PRACTICAS INMUNOLOGIA I

NORMAS DEL LABORATORIO

Se enlistan a continuación las normas que habrán de seguirse en el laboratorio de

inmunología, con la finalidad de asegurar la integridad física de los estudiantes, así como para
mantener una organización adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes:

Las normas serán leídas íntegramente en la primera sesión de trabajo.

 El estudiante deberá presentarse al laboratorio habiendo consultado la práctica
correspondiente: leer, realizar las actividades o ejercicios previos y recordar la metodología a
seguir de acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es necesario aclararlas
antes de iniciar la práctica.
 Los estudiantes deberán permanecer fuera del laboratorio hasta la llegada del profesor.
 La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitirá el
acceso al laboratorio.
 Entrar al laboratorio con la bata blanca, larga y limpia; puesta y abotonada.
 El estudiante que tenga el cabello largo deberá mantenerlo recogido para evitar accidentes.
 Colocar todo los artículos personales en sitios destinados para ello..
 Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón desinfectante.
 Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así como introducir
algún objeto en la boca.
 Está prohibido pipetear con la boca cualquier sustancia. Se recomienda que el estudiante use
propipeta.
 Las heridas abiertas, cortadas, rasguños y abrasiones deben estar cubiertos con materiales a
prueba de agua.
 Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla.
 Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de
suspensiones, reactivos, muestras biológicas entre otros).
 Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio indicado por el
profesor. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho
no contaminado deberá depositarse en los contenedores correspondientes.
 La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada.
 El estudiante con más del 25% de inasistencia no podrá reponer prácticas
 PRACTICA N°1
OBTENCION DE MUESTRAS SANGUINEAS Y DILUCIONES SERIADAS.

OBJETIVO
Establecer y uniformar es el procedimiento de obtención de muestras sanguíneas con un
adecuado control de calidad, ya que de ello depende que el resultado del análisis de la muestra
sea el correcto. Se efectuara en ayunas o no.
La obtención correcta de la muestra es la primera condición para efectuar un examen de alta
calidad. No existe analista clínico ni tecnología analítica capaz de dar un buen resultado partiendo
de una mala práctica.
En principio, es imprescindible solicitar al paciente su nombre para verificar si coincide con el
del volante de solicitud su trae y comprobar si esta enlas condiciones de preparación indicadas. A
la vez se tratara de relajarlo explicándole brevemente la toma de muestra que se le va a realizar, si
tiene algún riesgo y cuando van a estar los exámenes solicitados. Además, debe asignarse un
número de entrada al laboratorio.
La colocación del paciente puede ser: tumbado sentado; pero en ambos casos de manera
confortable y con el brazo completamente extendido en línea recta desde el hombro hasta la
muñeca.
Tipo de muestra: sangre.
La sangre es el fluido corporal más utilizado en el laboratorio con fines analíticos. Para su
obtención son tres los procedimientos utilizados: punción cutánea, venosa y arterial. Las
características de la sangre varían según el tipo de punción, principalmente en su contenido en
oxígeno, glucosa, pH y hematocrito.

SANGRE VENOSA.
PROCEDIMEINTO N°1: OBTENCION DE SANGRE VENOSA CON JERINGA.
Es la obtención de una muestra de sangre, mediante una punción venosa periférica central
para realizar el posterior análisis en el laboratorio clínico
MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS.
 Algodón.
 Alcohol al 70%.
 Torniquete.
 Jeringas de 3, 5, 10, y 12mL.
 Tubos para la recolección de la muestra, con o sin anticoagulante.

OBTENCION DE LA MUESTRA.

 Verificar que los elementos por utilizar estén listos, y que el paciente se sienta cómodo.
 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexión del codo o a
10cm de codo sujetar con un medio nudo.
 Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado en un área de 2 pulgadas.
  El paciente deberá cerrar y abrir la mano durante unos segundos y después la mantendrá
cerrada, esto ayudara a visualizar las venas superficiales.
 Se retira el estuche protector de la aguja y se toma la aguja de tal manera que el bisel quede
hacia arriba.
 Se coloca la aguja en dirección paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la agua
1 o 0,5cm en el tejido subcutáneo, luego se perfora la vena.
 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.
 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puño. Se coloca seco encima de
la punción y se retira la aguja.
 Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes del tubo.

PUNTOS PARA LA EXTRACCION

SANGUINEA

OBTECION DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIO

MATERIALES REQUERIDOS:

 Algodón.
 Alcohol al 70%.
 Ligadura o torniquete de 25 a 30cm de largo.
 Agujas con dispositivos para extracción de sangre al vacío: N°21 para adultos, N°22
para niños y neonatos.

OBTENCION DE LA MUESTRA
 Repetir los primeros pasos [Link] retira el estuche protector de la aguja y este se
enrosca al dispositivo para extracción de sangre al vacío.
 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexión del codo o 10cm por encima de este
y pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las
venas.
  Una vez escogida la vena, desinfectarla con una pieza de algodón con alcohol al 70%.
 Se coloca la aguja en dirección paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la agua
1 o 0,5cm en el tejido subcutáneo, se inserta el tubo al vacío por la parte posterior y no
preocuparse por la cantidad de sangre extraída ya que el mismo sonido del vacío avisará que la
extracción terminó.
 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.
 Colocar un pedazo de algodón seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Sacar
la aguja con un movimiento rápido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante.
 Pedir al paciente que presione firmemente el algodón durante 3min, con el brazo extendido.

PROCEDIMIENTO N°2: DISTRIBUCION DE LAS MUESTRAS.

 Muestras para hematología: tubos con anticoagulante EDTA, añadir 3-4mL de sangre.
 Muestras para Química sanguínea: tubos sin anticoagulante, añadir 12mL y dejar
retraer el coagulo durante 10min a temperatura caliente.
 Muestras para inmunología y serología: tubos sin anticoagulante, añadir 12mL y dejar
retraer el coagulo durante 10min a temperatura caliente.

PROCEDIMIENTO N°3: SEPARACION DEL SUERO SANGUINEO.
Dependiendo del material utilizado, el coagulo debe desprenderse asépticamente de las
paredes del tubo, con ayuda de un palillo de madera, centrifugar a 3000rpm durante 5min. Pasar el
suero libre de hematíes a otro tubo, ayudados con una pipeta Pasteur.
En suero humano la composición normal es:
Albúmina------- 54-62%.
α-globulinas----9-15%.
Β-globulinas----8-13%.
ϒ-globulinas---14-19%.
PROCEDIMIENTO N°4: MICROPIPETAS AUTOMATICAS.
Nos sirven para medir con exactitud y reproductibilidad volúmenes cuyo orden es el de los
microlitros (10 L).

Para tomar estas cantidades se emplean las micropipetas, ya sean de volúmenes fijo o
variable. Los errores de una medida que se pueden cometer dependen en gran medida del usuario
y no de la micropipeta en sí.
Para que las medidas sean correctas se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones
generales:
 La pipeta debe mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo,
nunca inclinada. También cuando la pipeta no se utilice se debe dejar de forma vertical en un
soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga
el líquido succionado.
 Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente
un único volumen. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un
rango de valores determinado. En estas no se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a
los que se recomienda para cada pipeta.
 Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200u L se usan puntillas amarillas, y las
micropipetas que toman volúmenes superiores a 200uL hasta 1mL usan puntillas azules. Las
pipetas que toman volúmenes por encima de 1mL y algunos que toman volúmenes de 0,5 y 1uL,
pueden usar otro tipo de puntas específicas.
 La pipeta se agarra como un puñal.
 Existen otros modos de pipeteo que se utilizan para soluciones muy viscosas o cuando se
tenga que pipetear repetidamente una solución.
 Tanto la presión como la liberación del embolo de la pipeta se debe realizar lentamente y con
suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la pipeta
que alterarían las medidas.
 También se pueden formar burbujas si la punta no está bien ajustada a la pipeta. La solución
es ajustarla mejor.

Todas las pipetas tienen dos topes:

1. Presión hasta el primer tope para tomar el volumen calibrado.
2. Presión hasta el segundo tope para expulsar el volumen tomado.

PROTOCOLO A SEGUIR PARA MEDIR CORRECTAMENTE UN VOLUMENES CON UNA

MICROPIPETA:
Las etapas pueden ser las siguientes:
 Se selecciona la pipeta adecuada para medir el volumen de manera que este dentro del rango
especificado para la pipeta.
 Se fija el volumen deseado en la pipeta mediante el giro del émbolo.
 Se coloca una punta desechable en el vástago de la pipeta. Se asegura que este bien sujeta
ejerciendo un ligero movimiento de torsión.
 Se presiona suavemente el embolo con el pulgar hasta el primer tope.
 Se introduce la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3mm de la superficie del
líquido manteniendo la pipeta en posición vertical.
  Se succiona el líquido, relajando suavemente la presión del dedo pulgar sobre el embolo sin
permitir que el embolo suba por sí solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en
el líquido.
 Se retira la punta de la muestra.
 Se introduce la punta de la pipeta en el tubo adecuado, colocando la punta contra la pared del
tubo. Sin sumergirla en la solución.
 Se aprieta el embolo lentamente hasta el primer tope.
 Se espera un par de segundos y se aprieta el embolo hasta el segundo tope para eliminar el
posible líquido que quede en la punta.
 Con el embolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la pipeta, deslizando la punta
a lo largo de la pared del tubo.
 Se relaja la presión del pulgar para que el émbolo vuelva a la posición normal.
 Se elimina la punta por la presion del expulsor de puntas o tirando de ella para evitar
contaminaciones

PROCEDIMIENTO N°5: DILUCIONES SERIADAS EN SUERO.

1. Enumere siete tubos y colóquelos en la gradilla.

2. Pipetee la cantidad de solución salina fisiológica requerida en cada uno de los tubos.
3. Añada la cantidad de suero necesaria y mezcle. Pase del tubo n°1 a la n°2 la cantidad
establecida con anterioridad, y así sucesivamente hasta el último tubo, de donde se descartara la
misma cantidad.

Cuando se pasa de una dilución baja a una dilución alta es muy importante limpiar el extremo
de la puntilla o pipeta, ya que, la más pequeña cantidad de dilución de suero que se adultere puede
alterar la dilución.

ACTIVIDADES A REALIZAR EN LASECCION DE PRACTICA

1. Obtención de suero sanguíneo.
2. Pipetee 0,1mL de solución salina fisiológica y 100 microlitros de suero en el tubo n°1.
3. Calcule el título de la dilución realizada en la actividad n°2.
4. Realice las siguientes diluciones 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, a partir de la dilución
del tubo n°1.
5. Ejercicio: se tienen 0,2cc de suero se añaden al tubo n°1 cuyo contenido es de 0,4mL
de SSF. De allí se toman 300 uL y se llevan al tubo n°2 que contiene 600 lambdas de SSF. Diga el
título de dilución de ambos tubos.
6. En el laboratorio de inmunología se tienen 3 micropipetas automáticas de volumen fijo:
10, 20, y 100uL. Se requiere medir 240microlitros de suero y 50 lambdas de SSF, explique el
procedimiento adecuado a seguir.
 PRACTICA N°2
SUSPENSIÓN AL 2% DE GLOBULOS ROJOS.

UTILIDAD: los hematíes son usados en muchas de las reacciones Antígeno-Anticuerpo

(reacción Ag-Ac), tales como: Aglutinación, hemolisis, poblaciones linfocitarias, etc.

Aglutinación: la suspensión es empleada para las pruebas de coombs directo e indirecto, con
la finalidad de evitar el efecto prozona (exceso de Ac)y el efecto postzona (exceso Ag). El
objetivo de estas pruebas es determinar la existencia de glóbulos rojosrecubiertos con
inmunoglobulinas y/o complemento in vivo, en particular igG y C3d (coombs directo) y determinar la
presencia de anticuerpo irregulares en el suero receptor (coombs indirecto).

Hemolisis por complemento: los hematíes de los adultos y los cordones de grupo A lavados y
resuspendidos al 2% en solución salina, fueron clasificados en A1 y variantes débiles de A de
acuerdo a su reacción con la lectinade Dolichus biforus (lectina obtenida de las semillas de esta
planta, tiene especificidad cuando se diluye el extracto convenientemente, en caso contrario, es
capaz de actuar también, sobre los glóbulos A2 que no reacciona con los últimos). El titulo
promedio de aglutinación fue 32 para hematíes A1 y 2 para variantes débiles A o hematíes de
cordón. Demostrando la utilidad de esta suspensión para mantener igual proporción de antígeno y
anticuerpo durante la hemolisis por complemento, para diferenciar entre hematíes A1 y variantes
débiles del grupo A empleando un anticuerpo monoclonal.

Poblaciones linfocitarias: las inmunoglobulinas son fácilmente demostrables en la superficie

de los linfocitos B, pero no de los T, usando técnicas de inmunofluorescencia y reactivos tales
como sueros anticadenas ligeras de inmunoglobulinas, marcados con fluorescina. Una gran
proporción de células B llevan igG e igM en la superficie, pero uan parte se tiñen con antisueros
dirigidos cintra la parte Fc de otras clases de inmunoglobulina, parte de las células T se tiñen para
inmunoglobulinas. La inmunoglobulina no es producto procedente de las células T, si no que es
absorbida del exterior y probablemente representa complejos inmunes, que se unen a los
receptores para la región Fc de la inmunoglobulina que poseen algunas células T. Estos receptores
s e demuestran por la formación de rosetas con eritrocitos recubiertas con anticuerpo igG; un
racimo de eritrocitos rodea al linfocito, al cual se unen mediante el fragmento Fc de la IgG, que les
recubre. En las células T humanas pueden ser inducidas a formar las llamadas rosetas
espontaneas con simples eritrocitos de carnero.
 SUSPENSIÓN DE GLOBULOS ROJOS: PROCEDIMIENTO

1. Filtrar sangre completa (aprox 2mL) a través de una gasa simple dentro de un tubo
cónico de centrifuga graduado. Llevar el tubo con SSF hasta la marca de 10ml. Centrifugar a 1800
rpm por 10min.
2. Descartar el líquido sobrenadante y la delgada capa superior de células blancas, por
aspiración con una pipeta Pasteur.
3. Resuspender los eritrocitos en 10 volúmenes de solución salina, mezclando pro
inversión varias veces cuidadosamente, centrifugar nuevamente.
4. Repetir el paso anterior 3 veces.
5. Después de las 3 lavadas el líquido sobrenadante deberá ser incoloro, si el color
persiste es indicativo de que las células son demasiado frágiles y no podrán ser usadas.
6. Después de la última centrifugación y antes de resuspender, lea y anote el volumen del
sedimento de las células (botón de hematíes).
7. Descarte todo el sobrenadante sin mover el botón de hematíes.

SUSPENSIÓN DE GLOBULOS ROJOS: CALCULO

El volumen de solución salina necesario para obtener la concentración de glóbulos rojos

deseada (2%) puede ser calculada por medio de lasiguiente formula:

Vol. Total= x100

Ejemplo: preparar una suspensión de glóbulos rojos al 2% si el volumen de células obtenido es

de 0,4cc.

Vol. Total= x100=20

Volumen total – volumen total células obtenidos= Solución salina que debe ser agregada.
20 - 0,4 = 19,6

La solución salina debe ser medida y agregada en el tubo cónico con el botón de hematíes,
mezclando por inversión cada vez. Se vacía el contenido del tubo en un vaso de precipitado sin
dejas de agitar hasta el final del procedimiento.
La suspensión de glóbulos rojos debe mezclarse bien antes de usarse, si no se utiliza de
inmediato esta suspensión debe guardarse a 4°C.
 SUSPENSIÓN DE GLOBULOS ROJOS: AJUSTE AL 2%

1. Disponer de cuatro tubos de 12X75 mm.

2. Agregue a 3 de ellos: 1,7mL de agua destilada.
0,3mL de la suspensión de glóbulos rojos.
Mezcle cuidadosamente por inversión.
3. Al cuarto tuve agregue 2mL de agua destilada que nos sirve como blanco para llevar al
0% de absorbancia.
4. Leer los tres tubos a 550nm.
5. Si las lecturas no están entre el rango adecuado de A (0,450 y 0,505), ajuste a la
suspensión de glóbulos rojos mediante la siguiente relación:

V2=

V1-V2= ml de solución salina que agregara o descartara a la suspensión para obtener una
concentración al 2%.
6. Repita el reajuste a los globales rojos hasta obtener la observancia deseada.
 PRACTICA N°3
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Estas reacciones constituyen lavase de cierto número de pruebas de laboratorio utilizadas para
descubrir e identificar antígenos o anticuerpos y complejos inmunológicos circulantes. En esta
reacción el antígeno es particulado, no soluble; en este caso los anticuerpos específicos se
combinan con el determinante antigénico sobre la superficie de una partícula o célula, produciendo
un conglomerado de células o partículas, denominado aglutinación.
Para llevar a cabo cualquier reacción de aglutinación a un volumen constante de antisuero
diluido seriadamente, se le agrega una cantidad constante de una suspensión de partículas que
tienen determinantes antigénicos intrínsecos o extrínsecos, se mezclan los reactantes y después
de un periodo de tiempo se observa la reacción. Esta técnica puede realizarse en tubo o lamina y el
título está dado por la dilución más alta que presenta aglutinación.

Clasificación de las reacciones de aglutinación:

A. Aglutinación directa: la aglutinación que comprende determinantes antigénicos que
son constituyentes intrínsecos de la partícula.

B. Aglutinación indirecta: la aglutinación que involucra determinantes antigénicos que

no son constituyentes intrínsecos de la partícula y que necesitan de un acoplador para unirse a
ella.

DETERMINACION DE PROTEINA C REACTIVA

Fundamento: el suero diluido del paciente que contiene PCR, se hace reaccionar con anti-
PCR mono específico adsorbido sobre partículas de látex, su unión produce una aglutinación
visible macroscópicamente.
La proteína C reactiva es una proteína termolábil, no atraviesa la barrera placentaria y su
movilidad electroforética se encuentra entre la zona de las L Y B globulinas. Su nombre se debe a
la capacidad de precipitar los polisacáridos C de los pneumococcos. Es una de las proteínas de
fase aguda y se incrementa en el suero en una gran variedad de enfermedades inflamatorias o
como respuesta a necrosis tisular.
La PCR se encuentra comúnmente aumentada en artritis reumatoide activa, infecciones virales,
tuberculosis, fiebre reumática, infarto agudo al miocardio, infecciones por organismo gram
negativos y gram positivos. También se puede hallar después de una operación quirúrgica y luego
de trasfusiones sanguíneas.
 La determinación de PCR no solo indica la intensidad de la enfermedad si no la respuesta del
paciente a un tratamiento dado.
Técnica:
Materiales:
 Reactivo de látex, recubierto con anti-PCR monoespecífico.
 Control negativo.
 Control positivo.
 Solución de buffer glicina, ph 6,2.
 Placas de vidrio de fondo oscuro.
 Pipetas Pasteur.
 Goteros.
 Palillos de madera.
 Cronómetro.

Equipos:
 Agitador de Manzini.

PROCEDIMIENTO:
1. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparar diluciones 1:20 de cada una de las muestras con el buffer.
3. Colocar en cada círculo de la placa 1 gota de control: positivo, negativo, muestras
diluidas.
4. Agregar a cada una de ellasuna gota delreactivo látex previamente mezclado.
5. Mezclar con un palillo diferente cada uno de los círculos.
6. Llevar las láminas al rotador de Manzini por 3min a 180rpm.
7. Realizar la lectura: NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA.
POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA.

La PCR es una reacción Antígeno-Anticuerpo que se observamejor cuandolos anticuerpos y los

antígenos están en concentraciones óptimas. Losniveles encontrados enel suero pueden presentar
variaciones grandes entre pacientes, o de un dio para otro en el mismo paciente cuando el
contenido de antígeno en el suero es muy grande pueden ocurrir reacciones falsas negativas, con
sueros sin diluir por el efecto prozona. Los sueros verdaderamente negativos no aglutinan en
ninguna dilución de la prueba.
Para observar el aumento o descenso de los niveles de PCR a todo suero positivo deber
practicársele la reacción cuantitativa.
PRUEBA CUANTITATIVA:
 Seguir realizando diluciones de los sueros a partir de la 1:20, hasta 1:80.
 Coloque una gota de cada dilución en los círculos de la lámina.
 Agregue una gota de reactivo de látex a cada uno de ellos.
 Mezcle con un solo pasillo comenzando desde la última dilución hasta la primera.
 Lleve la lámina al agitador de Manzini por 3min.
 Realizar la lectura.
 DETERMINACION DE FACTOR REUMATOIDE

INTRODUCCION
La prueba en lámina para efectuar el factor reumatoide, es usada como criterio diagnóstico de
artritis reumatoide. La artritis reumatoide es un síndrome crónico de etiología desconocida,
caracterizado por una inflamación inespecífica y generalmente simétrica de las articulaciones, que
a veces evoluciona hacia la destrucción de las estructuras articulares y periarticulares.
En la articulación enferma se observa un engrosamiento de la membrana sinonvial con
formación de pliegues y proliferación de linfocitos. Estas células que forman folículos linfoides son
las responsables de la síntesis de factores reumatoideos y otras inmunoglobulinas.
Fundamento: el factor reumatoide de tipo inmunoglobulina M (anticuerpo), se detecta en
presencia de gamma-globulina o fracción II de Cohn (antígeno) adsorbida sobre un soporte inerte
de látex poliestireno produciendo una aglutinación visible macroscópicamente.

Técnica:
Materiales:
 Antígeno de látex-globulina.
 Control negativo.
 Control positivo.
 Solución de buffer glicina, ph 6,2.
 Placas de vidrio de fondo oscuro.
 Pipetas Pasteur.
 Goteros.
 Palillos de madera.

Equipos:
 Agitador de Manzini.
PROCEDIMIENTO:
1. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparar diluciones 1:20 de cada una de las muestras con el buffer.
3. Colocar en cada círculo de la placa 1 gota de control: positivo, negativo, muestras
diluidas.
4. Agregar a cada una de ellas una gota del reactivo látex-globulina previamente mezclado.
5. Mezclar con un palillo diferente cada uno de los círculos.
6. Llevar las láminas al rotador de Manzini por 3min a 180rpm.
7. Realizar la lectura:
NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA.
POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA.
 Prueba cuantitativa en tubo:
Se practica en sueros que presenten una reacción positiva en lámina.
 A partir de la dilución preparada 1:20, realice diluciones hasta 1:80.
 Coloque 1 gota de las diluciones en los círculos de la lámina.
 Agregue una gota del reactivo de látex-globulina.
 Mezcle con un palillo comenzando desde la última dilución hasta la primera.
 Lleve al rotador de Manzini por 3min.
 Realice la lectura.

Para diagnóstico de AR la prueba se considera positiva cuando se observa aglutinación de

1:80 en adelante.
REACCION DE AGLUTINACION INDIRECTA EN PLACA:

POSITIVO= SUSPENSION HETEROGENEA (POZOS 1 Y 2)

NEGATIVO= SUSPENSION HOMOGENEA (POZO 3)
 PRACTICA N°4
REACCION SEROLÓGICA DE FLOCULACION EN LÁMINA. VDRL
La reacción de VDRL (veneral disease research laboratory), detecta la presencia de reagina
sifilítica por medio de una reacción entre la reagina y un antígeno estandarizado.
La reagina sifilítica es capaz de producir en la dispersión de las partículas de cardiolipina de lo
cual resulta una floculación visible al microscopio.
El antígeno es una solución alcohólica que contiene 0,02% de cardiolipina, 0,9% de colesterol y
suficiente lecitina. Cada lote debe ser estandarizado y probados con sueros conocidos. Un
antígeno que contenga precipitado deberá ser descartado.
La solución buffer es cloruro de sodio al 1% y viene ya preparada con el antígeno. El suero
debe ser claro, libre de hemolisis células o partículas extrañas e inactivado a 56 ° C por 10min.
Actualmente se está utilizando la prueba de VDRL modificado, donde el antígeno ya está
preparado con el antígeno de acuerdo a las indicaciones de las OMS y consta de una suspensión
acuosa de cardiolipina y lecitina purificada en buffer fosfato con cloruro de colina y EDTA con el
cual no hay que inactivar el suero.
MATERIALES:
 Laminas excavadas de vidrio.
 Pipetas de 1mL graduadas en centésimas.
 Pipetas de 5mL graduadas en décimas.
 Micropipetas de 10 a 100uL.
 Agitador magnético.
 Baño de María a 56°C.
 Antígeno de VDRL.
 Controles positivos y negativos.
PROCEDIMIENTO:
A. PREPARACION DEL ANTIGENO
1. En un frasco de fondo plano con tapón, depositar 0,4mL de solución salina buffer.
2. Con una pipeta de 1mL añada 05mL de antígeno haciendo girar a la vez suavemente el
frasco sobre la superficie plana, el antígeno debe añadirse gota a gota pero rápidamente.
3. Continuar rotando el frasco por 30 seg más.
4. Añadir 4,1mL de solución salina buffer, con pipeta de 5mL.
5. Tape el frasco y rótelo 30 veces, la emulsión de antígeno queda lista y podrá usarse
durante un día. Esta solución puede preservarse con solución de ácido benzoico al 1%.

B. PRUEBA CUALITATIVA EN SUERO:

1. Colocar 50 lambdas de suero problema en una de las excavaciones de la lámina.
2. Colocar 50 lambas de control positivo y negativo.
3. Añadir 25 uL del antígeno previamente mezclado.
4. Llevar al rotador a 180rpm por 4min.
5. Realizar lectura.
 Lectura:
Se hace en el microscopio con objetivo de 10X.
Reactivo: si existen grumos medianos o grandes.
Débilmente Reactivo: grumos pequeños.
No reactivo: sin grumos.
Pueden existir reacciones zonales que en algunos casos aparecen como débilmente reactivo
por lo tanto en estos sueros se deben hacer diluciones para descartar errores.
C. PRUEBA CUANTITATIVA EN SUERO:

A todo suero que produce una reacción positiva o débilmente positiva debe hacérsele una
reacción cuantitativa.

1. Preparar diluciones del suero según el grado de positividad: 1:2, 1:4, 1:8…. Con
solución salina.
2. Colocar 50uL de cada una de ella en las excavaciones y continuar el procedimiento
como para una prueba cualitativa.
La lectura se informa como reactiva hasta la dilución más alta que de un resultado reactivo.
Resultados erróneos: pueden ser ocasionados por hemolisis, hiperlipemia,
Resultados falsamente positivas pueden ser observados en individuos con cuadros patológicos
diversos: hepatitis lepra, brucelosis, asma, malaria, tuberculosis, cáncer, diabetes, influenza y
enfermedades autoinmunes.
Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el fenómeno de
prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba en suero diluido 1:5 con solución salina.

D. REACCION DE VDRL CON LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO.

Solo se emplea LCR que no presente enturbiamiento visible bien sea por contaminación
bacteriana, pleocitosis u otra causa cualquiera.

Centrifugar el líquido para sedimentar todas las partículas que no se ven a simple vista y tomar
cuidadosamente el sobrenadante para la reacción.
Inactivar el líquido a 56°C por 15min, enfriar a temperatura ambiente antes de usarlo.
 PRUEBA CUALITATIVA:

Igual que en suero, sino que se agregan solo 10uL de la emulsión de antígeno y se deja en el
rotador 5min a 140rpm.

PRUEBA CUANTITATIVA:
Preparar las diluciones y proceder como se indicó anteriormente en la prueba cuantitativa en
suero.

REACCION DE FLOCULACION (Las lecturas como se indicó en suero)

VDRL: REACTIVO VDRL: NO REACTIVO

Observación: “todo VDRL reactivod debe reportarse con titulo de reacción”