Prctica 8 Cintica enzimtica: Efecto de la concentracin de sustrato sobre una enzima

Objetivos: demostrar mediante la realizacin de una reaccin enzimtica clsica, el efecto que tiene la concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin. Adems, comprobar que la reaccin enzimtica a realizar concuerda con los postulados de Michaelis y Menten. Para ello, el estudiante deber comprender y determinar valores de Km y Vmax. Integrar los conceptos de cintica enzimtica con el metabolismo, en particular el metabolismo de los carbohidratos.

Fundamento
Las enzimas son molculas orgnicas capaces de catalizar reacciones bioqumicas mediante la disminucin de la energa de activacin que se requiere para que la reaccin se lleve a cabo. Sin las enzimas, los procesos metablicos que se llevan a cabo dentro de las clulas tardaran mucho tiempo y por lo tanto los perodos de respuesta de adaptacin al medio extracelular seran muy largos y tal vez incluso incompatibles con la vida. Muchas enzimas obedecen la teora de la cintica enzimtica propuesta en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten. En ella se establece que durante una reaccin catalizada por una enzima, sta reacciona reversiblemente con el sustrato para formar un complejo enzimasustrato. Posteriormente este complejo participa en una reaccin como reactante para dar origen a un producto y a la enzima libre y activa, lista para participar en una nueva reaccin. Uno de los factores ms importantes que afecta la velocidad de una reaccin enzimtica es precisamente la concentracin de sustrato. Sin embargo, estudiar este efecto en el laboratorio se torna difcil dado que la concentracin de sustrato vara durante el curso de la reaccin. Un mtodo que simplifica la realizacin de experimentos de cintica es medir la velocidad inicial o V0 donde la concentracin de sustrato es mucho mayor que la concentracin de la enzima. Bajo estas condiciones, cambios en la concentracin del sustrato son nfimos y por lo tanto se considera que la concentracin de sustrato se mantiene constante con respecto a la enzima. Cuando la concentracin de enzima se mantiene constante, el efecto que tiene una concentracin variable de sustrato (controlada por el experimentador) sobre V0 se ilustra en la figura 1.

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Figura 1. Grfico que demuestra el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad inicial de una reaccin enzimtica. Vmax: velocidad mxima, Km: concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la Vmax. A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad de la reaccin aumenta en forma proporcional a la concentracin de sustrato, obtenindose una relacin de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones ms altas de sustrato, la relacin proporcional no se cumple ya que al aumentar la concentracin de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente. Es entonces cuando la velocidad de reaccin alcanza un valor mximo Vmax, en el cual aunque se aumente la concentracin de sustrato, la velocidad de la reaccin no vara. En la prctica del da de hoy, observaremos este efecto en la reaccin de la glucosa oxidasa y la glucosa. El principio de esta reaccin fue revisado en la prctica 2. La glucosa oxidasa reconoce especficamente a una de las formas anomricas de la D-glucosa, la forma beta glucopiranosa. Esta enzima, en presencia de glucosa, oxgeno y un amortiguador de pH, genera gluconolactona y perxido de hidrgeno.

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El perxido de hidrgeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la cual en presencia de fenol y una amina aromtica (en nuestro caso, la amino-4antipirina) genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando el reactivo vira de incoloro a rosado, se demuestra la presencia de glucosa en la muestra. La cantidad de color medido a 492nm es proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra.

Materiales y reactivos
Sustrato: soluciones de glucosa a diferentes concentraciones Enzima: glucosa oxidasa 1 gradilla con 8 tubos de ensayo pequeos 9 pipetas de 1ml Agua destilada Pera para las pipetas HCl concentrado Pipeta Pasteur Guantes Anteojos de seguridad Micropipeta 200ul con sus respectivos tips 2 placas de microttulo

Procedimiento
Preparar la siguiente serie de tubos:

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Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8

Solucin glucosa (ml) 0 0.1 soln 1 mM 0.1 soln 2.5 mM 0.1 soln 5.0 mM 0.1 soln 10 mM 0.1 soln 25 mM 0.1 soln 50 mM
0.1 soln 100 mM

Agua (ml) 0.1 0 0 0 0 0 0 0

Reactivo glucosa oxidasa (ml) 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9

Volumen final (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1

Concentracin final glucosa (es necesario calcularla)

Agitar, incubar 30 min a temperatura ambiente. Al finalizar la incubacin, el instructor agregar 3 gotas de HCl concentrado. Agitar levemente. Pasar 200ul de cada reaccin a una placa de microttulo y medir la absorbancia a 492 nm.

Resultados
Elabore un cuadro que contenga la siguiente informacin: nmero de tubo, concentracin final de glucosa en cada tubo y absorbancia obtenida para cada reaccin. Con estos datos, elabore un grfico donde la concentracin final de glucosa en cada tubo est representada en las abscisas y la absorbancia en las ordenadas. Calcule segn su mtodo de preferencia (por ejemplo, recta de mejor ajuste) los valores de 1/V y 1/S. A partir de estos valores calcule segn el mtodo de su preferencia (por ejemplo el mtodo de Lineweaver-Burk), el valor de Vmax y Km. Recuerde: restar el valor del blanco reactivo a los valores obtenidos si el aparato usado no lo hace automticamente. Adems, no olvide mostrar todos los clculos realizados y rotular debidamente el grfico a presentar.

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Cuadro 1. Valores de absorbancia obtenidos para las reacciones de glucosa oxidasa en presencia de diferentes concentraciones de glucosa Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Por ltimo, describa brevemente en qu proceso o paso metablico participa la enzima glucosa oxidasa. Absorbancia obtenida Absorbancia luego de restar el blanco reactivo Concentracin final de glucosa

Bibliografa
-Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioqumica. Bioqumica y Biologa Molecular. Objetivos del curso y manual de prcticas de laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, Mxico, 2000. -ELITECH Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versin 12/2002 - Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman and Company, NY. Quinta edicin, 2008.

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