avances en este campo han permitido la adaptación de las técnicas
del ADN recombinante para posibilitar que ciertos genes de mamíferos sean
clonados en las bacterias o levaduras idóneas, facilitando así la producción de
enzimas originariamente de animales por medio de la tecnología convencional
de la fermentación.

Las plantas también han sido fuente tradicional de un cierto número de

enzimas. A partir del látex producido por la papaya, higuera, piña y, en menor
grado, otras especies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas
plantas tienen la ventaja de que su látex es fácil de obtener, principalmente a
partir de los frutos y utilizando mano de obra no cualificada.

Las enzimas microbianas son más útiles que los derivados de las plantas o
animales por la gran variedad de actividades catalíticas de que disponen, y por-
que usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de
forma regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de
superficie o usualmente mediante técnicas de fermentación aeróbica de
cultivos profundos, técnica muy utilizada en la producción de antibióticos.
Además los enzimas microbianos son en general más estables que los
homólogos de las plantas o animales, y su proceso de producción es más fácil
y seguro que el seguido con plantas y animales. La manipulación genética y
ambiental para incrementar el rendimiento, o la actividad enzimática de las
células haciendo a éste de interés constitutivo 7. Estas técnicas son
especialmente importantes en el caso de la actividad o estabilidad del enzima
que sea la etapa limitante en conversiones multienzimas, cuando haya que
eliminar los controles de regulación normales en la síntesis de la enzima

7
GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1990.
p.16.
deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibición por el substrato o el
producto, mecanismo este último para prevenir la sobreproducción del producto
de una vía metabólica, o para obtener algunas otras características favorables8.

Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formación del enzima y

la concentración de enzima en las células o en el caldo de fermentación para
minimizar los costos de producción de la enzima. El ideal es combinar de forma
óptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recupera-
ción y fermentación y el equipo más apropiado en buenas condiciones de
trabajo. Usualmente, las células crecen sumergidas, en fermentadores bien
agitados y aireados, aunque un número significativo de enzimas importantes
industrialmente se obtienen en fermentadores sólidos o semisólidos, entre los
que se incluyen la lactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la
pectinasa, una proteasa de A. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de
Mucor pusiüus9.

Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas

para usos clínicos e industriales, y acumulan productos de desecho en las
vacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimáticos y/o
toxinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos
desechos, muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la célula,
contaminando y frecuentemente inactivando cualquier enzima extraído.

Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro

de ellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las
más comunes para las síntesis del almidón produciendo productos de bajo
peso molécula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por
gran diversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del
suelo así como bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces
entre otras.

8
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. p.281
9
WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985.
p.282
El principal genero que esta siendo tratado para la producción de dicha enzima
es el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este
genero son el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus
amyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para
alimentos, textiles, fermentación, papelería entre otros 10.

También otros géneros han sido reportados en proyectos de investigación. La

especie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares
entre las cuales además de estar las amilasas se puede identificar las
proteasas. Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de
enzimas11.

La inducción de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces

alfa-1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón. La Glucosa, así
como es el producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la
síntesis de enzima como un mecanismo conocido como represión catabolitica.
Sin embargo, se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos
sustratos que tienen como fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la
producción de amilasas12. Este hecho contrasta con los registrados en artículos
de investigación y compañías dedicadas a la producción de enzimas donde la
fuente de producción de las proteínas son microorganismos.

La producción industrial ha desarrollado técnicas de aprovechamiento de

recursos o residuos de producción de diversas industrias con el objeto de
adquirir enzimas utilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos
agrícolas. En años recientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y
la aplicación eficiente del bagazo de caña de azúcar como medio de

10
ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex
organic substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150.

11
SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production
by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005.
Journal of Food Engineering. p 94.

12
NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics of
Aspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.5
producción. Este es un subproducto agroindustrial de extensa cadenas
celulósicas. Esta es una importante fuente de

5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismos

Los microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la

intemperie a contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días.
Para ello se realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se
dispondrán en bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén
ejerciendo un proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con
10% de harina de yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al
cabo del cual se realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar
el o los microorganismos con mayor capacidad de degradación, y se
sembraran en medio solido de YPS, para su purificación e identificación.

5.2.1 Medio Sólido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) . 13. De acuerdo
con distintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán
cada uno de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri
esterilizadas sobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para
descartar contaminación ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua
destilada estéril sobre medio el mismo cultivo.

5.2.2 Cuantificación de Biomasa del complejo 14. Se hará determinación por

el método de peso seco y el método de proteínas.

 Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5

días. Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa
a 105 grados.
13
ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of
Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of
Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.
14
KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and b-galactosidase by
Bacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152
  Determinación de proteínas15. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas.
El proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado
de las muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante
obtenido se le determinara proteínas totales por el método de Biuret.
Las muestras se leerán a una longitud de onda de 550 nm. Los datos
obtenidos se compararan con una curva patrón de BSA, para
determinar la concentración de proteínas presentes en la muestra.

5.2.3 Medición de producto16. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3

horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5
acido dinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm
para maltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa
y maltosa respectivamente.

5.2.4 Medición de sustrato17. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentación

cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se
realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los
datos se compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca para
determinar la concentración presente de sustrato en la muestra.

5.2.5 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones de

proteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o
BSA de Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 %
y se diluirán como se muestra en la Tabla 3.

A las solución de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrán

en agua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hasta

15
SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-
amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007. p. 998
16
ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis
strain for starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de 2006. p.951

17
CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates.
Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989.
completar 10 ml según la tabla, las lecturas se realizaran a λ = 520 nm para
maltosa y a 540 nm para glucosa

El complejo enzimáticos obtenido en cada muestra en los diferentes días, se

leerán a la misma longitud de onda que las curvas de calibración. Para ello se
realizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas,
glucosas y proteínas.

La base del estudio, análisis, desarrollo y aplicación de este proyecto es

producir un complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de
determinar la aplicabilidad de dichas proteínas en los procesos agroindustriales
del departamento. Este complejo servirá como base para la planeación de
muchos procedimientos industriales como la hidrólisis del almidón, el cual
presenta elevados costos en las empresas del departamento de Córdoba,
especialmente plantas de biocarburantes.
1. Estrategias con el medio

A través de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o

externas, es un medio apto para la promulgación del objeto, método, resultados
y alcance del estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar
el propósito de llevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de
los efectos que traería consigo aplicarlo en escala industrial

EFECTO GLUCOSA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y LA

ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA DE Pseudoalteromonas sp.
Natalia Couoh, Ruth López. Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales,
Universidad Autónoma de
Campeche. Patricio Trueba de Regil sn CP 24090, [email protected]
Palabras clave: efecto glucosa, bacteria marina
Introducción. Los metabolitos secundarios están definidos
como sustancias que no son esenciales para el crecimiento
de los microorganismos que los producen. En la
actualidad, las bacterias marinas proveen una ilimitada
fuente de moléculas activas biológicamente y algunos de
esos compuestos bioactivos son usados en la clínica. La
glucosa, usualmente una excelente fuente de carbono para
crecimiento, interfiere con la síntesis de muchos
metabolitos secundarios (1). El efecto inhibitorio de
glucosa sobre la síntesis de enzimas catabólicas es
conocido como efecto glucosa (2). El objetivo de este
trabajo fue determinar el efecto de la glucosa sobre la
actividad antimicrobiana de Pseudoalteromonas sp
Resultados y discusión. La figura 1, muestra el
comportamiento de la producción de biomasa en medio
YPG o MMG. En medio YPG-C/N cte o YPG-C/N var., al
aumentar la concentración de glucosa aumenta la de
biomasa; sin embargo, después de 100 mM el incremento
es drástico en YPG-C/N cte. Sugiriendo que la
concentración de nitrógeno orgánico mayor a 9 g/L, es la
causante de este efecto.
En la figura 2, se observa la actividad antimicrobiana de la
cepa marina contra Staphylococcus aureus resistente. El
comportamiento en medio YPG-C/N var y MMG es
semejante: concentraciones de 25 a 50 mM de glucosa
estimulan la actividad antimicrobiana entre 21-50%, en
concentraciones mayores de glucosa, hay un decaimiento
gradual de entre 28.5% y 35.3%. En el medio YPG-C/N
cte., a 25 mM de glucosa se observa el 10% de
estimulación de la actividad antimicrobiana, y de 25 a 100
mM cae paulatinamente hasta un 25%. Concentraciones
mayores de glucosa, producen un abatimiento total de la
actividad. Indicando que, la fuente de nitrógeno tiene
mayor influencia que la glucosa sobre la actividad del
metabolito secundario. Esto se puede comprobar al
observar el medio modificado YPG sin glucosa
(conteniendo la mitad de la concentración inicial de la
fuente de nitrógeno) donde la actividad antimicrobiana es
máxima.

Conclusiones. La glucosa es activadora e inhibidora del

metabolito secundario a concentración menor de 100 mM.
La glucosa es estimuladora de la producción de biomasa.
Sin embargo, la fuente de nitrógeno regula de manera más
significativa la síntesis del metabolito activo y tiene una
influencia fuerte sobre la producción de biomasa a
concentración mayor de 9 g/L.
Bibliografía.

ucción de biomasa y enzimas

ligninolíticas por Pleurotus ostreatus
en cultivo sumergido
Gricelda K. Guillén-Navarro1, Facundo J. Márquez-Rocha2 y
José E. Sanchez-Vázquez1
El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Departamento de Biotecnología Ambiental, Tapachula,
1

Chiapas y 2Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE),

Departamento de Acuicultura, Ensenada, Baja California, México
Se analizó la producción de biomasa y enzimas ligninolíticas de Pleurotus ostreatus
en medio sintético con extracto de levadura a diferentes concentraciones de
glucosa (0,5-20 g/l), diferentes pH (3,5-6,5) y temperaturas de incubación
(23-32C). Las mejores condiciones de cultivo fueron: concentración de glucosa
inicial de 5 g/l, pH inicial entre 5,5-6,5 y una temperatura de incubación entre
26-29C. La constante de saturación para glucosa (Ks) fue de 1,75 g/l. Se alcanzó
una concentración de biomasa de 8,6 g/l al suministrar 20 g/l de glucosa al
medio de cultivo. El control del pH permitió obtener un incremento de 0,5 g/l en
la concentración de biomasa. En el biorreactor se produjeron pellets con una distribución
homogénea de tamaño de 3,4 ± 0,2 mm de diámetro. Se obtuvieron
aproximadamente 307 U/l de enzima lacasa y 0,41 U/l de manganeso peroxidasa
en medio líquido extracelular y 0,015 U/g de lacasa y 0,809 U/g de manganeso
peroxidasa en sustrato sólido. No se detectó actividad de la enzima lignina
peroxidasa en ninguna de las dos condiciones.
Pleurotus ostreatus, Cultivo sumergido, Producción de biomasa, Producción de
enzimas
Production of biomass and ligninolytic enzymes by
Pleurotus ostreatus in submerged culture
The production of biomass and ligninolytic enzymes by Pleurotus ostreatuswas
analysed in synthetic medium with yeast extract and different glucose concentrations
(0.5 - 20 g/l), at different pH (3.5-6.5) and incubation temperatures
(23-32C). The best culture condition were: initial glucose concentration of 5 g/l,
initial pH between 5.5-6.5 and incubation temperature between 26-29C. The
saturation constant for glucose (Ks) was 1.75 g/l. The biomass concentration reached
8.6 g/l with a glucose addition of 20.0 g/l to the culture medium. The control
of pH allowed an increment of 0.5 g/l of biomass concentration. The bioreactor
produced pellets with a homogeneuous distribution of diameter size of 3.4 ± 0.2
mm. Approximately, 307 U/l of laccase and 0.41 U/l of manganese peroxidase
were obtained in extracellular liquid medium and 0.015 U/g of laccase and 0.809
U/g of manganese peroxidase were obtained in solid substrate. Lignin peroxidase
activity was not detected at any condition.
Pleurotus ostreatus, Submerged culture, Biomass production, Enzyme production
Resumen
Palabras clave
Summary
Key words
En México y particularmente en Chiapas el cultivo
de Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. Se visualiza
como una alternativa para la solución, al menos parcial,
de problemas como la insuficiencia alimenticia y la contaminación
por desechos orgánicos de origen agroindustrial
[1,2]. El cultivo en medio sólido es el método usual de
preparación de inoculo para este hongo y consiste en propagar
el micelio en granos de cereales como Triticum aestivum
o Sorghum vulgare [3]. Dicho inóculo llamado
primario o semilla es el que se mantiene en las mejores
condiciones para su conservación, se resiembra de nuevo
con el fin de producir un inoculo secundario sobre granos
de cereal en mayor cantidad, para después inocularlo en el
Dirección para correspondencia:
Dr. Facundo J. Márquez Rocha
CICESE, PO BOX 434844, San Diego,
CA 92143, USA
Tel: (Mexico) +52 61 745050 ext 24458;
Fax: +52 61 750572; E-mail: [email protected]
Aceptado para publicación el 17 de octubre de 1998
Nota
Producción de biomasa y enzimas por Pleurotus ostreatus
Guillén-Navarro GK et al. 303
sustrato de producción. Este proceso presenta algunos
problemas como: un tiempo relativamente largo hasta la
producción del inóculo secundario (32-34 días), contaminación
frecuente por la manipulación del sustrato [4],
inseguridad en la disponibilidad del grano a lo largo del
año y dificultades en el control del proceso [5].
Una alternativa para evitar los problemas antes
mencionados es la obtención del inoculo en cultivo líquido,
ya que permite producir mayor cantidad de biomasa
de mejor calidad en menor tiempo, favorece la dispersión
y adaptación del hongo y facilita su manipulación durante
la siembra en el sustrato final. Esto a su vez, disminuye el
tiempo de fructificación y mantiene la capacidad productiva,
además de ciertas propiedades genéticas fisiológicas
y morfológicas de la cepa [6]. Algunas cepas de
Pleurotus, uno de los cinco hongos comestibles más
importantes en el mundo han sido cultivados en líquido de
una manera más rápida y controlada que en fermentación
sólida [7]. El cultivo de P. ostreatus en sistema sumergido
ha sido utilizado en la degradación de compuestos orgánicos
como los hidrocarburos policíclico aromáticos [8,9]
aunque, poco se conoce de sus características de crecimiento
bajo estas condiciones. Otras especies del género
Pleurotus, como Pleurotus pulmonarius han sido utilizados
para la producción de arómas en este tipo de cultivos
[10].
El cultivo sumergido de los hongos de pudrición
blanca como P. ostreatus permite producir al mismo tiempo
enzimas ligninolíticas importantes. Este tipo de organismos
degradan lignina más extensa y rápidamente que
otros grupos de organismos conocidos [11]. P. ostreatus
es capaz de metabolizar y mineralizar hidrocarburos policíclicos
aromáticos [12,13] y colorantes artificiales causantes
de contaminación ambiental en industrias textiles
[14], entre otros. Esta actividad parece estar relacionada a
la producción de enzimas como la manganeso peroxidasa
[EC 1.11.1.7], enzimas que utilizan peróxido y la lacasa
[EC 1.10.3.2], que es una polifenol oxidasa capaz de oxidar
polifenoles, fenoles sustituidos y diaminas [9].
Al variar las condiciones de cultivo se puede mejorar
el rendimiento, optimizar la calidad y reducir costes
del proceso de fermentación [15]. Por otro lado, parece
ser que la producción de enzimas y el crecimiento del
hongo están relacionados [16], debido a esto se realizó el
presente estudio para optimizar la técnica de producción
de inoculo en el cultivo de P. ostreatus y al mismo tiempo
evaluar la producción de algunas enzimas en su crecimiento.
MATERIALES Y MÉTODOS