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CÉLULA ANIMAL
GUÍA CULTURAL

Creíble lleva a Increíble™

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Tabla de contenido
Esta guía contiene información técnica general para trabajar con células animales en cultivo, incluidos medios, subcultivo, criopreservación y
contaminación. Se puede encontrar una referencia más completa sobre el cultivo de células animales en Culture of Animal Cells: A Manual of
Basic Technique, 5th edition, de R. Ian Freshney (24).

Mantenerse a salvo en un entorno pandémico ...........4 Recipientes de cultivo y superficies ...........................18

Materiales, contaminación y espacio de trabajo .................. Embarcaciones.................................................. ..........................18

4 Evitar infecciones ....... .................................................... 4 Recubrimientos de superficie y celdas alimentadoras ...........20

Primeros pasos con una línea celular ATCC ........... 5 Criopreservación .................................................. 21
Hoja de producto................................................ .......... 5 Visión general................................................. .......................21

Preparación del Medio .................................................. .. 5 Inicio de Congelar medio ................................................. .............21

cultivos congelados ........................................... .. 5 Procesamiento Equipo ................................................. ...........22 Almacenamiento

de cultivos en matraces.................................... 5 en congelador de nitrógeno líquido .................. ......22 Procedimiento

de crioconservación .......................................23 Recuperación de

Crecimiento y Propagación de Células ............................7
Células crioconservadas ................................23
Número de Pasajes y Nivel de Duplicación de
Población .......7 Adaptación a un nuevo medio o Contaminación y Bioseguridad ................................24
suero .......................7 Compruebe si hay contaminación microbiana..........................24
Temperatura .................. .................................................... 8 Examen de las Culturas .................................................. ... 8
Contaminación por micoplasma......................................24 Tratamiento

Conteo de células .................................................. ........... 9 Viabilidad para la contaminación microbiana.... ....................24 Contaminación

celular .............................. ..................................... 9 Subcultivo de cruzada celular ......................... ..........24

células monocapa ......... ............................10 Subcultivo en Bioseguridad.................................................. ......................25

monocapa .................. ............................10 Solución de problemas

Glosario................................................. ..............26
de subcultivo de células monocapa ..........10 Células en

suspensión .. .................................................... ......11 Subcultivo de

Referencias.................................................. .........28
células en suspensión ......................................11 Solución de

problemas de subcultivo de células en suspensión ...........11

Medios, sueros y reactivos de la ATCC...................29
Adaptación de una línea de células monocapa para crecer en
suspensión .................. .............................................12

Medios de crecimiento completos.................................13

Medios de cultivo celular .............................................. ........13

Formulaciones de medios ................................................. ......13

Ingredientes de los medios ................................................ .........13

Suplementos de medios .................................. ................15

Osmolalidad ................................ .....................................15

Antibióticos y Antimicóticos ......... ..............................15

Sueros animales ................................................. ...................dieciséis

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Mantenerse a salvo en un entorno pandémico

Cuando llegó la reciente pandemia de coronavirus, los laboratorios de todo el mundo decidieron cerrar sus operaciones, reducir la escala de trabajo o proceder
a toda máquina. Para salvaguardar la salud de nuestros científicos, la ATCC ha adoptado una serie de mejores prácticas que minimizan la transmisión del
SARS-CoV-2 con poco impacto en la productividad. Ya sea que regrese después de una pausa o se prepare para un nuevo proyecto, todos podemos usar un
repaso para ayudar a seguir las mejores prácticas. Lea esta primera sección de la guía cultural para obtener algunos recordatorios rápidos sobre los puntos
críticos de contaminación comunes y consejos sobre cómo mantenerlos bajo control mientras realiza su trabajo.

Materiales, contaminación y espacio de trabajo

Es posible que esté regresando al laboratorio o comenzando un nuevo proyecto. Antes de comenzar, considere algunos puntos críticos potenciales que pueden afectar profundamente sus
resultados experimentales, como la calidad de sus materiales de partida, la ejecución de la técnica de laboratorio adecuada y la organización de su espacio de trabajo. Aquí hay algunos
consejos y técnicas simples para evitar arruinar sus experimentos, lo que puede generar resultados confusos, retractaciones de artículos, pérdidas financieras y daños en la reputación.

Material para la Investigación

1 Revise los materiales existentes para detectar signos de contaminación.

2 Autentique y reponga sus líneas celulares y microbios.
3 Iniciar nuevos proyectos con materiales de confianza.
4 Compruebe periódicamente las fechas de caducidad de los medios y reactivos.

Contaminación cruzada

1 Asegúrese de que todos, nuevos y experimentados, estén capacitados en técnicas asépticas.

2 Haga alícuotas de sus muestras y reactivos.
3 Cuando la división en alícuotas no sea práctica, coloque solo la cantidad de reactivo que espera usar en un recipiente secundario. Descartar el
resto cuando termine de trabajar.
4 Evite compartir pipetas u otros equipos.
5 Limpiar el interior y el exterior de las pipetas y herramientas que deban ser compartidas.
6 Utilice el gabinete de bioseguridad para reducir la contaminación.

Espacio personal y equipamiento.

1 Mantenga el espacio del banco despejado.

2 Lave su bata de laboratorio regularmente.
3 Deje los artículos personales afuera.
4 Limpie su área de trabajo antes y después del uso.
5 Use tabletas de laboratorio en lugar de teléfonos personales.
6 Si se necesitan artículos personales, desinféctelos antes y después del uso en el laboratorio.
7 Mueva el equipo adicional lejos de las paredes y grietas para facilitar una limpieza frecuente y completa.

Evitar la infección
Al igual que usted, estamos comprometidos con la protección de la salud de nuestros colegas. Si bien el SARS-CoV-2 es actualmente único en su naturaleza patógena y dinámica de
transmisión, con el tiempo pueden surgir otros organismos infecciosos que amenacen la salud de los trabajadores de laboratorio. Para reducir la posibilidad de contraer una enfermedad
infecciosa actual o emergente mientras trabaja en el laboratorio en condiciones de epidemia o pandemia, le recomendamos que siga estas prácticas recomendadas.

Viniendo y yendo

1 Lávese bien las manos al entrar y salir del laboratorio.

2 Domine los conceptos básicos del uso y retiro adecuados del equipo de protección personal (EPP).
3 Quédate en casa si has estado expuesto a alguna enfermedad.
4 Inspeccione el EPP antes de usarlo.

Interactuar con otros

1 Recuerde, las partículas se propagan al hablar, toser y respirar.

2 Utilice herramientas de colaboración virtual y converse solo antes o después de trabajar en cultivos celulares.
3 Mantenga siempre cubierta la nariz, la boca y la piel con EPP.
4 Esté más atento al uso de EPP cuando trabaje con animales.
5 Mantenga 6 pies de espacio entre las personas.

Transmisión Aérea

1 Reduzca el tráfico peatonal en el laboratorio.

2 Designe flujos de tráfico unidireccionales para apoyar el distanciamiento.

3 Intente limitar la capacidad para ayudar al distanciamiento físico.

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Primeros pasos con una línea celular ATCC

Las líneas celulares ATCC y los hibridomas se envían congelados en hielo seco en viales de crioconservación o como cultivos en crecimiento en matraces a temperatura ambiente. Al recibir las
células congeladas, es importante revivirlas inmediatamente descongelándolas y extrayéndolas del DMSO y colocándolas en cultivo. Si esto no es posible, almacene las células en vapor de nitrógeno
líquido (por debajo de -130 °C). No almacene las células congeladas a temperaturas superiores a ÿ130 °C, ya que su viabilidad disminuirá rápidamente.

Hoja de producto

Las hojas de productos de la línea celular de la ATCC que contienen información detallada para el manejo de las células se pueden encontrar en el sitio web de la ATCC o comuníquese con el
soporte técnico de la ATCC para solicitar una copia.

Preparación del Medio NOTA 1

Prepárese para revivir las líneas celulares ensamblando el medio, el suero y los reactivos
Si bien la mayoría de las líneas celulares pueden replicarse en más de un medio de cultivo,
adicionales necesarios para el crecimiento. Muchos de estos productos están disponibles en
sus características pueden alterarse cuando se cambia el medio. Por esta razón, se
ATCC y se pueden pedir con las líneas celulares. Estos son los mismos reactivos utilizados por
recomienda comenzar los cultivos celulares en el mismo medio utilizado por la ATCC para
la ATCC para el crecimiento y la conservación de células. (Ver: NOTA 1)
obtener los mejores resultados (consulte la hoja de información del producto y el sitio web
de la ATCC). Para obtener detalles sobre la adaptación de una línea celular a un nuevo
medio, consulte la página 7.
Inicio de cultivos congelados
1 Prepare un recipiente de cultivo de forma que contenga el volumen recomendado del medio
de cultivo adecuado, tal como se indica en la hoja de producto, equilibrado para temperatura y pH (COÿ).

2 Descongele el vial agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 °C o la temperatura de crecimiento normal para esa línea celular. La descongelación debe ser rápida, aproximadamente
2 minutos o hasta que los cristales de hielo se hayan derretido.

3 Retire el vial del baño de agua y descontamine sumergiéndolo o rociándolo con etanol al 70 %. Siga estrictas condiciones asépticas
ciones en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar para todas las manipulaciones posteriores.

4 Desenrosque la parte superior del vial y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga estéril que contenga 9 ml del medio recomendado.
Retire el agente crioprotector (DMSO) mediante centrifugación suave (10 minutos a
125 × g). Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 o 2 mL de medio de NOTA 2
crecimiento completo.
Algunas líneas celulares, como los hibridomas, tardan varios días antes de recuperarse
Transfiera la suspensión celular al recipiente de cultivo que contiene el medio de
por completo de la criopreservación. Algunos hibridomas tienen poca viabilidad el primer
crecimiento completo y mezcle bien balanceándolo suavemente.
día de cultivo y generarán restos celulares. Después de este punto, las células comenzarán
a recuperarse y entrarán en un crecimiento exponencial.
5 Examinar los cultivos celulares después de 24 horas y subcultivar como
necesario. (Ver: NOTA 2)

Procesamiento de cultivos en matraces

Algunas células ATCC se envían como cultivos en crecimiento en recipientes de cultivo. Estos recipientes se siembran con células, se incuban para garantizar el crecimiento celular y luego se llenan
completamente con medio para el envío.

Al recibir un cultivo en matraz, examine visualmente el medio en busca de evidencia macroscópica de contaminación microbiana. Esto incluye cambios de pH inusuales (color amarillo o púrpura del
rojo fenol), turbidez o partículas. Con un microscopio invertido a baja potencia (100x), verifique el medio en busca de evidencia de contaminación microbiana, así como la morfología de las células.
Consulte la página 8 para obtener más detalles sobre el examen de cultivos celulares.

Si las células están unidas y crecen en una monocapa:

1 Extraiga asépticamente todo el medio de envío excepto entre 5 ml y 10 ml. El medio de envío se puede guardar para su reutilización y se debe
almacenado a 4°C.

2 Incube el matraz a la temperatura y concentración de COÿ recomendadas en la hoja de producto (37 °C con 5 % de COÿ para la mayoría de las células).
líneas) hasta que las células se subcultivan.

Si las células no están adheridas o están creciendo en suspensión:

1 Transferir asépticamente todo el contenido del matraz a un tubo de centrífuga.

2 Centrifugar a 125 × g durante 5 a 10 minutos.

3 Retire todo menos 10 ml del sobrenadante del medio de transporte y vuelva a suspender las células. Guarde el resto de este medio a 4°C durante
uso posterior.

4 Transfiera asépticamente las células resuspendidas a un matraz de 25 cm² o de 75 cm², según la línea celular (consulte la Ficha del producto).

5 Incube las células a la temperatura y concentración de COÿ recomendadas en la hoja de información del producto hasta que las células estén
subcultivado.

La mayoría de las líneas celulares comienzan como cultivos primarios que se originan a partir de un trozo de tejido picado o dispersado con enzimas. Los cultivos primarios, como mezclas de varios
tipos de células, conservan las características de su tejido de origen.

Después de un período de tiempo, los cultivos primarios alcanzarán la confluencia, el estado en el que se cubre todo el espacio disponible del recipiente de cultivo debido a

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expansión celular. En este punto, será necesario desagregar el cultivo (generalmente con enzimas proteolíticas como la tripsina) en células individuales y subcultivarlas (dividirlas,
pasarlas o transferirlas). Después de este primer pase, el cultivo generalmente se denomina línea celular. Con cada subcultivo posterior, la población celular se vuelve más homogénea a
medida que predominan las células de crecimiento más rápido. Las células con las propiedades deseadas también se pueden seleccionar del cultivo mediante clonación.

Las líneas celulares diploides rara vez progresan más allá de unas pocas duplicaciones de población. Tienen una capacidad replicativa finita y comienzan a ralentizarse y finalmente dejan
de dividirse después de 20 a 80 duplicaciones de la población.¹ La evidencia reciente sugiere que parte de la senescencia celular observada en el cultivo celular puede deberse a
condiciones de cultivo inapropiadas en lugar de una senescencia replicativa predeterminada. .² Otros datos más respaldan la senescencia replicativa de las células de algunas especies
(sobre todo humanas) incluso cuando crecen en condiciones de cultivo mejoradas. Esta senescencia está mediada por el acortamiento de los extremos de los cromosomas (telómeros)
con cada división celular.³

Por el contrario, las líneas celulares continuas (o inmortalizadas) tienen una capacidad replicativa infinita. Estas líneas se derivan de líneas celulares mediante inmortalización o
transformación por cualquiera de varios medios. Muchas líneas celulares continuas se derivaron de tejido tumoral. La mayoría de las líneas celulares de la colección de la ATCC son
continuas, aunque algunas, como el fibroblasto de piel humana CCD-1117Sk (ATCC® CRL-2465™) o el colon humano CCD-18Co (ATCC® CRL-1459™), son finitas. Para obtener más
información sobre las líneas celulares inmortalizadas de la ATCC, consulte el sitio web.

Como se señaló en la sección sobre recipientes de cultivo, las líneas celulares crecen adheridas a una superficie (dependiente del anclaje) o en suspensión ( independiente de la edad
del anclaje). A medida que las células crecen y se dividen en una monocapa o en suspensión, suelen seguir un patrón de crecimiento característico compuesto por cuatro fases: retraso,
logaritmo o exponencial, estacionario o meseta y declive.

Fase de retraso: inmediatamente después de sembrar el recipiente de cultivo, las células crecen lentamente mientras se recuperan del estrés del subcultivo.

Fase logarítmica o exponencial: las células entran en un período de crecimiento exponencial que dura hasta que se ocupa toda la superficie de crecimiento o la concentración de
células supera la capacidad del medio.
Fase estacionaria: la proliferación celular se ralentiza y se detiene.
Fase de declive: si no se reemplaza el medio de cultivo y el número de células no se reduce, las células pierden viabilidad y su número disminuye.

Para garantizar la viabilidad, la estabilidad genética y la estabilidad fenotípica, las líneas celulares deben mantenerse en la fase exponencial. Esto significa que deben subcultivarse
periódicamente antes de que entren en la fase de crecimiento estacionario, antes de que una monocapa sea 100 % confluente o antes de que una suspensión alcance la densidad celular
máxima recomendada. La generación de una curva de crecimiento para cada línea celular es útil para determinar las características de crecimiento de la línea celular. (Ver: Figura 1)

Para obtener información detallada sobre el crecimiento y la propagación de cualquier línea celular de la ATCC, consulte la Hoja de producto de la línea celular específica que se puede
encontrar en el sitio web de la ATCC, o comuníquese con el Soporte técnico de la ATCC para que le envíen una.

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Crecimiento y propagación celular

Número de pasaje y nivel de duplicación de la población
Los cultivos primarios generalmente se subcultivan en una proporción de 1:2 (se dividen por la mitad con cada paso). La mayoría de las líneas celulares continuas
se replican a tasas más altas y se subcultivan a una proporción de división mucho más alta. El número de pases es generalmente el número de veces que las
células se han subcultivado en un recipiente nuevo. Para cultivos diploides, el número de pases es aproximadamente igual al número de duplicaciones de
población (o nivel de duplicación de población, PDL) desde que se inició el cultivo. Este no es el caso de las líneas celulares continuas, ya que se pasan a
proporciones de división más altas. En consecuencia, la PDL no se determina para líneas celulares continuas. En la mayoría de los casos, el PDL es una
estimación, ya que no tiene en cuenta las células que se perdieron debido a la muerte por necrosis o apoptosis o las células que se acercan a la senectud y ya
no se dividen. Calcule el nivel de duplicación de la población con la siguiente fórmula:

PDL = 3,32 (log Xe – log Xb) + S

Xb es el número de células al comienzo del tiempo de incubación.

Xe es el número de células al final del tiempo de incubación.
S es el PDL inicial.

Fase de latencia Fase exponencial Fase estacionaria

3x10ÿ

Subcultura
10ÿ

10ÿ

Doblando tiempo

3x10³
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Días después de la subcultura

Figura 1: Curva de crecimiento para células cultivadas en cultivo. Las células deben subcultivarse mientras aún se encuentran en la fase exponencial.

Calcula el tiempo de duplicación de la población, o el tiempo necesario para que una cultura se duplique en número, con la siguiente fórmula:

DT=T ln2/ln(Xe/Xb)
NOTA 3
T es el tiempo de incubación en cualquier unidad. Las células crecen a diferentes velocidades en cada una de las diferentes fases del
Xb es el número de células al comienzo del tiempo de incubación. ciclo de crecimiento y el tiempo de duplicación calculado puede ser una combinación
Xe es el número de células al final del tiempo de incubación.
de crecimiento durante más de una de estas fases. El crecimiento durante el
(Ver: NOTA 3)
crecimiento exponencial o fase logarítmica es bastante constante y reproducible

La ATCC rastrea la PDL y el número de paso de muchas líneas celulares adherentes para un conjunto determinado de condiciones de crecimiento.

cuando el depositante proporciona esta información en el momento del depósito. Consulte

la hoja de información del producto para la línea celular específica para el número de pase y/o PDL como parte de la información específica del lote suministrada.

Adaptarse a un nuevo medio o suero

Para asegurarse de que las características de su línea celular permanezcan constantes, mantenga sus células en el mismo medio, suero y suplementos con el mismo régimen de
subcultivo utilizado para establecer el cultivo. Cualquier cambio en las condiciones de cultivo tiene el potencial de cambiar las características de la línea celular.

Sea especialmente cauteloso cuando trabaje con una nueva línea celular, ya que las formulaciones de medios varían entre los proveedores, incluso para medios con nombres similares
o idénticos. Lea detenidamente las descripciones, las formulaciones y las etiquetas para asegurarse de que se utiliza el medio adecuado o la línea celular puede adaptarse
inadvertidamente a un nuevo medio. Todas las líneas celulares ATCC vienen con información sobre su medio de crecimiento. En la mayoría de los casos, el medio y el suero
recomendados pueden adquirirse en la ATCC junto con la línea celular.

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Utilice el siguiente procedimiento para adaptar una línea celular a un nuevo medio:

1 Subcultive la línea en una proporción de división de 1:2 (divida el cultivo por la mitad) en dos recipientes.
2 Mantenga uno con el medio original y continúe subcultivando estas células durante todo el proceso de adaptación. Utilice una mezcla 1:1 del medio original y nuevo en el segundo
recipiente. El cultivo desarrollado en el medio original sirve como punto de referencia y como protección en caso de que las células que se adaptan no sobrevivan al proceso. La baja
relación de división ayuda a mitigar el estrés asociado con el subcultivo, así como con el nuevo medio.

3 Supervise el crecimiento celular en los dos medios y observe cualquier cambio en la morfología o la tasa de crecimiento. Si son idénticos, subcultive el
adaptando las células en el siguiente paso con una proporción de división de 1:2 en una mezcla media de 1:3 (25 % original, 75 % nuevo).
4 Supervisar la tasa de crecimiento y la morfología de las culturas originales y de adaptación.
5 En el siguiente paso, divida los cultivos de adaptación 1:2 en una mezcla mediana 1:7 (12,5 % original, 87,5 % nuevo).
6 Supervisar la tasa de crecimiento y la morfología de las culturas originales y de adaptación. Si las células son idénticas, en el siguiente paso divida las células de adaptación 1:2 en
medio 100 % nuevo. En este punto, la cultura debe adaptarse al nuevo medio.

Para confirmar la adaptación completa al nuevo medio, realice pruebas funcionales en células derivadas del medio original y nuevo. Si en algún punto del proceso la cultura de adaptación
no se desempeña tan bien como la cultura de referencia, permita que la cultura de adaptación tenga más tiempo y algunos pasajes más en su mezcla de medios actual (p. ej., 1:3, 1:7,
etc.). ) hasta que coincidan con las celdas de referencia.

Se puede utilizar el mismo enfoque para adaptar las células a un medio sin suero; simplemente disminuya el nivel de suero en el medio a la mitad con cada paso hasta que se alcance un
nivel de suero de 0,06% (o inferior). En este punto, las células se pueden mantener en medio sin suero. Si en algún momento la tasa de crecimiento disminuye, entonces el nivel sérico
debe aumentarse hasta el nivel en el que las células crecieron normalmente. En este procedimiento, comience con el medio "sin suero" suplementado con suero para que solo cambie el
nivel de suero con cada pase.

La temperatura
La mayoría de las líneas de células animales requieren 37 °C para un crecimiento NOTA 4
óptimo. Las células de insectos y anfibios requieren temperaturas más bajas
Calibre periódicamente el sistema de control de temperatura de las incubadoras y
(como 28 °C) al igual que algunas líneas de células animales que son sensibles a
utilice un sistema de alarma cuando sea posible para advertir sobre los aumentos de
la temperatura por sus características fenotípicas. Si bien las células cultivadas
temperatura por encima del ajuste óptimo.
pueden soportar caídas considerables de temperatura y la mayoría puede
sobrevivir durante varios días a 4 °C, pocas pueden tolerar incluso unas pocas
horas a más de 2 °C por encima de su temperatura óptima. (Ver: NOTA 4)

Examen de Culturas
Observe la morfología y la viabilidad de los cultivos con regularidad y cuidado. Examine el medio en el recipiente para evidencia macroscópica de contaminación microbiana. Esto incluye
cambios de pH inusuales (color amarillo o púrpura del rojo fenol), turbidez o partículas. Además, busque pequeñas colonias de hongos que floten en la interfaz de aire medio. Compruebe
específicamente alrededor de los bordes del vaso, ya que es posible que no se vean fácilmente a través del microscopio.

Con un microscopio invertido a baja potencia (40x), verifique el medio en busca de evidencia de contaminación microbiana y la morfología de las células. La contaminación bacteriana
aparecerá como pequeños puntos negros brillantes dentro de los espacios entre las células. La contaminación por levaduras aparecerá como partículas redondeadas o en ciernes, mientras
que los hongos tendrán micelios filamentosos delgados. Para las células no adherentes cultivadas en matraces, como los omas híbridos, se trata de una simple cuestión de ver el matraz
directamente en el microscopio. Para las células cultivadas en matraces giratorios o biorreactores, será necesario retirar una muestra de la suspensión celular y cargarla en un portaobjetos
de microscopio o hemocitómetro para su observación.

La mayoría de las células adherentes deben adherirse firmemente a la superficie. En algunos casos, las células sanas se redondean y se desprenden un poco
durante la mitosis y parecen muy refráctiles. Después de la mitosis, se volverán a unir. Algunos de estos flotarán libremente si el recipiente de cultivo se altera físicamente.
Por el contrario, las células muertas a menudo se redondean y se desprenden de la monocapa y parecen más pequeñas y oscuras (no refringentes) que las células sanas.

Las células en cultivo en suspensión crecen como células individuales o como grupos de células. Las células viables aparecen redondas y refráctiles, mientras que las células muertas
aparecen más pequeñas y oscuras. Ocasionalmente, una porción de las células se adherirá y crecerá en el costado del recipiente de cultivo y aparecerá redonda o aplanada. El porcentaje
de células adheridas varía con las condiciones de cultivo y la densidad celular. También se pueden observar restos celulares en poblaciones de células sanas. Algunas líneas celulares
crecen como cultivos mixtos adherentes y en suspensión.

Como referencia, las fotomicrografías de algunas líneas celulares de la ATCC están disponibles en el sitio web. Las células se muestran en dos densidades diferentes: justo después del
subcultivo (baja) y justo antes de que sea necesario subcultivarlas (alta).

Además de los exámenes diarios, analice periódicamente una muestra del cultivo para detectar la presencia de hongos, bacterias y micoplasmas. Hay varios métodos que se pueden usar
para verificar estos contaminantes. Para obtener información adicional, consulte la sección sobre contaminación microbiana (página 24).

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ATCC® CCL-61™ a baja densidad ATCC® CCL-61™ a alta densidad

Conteo de células
Los recuentos de células son necesarios para establecer o controlar las tasas de crecimiento, así como para establecer nuevos cultivos con números de células conocidos.
Los hemocitómetros (también llamados hemocitómetros) se usan comúnmente para estimar el número de células y determinar la viabilidad celular. Un hemocitómetro es un
portaobjetos de vidrio bastante grueso con dos cámaras de recuento, una a cada lado. Cada cámara de conteo tiene una superficie espejada con una cuadrícula de 3 × 3 mm de
9 cuadrados de conteo. (Consulte la Figura 2) Las cámaras tienen lados elevados que sujetarán un cubreobjetos exactamente 0,1 mm por encima del piso de la cámara. Cada
uno de los 9 cuadrados de conteo tiene un volumen de 0,0001 mL.

Los hemocitómetros son excelentes para determinar la viabilidad celular, pero no son precisos para determinar el número de células debido al número relativamente bajo de
células realmente contadas. Un contador automatizado generará los datos más confiables, particularmente cuando se usa en combinación con los datos de viabilidad de un
hemocitómetro.

Cuente las células de la siguiente manera:

1 Limpie, seque completamente y ensamble el hemocitómetro con el cubreobjetos.

2 Transfiera una pequeña cantidad de suspensión celular al borde de cada una de

1 2 las dos cámaras de recuento. Deje que la suspensión de células entre en la

cámara de recuento por acción capilar.
3 Coloque el hemocitómetro bajo un microscopio invertido y
ver las celdas con un aumento de 100x.
4 Concéntrese en los cuadrantes, etiquetados como 1, 2, 3 y 4 en la Figura 2.
5 Registre el número de celdas en cada sección. Promedie el número de
células y multiplíquelo por el factor de dilución. Si las células no se han
diluido, este factor será de 10ÿ células/mL.
Cualquier dilución de la muestra después de retirarla de la suspensión celular,
como el uso de tinción vital, debe incluirse en el cálculo.

Por ejemplo, si los cuatro recuentos son 60, 66, 69 y 75, la concentración
sería de 68 × 10ÿ células/mL para la muestra que se cargó en el
hemocitómetro. Para obtener los mejores resultados, ajuste la concentración

3 4 de la suspensión para que haya de 50 a 100 células en cada una de las cuatro seccione

La mayoría de los cultivos crecerán a una concentración celular de inóculo inicial

que oscila entre 10³ y 10ÿ células/cm². Los cultivos de crecimiento más rápido
generalmente se establecen en concentraciones más bajas. Algunos cultivos no
crecen bien a menos que se agregue inicialmente una concentración mínima de
células; vea la hoja de producto para más detalles.

Figura 2: Rejilla de hemocitómetro con regla de Neubauer.

Viabilidad celular
Los ensayos de viabilidad miden el número de células viables en una población. Cuando se combina con el número total de células, el número de células viables proporciona una
indicación precisa de la salud del cultivo celular. Los métodos más comunes y rápidos se basan en la integridad de la membrana celular como indicador de la viabilidad celular.
Tanto las tinciones con azul de tripano como con eritrosina B son activamente excluidas por las células viables, pero son captadas y retenidas por las células muertas, que
carecen de una membrana intacta.

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Si bien ambas tinciones se usan de la misma manera, la ATCC recomienda la eritrosina B en lugar del azul de tripán para las células hematopoyéticas. Cuando utilice azul tripán,
incube las células de dos a cinco minutos antes de su uso. Si no se cuenta dentro de este tiempo, las células comenzarán a deteriorarse y absorberán el tinte. La eritrosina B no
requiere un período de incubación.

La tinción con eritrosina B genera resultados más precisos con menos falsos negativos y falsos positivos. La solución de tinción de eritrosina B proporciona un fondo claro y no se une
a las proteínas séricas con tanta avidez como el azul de tripano, lo que hace que las células teñidas sean más distintas y fáciles de identificar. Además, la contaminación microbiana o
los precipitados en el cultivo celular son más evidentes. Finalmente, el azul de tripano es tóxico y un cancerígeno potencial.

Para cualquiera de las dos manchas, use las siguientes instrucciones:

1 Mezcle la suspensión celular 1:1 con una solución de eritrosina B al 0,1 % en PBS o una solución de azul tripán al 0,4 % en PBS.
2 Cargue las células en la solución de eritrosina B directamente en un hemocitómetro limpio y seco, pero incube la solución de azul tripán de dos a
cinco minutos antes de cargar.
3 Las células no viables se tiñen de rojo (eritrosina B) o azul oscuro (azul tripano). La viabilidad celular se calcula como el número de células no teñidas o
células viables dividido por el número total de células y expresado como porcentaje.

Subcultivo de células monocapa

Las líneas celulares dependientes del anclaje que crecen en monocapas deben subcultivarse a intervalos regulares para mantenerlas en un crecimiento exponencial. Cuando las
células están cerca del final del crecimiento exponencial (aproximadamente del 70 % al 90 % de confluencia), están listas para ser subcultivadas. El procedimiento de subcultivo,
incluidas las proporciones divididas recomendadas y los programas de reposición (alimentación) del medio, para cada línea celular ATCC se proporciona en la Hoja de información del
producto.

El subcultivo de monocapas implica la ruptura de los enlaces intercelulares e intracelulares entre las células y la superficie. En el caso de algunas células que están sueltas, un golpe
fuerte con la palma de la mano contra el costado del matraz puede desprenderlas. Muchos requieren la digestión de sus enlaces de unión a proteínas con enzimas proteolíticas como
la tripsina/EDTA. Para algunas líneas celulares, se prefieren fuerzas mecánicas tales como raspado para desalojar las células. Una vez que las células se han disociado y dispersado
en una suspensión de una sola célula, se diluyen a la concentración adecuada y se transfieren a recipientes de cultivo nuevos con el medio de crecimiento adecuado donde se
volverán a unir, crecer y dividirse.

El siguiente procedimiento es apropiado para la mayoría de las líneas celulares adherentes. Sin embargo, dado que cada línea celular es única, los tiempos y la temperatura de
incubación , el número de lavados o las formulaciones de la solución pueden variar. En todos los casos, observe continuamente las células con un microscopio durante el proceso de
disociación para evitar daños por la solución de disociación. Las cantidades utilizadas en este procedimiento son para un matraz de 75 cm². Ajuste los volúmenes según corresponda
para recipientes de diferentes tamaños.

Subcultivo Monocapa
1 Lleve la solución de tripsina-EDTA (ATCC® 30-2101), la solución salina equilibrada [Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio, ATCC® 30-2200]
y el medio de crecimiento completo a la temperatura adecuada para la línea celular. En la mayoría de los casos, esta es la temperatura utilizada para hacer crecer las células
(generalmente 37°C). Para algunas células sensibles, es posible que la solución de tripsina-EDTA deba usarse a temperatura ambiente o a 4 °C.

2 Retire y deseche el medio de cultivo celular del matraz.

3 Enjuagar la monocapa celular con PBS de Dulbecco sin calcio ni magnesio y retirar.
4 Agregue de 2 ml a 3 ml de la solución de tripsina-EDTA e incube a la temperatura adecuada. Compruebe el progreso de la disociación celular por microscopía. Para evitar la
formación de grumos, no agite las células golpeando o sacudiendo el matraz mientras espera que se desprendan.
5 Una vez que las células parezcan haberse desprendido (de 5 a 15 minutos para
la mayoría de las líneas celulares; aparecerán redondeadas y refráctiles bajo el NOTA 5
microscopio), agregue de 6 a 8 ml de medio de crecimiento completo con una
Para el medio sin suero o con bajo contenido de suero, retire la solución de tripsina-
pipeta a la suspensión celular para inactivar la trippina. Lave suavemente las
EDTA mediante centrifugación suave (10 minutos a 125 × g) y luego vuelva a
células restantes de la superficie de crecimiento del matraz. Compruebe las
suspender las células en 6 a 8 ml de medio fresco. En algunos casos, será necesario
células con el microscopio para asegurarse de que la mayoría (>95 %) sean
inactivar la tripsina con un inhibidor de tripsina.
células individuales. Si los grupos de células son aparentes, continúe dispersando
las células con un pipeteo suave. (Ver: NOTA 5)

6 Agregue de 12 a 15 ml de medio de cultivo fresco a un matraz nuevo y equilibre este medio al pH y la temperatura adecuados.
7 Cuente las células en suspensión y determine su viabilidad o simplemente divídalas de acuerdo con una proporción de división de rutina y distribúyalas en el medio del matraz recién
preparado. No agregue una suspensión celular concentrada a un recipiente de cultivo vacío, ya que esto puede provocar una unión y un crecimiento desiguales de las células.

8 Vuelva a colocar el matraz en la incubadora. Examine el cultivo al día siguiente para asegurarse de que las células se hayan vuelto a unir y estén creciendo activamente. Cambie
el medio según sea necesario; para la mayoría de los cultivos en crecimiento activo, lo normal es dos o tres veces por semana.

Solución de problemas de subcultivo de células monocapa

Las células son difíciles de eliminar.

Los inhibidores en el medio (como el suero) han inactivado los agentes de disociación. Enjuague la monocapa celular dos veces con PBS de Dulbecco sin calcio o magnesio
antes de agregar la solución de disociación. O use la solución de tripsina-EDTA en lugar del PBS de Dulbecco para el primer enjuague de la monocapa.

La solución de disociación era demasiado débil. Use concentraciones de enzima más altas, concentraciones de EDTA más altas o enzimas diferentes y/o adicionales (p. ej.,
dispasa, colagenasa). O incube las células a 37 °C para aumentar la actividad de la solución de disociación.

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Las células han sido confluentes durante demasiado tiempo y las uniones de célula a célula son tan estrechas que impidieron que los agentes de disociación alcanzaran la interfaz
sustrato-célula. En el futuro, subcultive las células antes de que se vuelvan confluentes.

Las células forman grupos después de la disociación.

El procedimiento de disociación fue demasiado severo y se liberó ADN genómico de las células lisadas. El pipeteo fue demasiado vigoroso o la solución de disociación fue demasiado
fuerte o demasiado tóxica (es decir, el pH o la osmolalidad del tampón fueron incorrectos). Agregue una gota de ADNasa estéril (1 mg/mL en agua) a la suspensión celular para
descomponer las hebras de ADN. En el futuro, trate las células con más cuidado durante el pipeteo, acorte el período de incubación, use una solución de disociación más débil (baje la
concentración de enzima o elimine el EDTA) o incube a una temperatura más baja.

Las células se agregaron antes de la dilución y dispersión en el medio. Mantenga la suspensión de células en hielo si va a haber un retraso entre la eliminación de las células de la superficie
de crecimiento del matraz y la siembra de un nuevo matraz.

Las células se centrifugaron con demasiada fuerza o durante demasiado tiempo cuando se eliminó el exceso de solución de disociación. Asegúrese de usar una centrifugación suave (10
minutos a 125 × g).

Las células tienen dificultad para volver a adherirse al matraz.

El procedimiento de disociación fue demasiado largo y eliminó las proteínas de unión necesarias de la membrana celular.

Había suero o factores de unión insuficientes en el medio (común con el medio sin suero). Añadir factores de unión al medio y/o utilizar un matraz recubierto de proteínas (colágeno, poli-L-
lisina, fibronectina, gelatina, etc.).

La solución de disociación no se inactivó ni eliminó por centrifugación. Agregue suero adicional o inhibidores de enzimas específicos (p. ej., inhibidor de tripsina de soya) al medio
neutralizante o centrifugue (5 minutos a 125 × g) las células de la solución de disociación y resuspender en medio fresco.

La viabilidad es menor de lo esperado.

El procedimiento de disociación fue demasiado duro.

El pH o la osmolalidad de la solución salina equilibrada que contiene los agentes de disociación es incorrecta. Verifíquelos directamente y/o use una botella nueva.

La suspensión de células dispersas se dejó demasiado tiempo a una concentración de células demasiado alta antes de volver a sembrar. Mantenga las células en hielo.

El medio estaba defectuoso. Use la formulación recomendada y asegúrese de que contenga todos los aditivos requeridos.

Células de suspensión
La mayoría de los cultivos primarios, las líneas celulares finitas y las líneas celulares continuas dependen del anclaje y, por lo tanto, crecen en monocapas adheridas a una superficie.
Otras células, en particular las derivadas de tejidos hematopoyéticos o de ciertos tumores, son independientes del anclaje y crecen en suspensión.

La propagación celular en suspensión tiene varias ventajas sobre la propagación en monocapa. Subcultivar es una simple cuestión de dilución. Hay poco o ningún retraso en el crecimiento
después de dividir un cultivo en suspensión como ocurre con un cultivo monocapa, porque no hay ningún trauma asociado con la dispersión de enzimas proteolíticas. Los cultivos en suspensión
requieren menos espacio de laboratorio por rendimiento celular, y el escalado es sencillo. Las células se pueden propagar en biorreactores similares a los fermentadores utilizados para cultivos
de levaduras o bacterias.

Según el tipo de célula, los cultivos en suspensión se siembran a densidades de 2 × 10ÿ a 5 × 10ÿ células viables/ml y pueden alcanzar densidades de 2 × 10ÿ células/ml. Si las células se
siembran a una densidad demasiado baja, pasarán por una fase de retraso en el crecimiento, crecerán muy lentamente o se extinguirán por completo.
Si se permite que las densidades celulares sean demasiado altas, las células pueden agotar los nutrientes del medio y morir abruptamente. Las densidades de siembra y subcultivo
recomendadas, los programas de reabastecimiento de medios (alimentación) y las formulaciones de medios para cada línea celular de la ATCC se proporcionan en la hoja de producto, así como
en la descripción del catálogo en el sitio web.

Subcultivo de células en suspensión

1 Lleve el medio de crecimiento completo a la temperatura adecuada (generalmente 37 °C) en un baño de agua.

2 Mezcle bien la suspensión de células/medio; use una pipeta para suspender las células cultivadas en matraces estacionarios. Retire una pequeña cantidad de la
suspensión celular para determinar la densidad celular y la viabilidad usando un hemocitómetro y tinción vital (página 7).

3 Calcule el volumen de células necesario para volver a sembrar el matraz a la densidad mínima para esa línea celular, teniendo en cuenta la
cantidad de medio fresco que se utilizará.

4 Agregue el volumen apropiado de medio al recipiente de cultivo y luego agregue la suspensión celular. No añadir el concentrado celular.
suspensión a un matraz vacío. Se puede reutilizar el mismo recipiente de cultivo, pero las posibilidades de contaminación aumentan con cada resiembra debido a la acumulación de
pequeños derrames de medio en la abertura del matraz.

5 Si es necesario, "gasifique" la atmósfera del matraz con COÿ filtrado en condiciones estériles, selle el matraz y luego incube a la temperatura adecuada.
la temperatura.

Generalmente no es necesario cambiar completamente el medio a menos que las células alcancen una densidad muy alta o el medio tenga un pH ácido (color amarillo del rojo fenol). Para
reemplazar completamente el medio, centrifugue las células suavemente (10 minutos a 125 × g), decante el medio y luego vuelva a suspender las células en medio fresco a la densidad de
siembra más baja.

Solución de problemas de subcultivo de células en suspensión

La viabilidad es menor de lo esperado.

La suspensión celular se dejó demasiado tiempo a una concentración celular demasiado alta antes del subcultivo. En este caso, el medio tendrá un pH bajo y será de color amarillo.
Cambie completamente el medio centrifugando suavemente las células y resuspenda en medio fresco a la densidad de siembra más baja.

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La suspensión celular se diluyó por debajo del rango de densidad celular recomendado. Recuperar las células por centrifugación y resuspender en medio fresco a la densidad
celular adecuada.
El procedimiento de recolección fue demasiado severo (pipeteado demasiado vigoroso, las células se centrifugaron con demasiada fuerza o durante demasiado tiempo, las células se dañaron
durante el raspado o el golpeteo).

El medio estaba defectuoso. Use la formulación recomendada y asegúrese de que contenga todos los aditivos requeridos.

Adaptación de una línea celular monocapa para crecer en suspensión

Algunas líneas celulares como L-929 (ATCC® CCL-1™), HeLa (ATCC® CCL-2™) y BHK-21 (ATCC® CCL-10™) se pueden adaptar para crecer en suspensión.
Con el tiempo, se puede seleccionar una población de células que no se autoagregue ni se adhiera a una superficie de crecimiento tan fácilmente como la línea parental.
Sin embargo, la línea recién seleccionada puede haber perdido o adquirido características diferentes de la población celular original. En la mayoría de los casos será necesario mantener
el cultivo en suspensión con agitación mecánica. Tenga en cuenta que la mayoría de las células dependientes del anclaje crecerán en suspensión solo con el uso de perlas
microportadoras.

El siguiente procedimiento se desarrolló para células BHK-21,ÿ pero se puede utilizar como punto de partida para la mayoría de las líneas celulares.

1 Disocie la monocapa de células mediante procedimientos estándar. Centrifugar y resuspender la suspensión celular en un centrifugado adecuado
medio ner tal como el medio esencial mínimo de Eagle modificado de Joklik (EMEM). Los medios giratorios tienen niveles reducidos de calcio y magnesio.

2 Cuente la suspensión celular y luego siembre dos o más matraces giratorios con 5 × 10ÿ células/mL. Es posible que sea necesario ajustar esta densidad para su línea celular
particular. Es posible que sea necesario siliconizar los lados del matraz de cultivo para evitar que las células se adhieran al vidrio.
3 Observar los cultivos diariamente. Retire las muestras y registre el número de células viables para cada matraz.
4 Cada tres días, recolecte las células que crecen en suspensión por centrifugación (10 minutos a 125 × g). Cuente y vuelva a sembrar un matraz nuevo con medio nuevo a 2,5 × 10ÿ
células/mL. Dependiendo de qué tan bien (o no) las células se adapten al crecimiento en suspensión, es posible que deban combinarse con células de diferentes matraces para
lograr la densidad celular necesaria.
5 Si hay una cantidad significativa de células adheridas a las paredes del recipiente de cultivo, particularmente en la superficie del medio, retírelas con tripsina-EDTA y deséchelas. Si
las células en suspensión están muy agrupadas, pueden dispersarse con la solución de tripsina-EDTA, recolectarse por centrifugación y luego volver a sembrarse en el matraz con
la densidad adecuada. Este tratamiento puede ser necesario para los primeros subcultivos.

6 Continúe monitoreando las células y subcultivarlas cada tres días. Con el tiempo, deberían adaptarse al crecimiento en suspensión y alcanzar una tasa de crecimiento
constante.

Un medio de crecimiento completo consta de un medio de cultivo de células basales

complementado con ingredientes como sueros, factores de crecimiento, oligoelementos y NOTA 6
hormonas. Hay numerosas formulaciones que van desde mezclas simples y básicas que Las formulaciones pueden variar ampliamente entre proveedores, incluso para
contienen los requisitos mínimos para cultivar muchas líneas celulares hasta mezclas medios con nombres similares o idénticos. Asegúrese de leer detenidamente las
complejas sin suero específicas para cultivar una sola línea celular exigente. La elección descripciones del catálogo, las formulaciones y las etiquetas de los medios para
de un medio para una línea celular particular es algo empírica. Muchas formulaciones de asegurarse de que se utiliza el medio adecuado. Para obtener los mejores resultados,
medios están disponibles comercialmente en forma de polvo o líquido. (Ver: NOTA 6) comience los cultivos celulares en el mismo medio utilizado y distribuido por ATCC
(enumerado en la hoja de producto).

La ATCC enumera las formulaciones de medios completas, además de toda la información de manipulación y paso, para todas las líneas celulares de la ATCC, tanto en la descripción
del catálogo en línea como en la hoja de producto. Además, ATCC ofrece una línea completa de medios, sueros y reactivos para el cultivo de células. Estos son los mismos reactivos
que se utilizan en la ATCC para el crecimiento y la propagación celular. Consulte la página 13 para ver las descripciones de los productos de cultivo celular de la ATCC.

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Medios de crecimiento completos

Medios de cultivo celular

Los medios de cultivo celular son mezclas complejas de sales, carbohidratos, vitaminas, aminoácidos, precursores metabólicos, factores de crecimiento, hormonas y
oligoelementos. Los requisitos para estos componentes varían entre las líneas celulares y estas diferencias son en parte responsables de la gran cantidad de formulaciones
de medios. Los carbohidratos se suministran principalmente en forma de glucosa. En algunos casos, la glucosa se reemplaza con galactosa para disminuir la acumulación
de ácido láctico, ya que la galactosa se metaboliza a un ritmo más lento. Otras fuentes de carbono incluyen aminoácidos (particularmente L-glutamina) y piruvato.

Además de los nutrientes, el medio ayuda a mantener el pH y la osmolaridad en un sistema de cultivo. El pH se mantiene mediante uno o más sistemas tamponadores;
COÿ/bicarbonato de sodio, fosfato y HEPES son los más comunes. Sera también amortiguará un medio completo. Se agrega rojo de fenol, un indicador de pH, al medio
para monitorear colorimétricamente los cambios en el pH. Los medios de cultivo comúnmente utilizados incluyen los siguientes:

El medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) fue uno de los primeros medios ampliamente utilizados y fue formulado por Harry Eagle a partir de su
medio basal anterior y más simple (BME). BME se desarrolló para cultivar células L de ratón (ATCC® CCL-1™) y células HeLa (ATCC® CCL-2™). Con
el tiempo, ha habido numerosas variaciones en la fórmula EMEM para diferentes aplicaciones. ATCC EMEM (ATCC® 30-2003) contiene solución salina
equilibrada de Earle, aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio. Está formulado con una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500
mg/l) para usar con un 5 % de COÿ (consulte Bicarbonato de sodio y tamponado, página 14). Debido a que EMEM es un medio simple, a menudo se
fortalece con suplementos adicionales o niveles más altos de suero.

El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) tiene aproximadamente el doble de la concentración de aminoácidos y cuatro veces la cantidad de vitaminas que
el EMEM, así como nitrato férrico, piruvato de sodio y algunos aminoácidos suplementarios (aunque no todos los aminoácidos no esenciales). La fórmula original contenía
1000 mg/L de glucosa, pero en las variantes más utilizadas esta cantidad se incrementó a 4500 mg/L.

ATCC DMEM (ATCC® 30-2002) tiene 4500 mg/L de glucosa y una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500 mg/L) para usar con 5 % de COÿ.

El medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) se formuló para el crecimiento de linfocitos e hibridomas. En comparación con DMEM,
tiene aminoácidos, vitaminas y sales inorgánicas adicionales. Se sustituyó el nitrato de potasio por nitrato férrico. También contiene HEPES y
selenio. ATCC IMDM (ATCC® 30-2005) tiene una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500 mg/L) para usar con 5 % de COÿ.

Hybri-Care Medium (ATCC® 46-X) es una combinación y modificación del medio DMEM y NCTC 135 complementado con insulina, ácido
oxal acético y HEPES. Se basa en la formulación utilizada por David H. Sachs y colaboradoresÿ para la propagación de hibridomas y otras
líneas celulares exigentes.

El 5A y el RPMI-1640 de McCoy se desarrollaron en el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en Buffalo, Nueva York. El 5A de McCoy (ATCC® 30-2007) se usó
originalmente para cultivar células de hepatoma de Novikoff y apoyará el crecimiento de cultivos primarios.

RPMI-1640 es una modificación del 5A de McCoy y se desarrolló para el cultivo a largo plazo de linfocitos de sangre periférica. RPMI-1640 admitirá el crecimiento de una
amplia variedad de células en suspensión, así como una serie de células cultivadas como monocapas.

ATCC RPMI-1640 (ATCC® 30-2001) se modificó para contener cantidades más altas de glucosa (4500 mg/l), piruvato de sodio y tampón HEPES.
También contiene una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500 mg/L) para usar con 5 % de COÿ.

Las mezclas de nutrientes de jamón se desarrollaron originalmente para apoyar el crecimiento clonal de células de ovario de hámster chino (CHO) (ATCC® CCL-61™).
Al igual que con EMEM, ha habido numerosas modificaciones a la formulación original, incluido el medio Ham's F-12, una formulación más compleja que la original F-10
adecuada para la propagación sin suero.

La modificación de Kaighn de Ham's F-12 (Ham's F-12K) fue diseñada para apoyar el crecimiento y la diferenciación de células primarias con o sin suero. F-12K tiene
mayores cantidades de aminoácidos, piruvato, biotina, calcio, magnesio, putrescina y rojo fenol además de otras modificaciones de la fórmula F-12. ATCC Ham's F-12K
(ATCC® 30-2004) tiene una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500 mg/L) para usar con 5 % de COÿ.

DMEM/F12 Medium es una mezcla 1:1 de EMEM modificado de Dulbecco y F-12 de Ham. Es un medio extremadamente rico y complejo y apoyará el crecimiento de una
amplia gama de tipos de células tanto en formulaciones con suero como sin suero.

El medio ATCC DMEM/F12 (ATCC® 30-2006) tiene una concentración reducida de bicarbonato de sodio (1500 mg/l) para usar con 5 % de COÿ.

El medio L-15 de Leibovitz (ATCC® 30-2008) está formulado para su uso sin incubación con COÿ como se encuentra en los laboratorios de enseñanza o
cuando se recolectan muestras de biopsia. El sistema tampón estándar de bicarbonato de sodio/COÿ se reemplaza por una combinación de tampones de
fosfato, aminoácidos de base libre, niveles más altos de piruvato de sodio y galactosa. Los cultivos celulares se pueden cultivar en incubadoras de COÿ con
medio L-15 siempre que no haya intercambio entre el aire del recipiente de cultivo y el de la incubadora (es decir, las tapas de los matraces estén bien cerradas).

Formulaciones de medios

Las formulaciones de los medios disponibles en la ATCC se pueden encontrar en línea. Tenga en cuenta que hay líneas celulares en la colección que requieren medios
que la ATCC no vende actualmente.

Ingredientes de medios
Bicarbonato de sodio y tamponamiento
Las células producen y requieren pequeñas cantidades de dióxido de carbono para crecer y sobrevivir.ÿ En los medios de cultivo, el COÿ disuelto está en equilibrio con los
iones de bicarbonato y muchas formulaciones de medios aprovechan esta reacción de COÿ/bicarbonato para amortiguar el pH del medio. El COÿ se disuelve libremente en
el medio y reacciona con el agua para formar ácido carbónico. A medida que las células metabolizan y producen más COÿ, el pH de

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el medio disminuye a medida que la siguiente reacción química se desplaza hacia la derecha:

HÿO + COÿ HÿCOÿ H+ + HCOÿ–

El rango de pH óptimo de 7,2 a 7,4 se puede mantener complementando el medio con bicarbonato de sodio y regulando el nivel de COÿ en la atmósfera por encima del medio como se
muestra en la siguiente reacción:

HÿO + COÿ + NaHCOÿ H+ + Na+ + 2HCOÿ–

En el cultivo de tejidos, las células se cultivan en sistemas abiertos (en los que hay libre intercambio de la atmósfera inmediatamente superior al medio con la atmósfera de la incubadora)
o en sistemas cerrados (en los que las dos atmósferas se mantienen separadas). El sistema de amortiguación empleado en el medio debe adaptarse al sistema de cultivo. De lo contrario,
las células pueden estar sujetas a un estrés metabólico que perjudicará su rendimiento.

En sistemas cerrados el nivel de COÿ está regulado por el metabolismo de las células. El recipiente de cultivo debe estar sellado (frascos tapados herméticamente) para retener el COÿ
generado por las células. En consecuencia, los sistemas cerrados brindan protección adicional contra la contaminación y tienen requisitos de incubadora más simples que los sistemas
abiertos. Los sistemas cerrados generalmente requieren medios con tampones basados en la solución salina balanceada de Hanks que tiene niveles relativamente bajos de bicarbonato de
sodio.

En sistemas abiertos, se requiere humedad (para reducir la evaporación) y un medio para regular los niveles de COÿ (si el medio de cultivo contiene bicarbonato de sodio) durante la
incubación para mantener el pH del medio de cultivo. Los sistemas abiertos generalmente requieren los niveles más altos de bicarbonato de sodio que se encuentran en la solución de sal
de Earle combinados con una atmósfera de 5 a 10 % de COÿ suministrada por la incubadora. En general, se utilizan de 1,2 g/L a 2,2 g/L de bicarbonato de sodio con un 5 % de COÿ,
mientras que se utilizan 3,7 g/L de bicarbonato de sodio con un 10 % de COÿ. La cantidad exacta dependerá de la formulación del medio.

En algunos casos, los investigadores "gasean" la atmósfera del recipiente de cultivo con una corriente de una mezcla de 5 % de COÿ/95 % de aire filtrada en condiciones estériles y luego
sellan herméticamente el matraz antes de la incubación en una incubadora sin humidificación y sin COÿ.ÿ Si bien estos los recipientes de cultivo funcionan con incubadoras más sencillas,
no humidificadas y sin COÿ, los requisitos del medio son los de un sistema abierto.

Todos los medios ATCC, con la excepción del L-15 de Leibovitz (ATCC® 30-2008), están diseñados para usarse con niveles de COÿ del 5 %. La mayoría tienen una concentración de
bicarbonato de sodio de 1,5 g/l y se complementan con piruvato de sodio adicional. La modificación ATCC de McCoy's 5A (ATCC® 30-2007) tiene niveles ligeramente más altos de
bicarbonato de sodio (2.2 g/L) y no contiene piruvato de sodio.

Si bien la mayoría de las formulaciones comerciales de medios líquidos contienen la cantidad adecuada de bicarbonato de sodio, generalmente se omite de la forma en polvo y debe
agregarse antes de su uso. Algunas formulaciones medianas incorporan otros sistemas tampón como fosfato o HEPES además de COÿ/bicarbonato de sodio. Estos medios tienen la
ventaja de mantener un pH óptimo en un sistema abierto cuando el recipiente de cultivo se retira de la atmósfera enriquecida con COÿ de la incubadora.

Tampón HEPES

HEPES y otros tampones orgánicos se pueden utilizar con muchas líneas celulares para amortiguar eficazmente el pH del medio.ÿ De hecho, algunas formulaciones de medios estándar
incluyen HEPES. Sin embargo, este compuesto puede ser tóxico, especialmente para algunos tipos de células diferenciadas, así que evalúe sus efectos antes de usarlo.ÿ Se ha demostrado
que HEPES aumenta en gran medida la sensibilidad de los medios a los efectos fototóxicos inducidos por la exposición a la luz fluorescente.¹ÿ,¹¹

Fenol rojo
El rojo de fenol se utiliza para controlar el pH de los medios. Durante el crecimiento celular, el medio cambia de color a medida que cambia el pH debido a los metabolitos liberados por las
células. A niveles de pH bajos, el rojo de fenol hace que el medio se vuelva amarillo, mientras que a niveles de pH más altos hace que el medio se vuelva púrpura. Para la mayoría de los
trabajos de cultivo de tejidos (pH 7,4), el medio debe ser de color rojo brillante.

Desafortunadamente, el rojo de fenol puede imitar la acción de algunas hormonas esteroides, particularmente el estrógeno. Para estudios con células sensibles al estrógeno , como el
tejido mamario, utilice medios sin rojo fenol. Además, la homeostasis de los iones sodio-potasio se altera cuando se incluye rojo fenol en algunas formulaciones sin suero; este efecto se
neutraliza mediante la inclusión de suero u hormona pituitaria bovina en el medio.¹² El rojo de fenol se omite con frecuencia en los estudios con citometría de flujo porque su color interfiere
con la detección.

L-Glutamina

La L-Glutamina (ATCC® 30-2214) es un aminoácido esencial requerido por prácticamente todas las células de mamíferos e insectos cultivadas. Se utiliza para la producción de proteínas,
como fuente de energía y en el metabolismo de los ácidos nucleicos. También es más lábil en medios de cultivo celular líquidos que otros aminoácidos. La velocidad y el grado de
degradación de la L-glutamina están relacionados con las temperaturas de almacenamiento, la edad del producto y el pH.

Debido a que la L-glutamina es tan lábil, a menudo se la omite de las preparaciones de medios líquidos comerciales para prolongar la vida útil del producto. En estos casos, debe añadirse
asépticamente antes de su uso. La L-Glutamina no es tan lábil en forma seca y la mayoría de las formulaciones de medios en polvo la incluyen.

En algunos casos, la adición de L-glutamina al medio de cultivo celular completo puede prolongar la vida útil del medio. Si se sospecha que la L-glutamina es un factor limitante durante el
cultivo celular, una simple prueba de "salpicar" el medio con una pequeña cantidad de L-glutamina determinará si se requiere más o no. Simplemente agregue una pequeña cantidad de L-
glutamina (concentración final ~ 2 mM) al medio de cultivo. Si la tasa de crecimiento celular aumenta, lo más probable es que la L-glutamina sea deficiente y se debe agregar más.
Alternativamente, la concentración de L-glutamina se puede medir directamente por medios analíticos estándar como HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento).

Las concentraciones de L-glutamina para los medios de cultivo de células de mamíferos pueden variar de 0,68 mM en el medio 199 a 4 mM en el medio de Eagle modificado por Dulbecco.
Los medios de cultivo de células de invertebrados, como el medio de Drosophila de Schneider, pueden contener hasta 12,3 mM de L-glutamina.

Tenga cuidado al agregar más L-glutamina de la requerida en la formulación del medio original. La degradación de L-Glutamina da como resultado la

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acumulación de amoníaco que puede tener un efecto nocivo en algunas líneas celulares. Para la mayoría de las líneas celulares, la toxicidad del amoníaco es más crítica para la
viabilidad celular que la limitación de L-glutamina.

Aminoácidos no esenciales

Todas las formulaciones medianas contienen los diez aminoácidos esenciales, así como cisteína, glutamina y tirosina. La inclusión de otros aminoácidos no esenciales (alanina,
asparagina, ácido aspártico, glicina, ácido glutámico, prolina y serina) en algunas formulaciones de medios reduce la carga metabólica de las células, lo que permite un aumento
de la proliferación celular.

piruvato de sodio
El piruvato es un metabolito de ácido orgánico intermediario en la glucólisis y el primer componente de la vía de Embden-Meyerhof. Puede pasar fácilmente dentro o fuera de la
célula. Su adición al medio de cultivo de tejidos proporciona tanto una fuente de energía como un esqueleto de carbono para los procesos anabólicos. El piruvato puede ayudar a
mantener ciertas células especializadas, en la selección clonal, en la reducción de la concentración sérica del medio,ÿ y en la reducción de la fototoxicidad inducida por la luz
fluorescente.¹ÿ El metabolismo celular del piruvato produce dióxido de carbono que se libera a la atmósfera y se convierte en bicarbonato. en el medio Se agrega piruvato de sodio
para dar una concentración final de 1 mM en la mayoría de los medios, pero se aumenta a 5 mM en el medio L-15 de Leibovitz principalmente para facilitar el uso en entornos
libres de COÿ.

Suplementos de medios
El medio de cultivo completo recomendado para algunas líneas celulares requiere la adición de componentes que aún no están disponibles en el medio base y el suero. Estos
componentes incluyen hormonas, factores de crecimiento y sustancias de señalización que sustentan la proliferación y mantienen el metabolismo celular normal.

Los suplementos generalmente se preparan como soluciones madre de 100x (o más) en un medio sin suero. Es posible que algunos suplementos deban disolverse en un solvente
antes de la dilución posterior en un medio sin suero hasta la concentración estándar. Las concentraciones de stock deben dividirse en alícuotas en pequeños volúmenes y
almacenarse a una temperatura adecuada; la mayoría de las concentraciones de stock se pueden almacenar a –80ºC, pero consulte con su proveedor antes de almacenar.

La adición de suplementos puede cambiar la osmolalidad final del medio de cultivo completo, lo que puede tener un efecto negativo sobre el crecimiento de las células en cultivo.
Lo mejor es volver a comprobar la osmolalidad del medio de cultivo completo después de añadir pequeños volúmenes de soluciones madre de suplemento; la osmolalidad óptima
para la mayoría de las líneas celulares de vertebrados debe estar entre 260 mOSM/kg y 320 mOSM/kg.

Después de que se hayan agregado suplementos a un medio base, la vida útil del medio de crecimiento completo debe determinarse caso por caso. Los medios completos que
contienen suplementos proteicos (p. ej., factor de crecimiento epidérmico, albúmina sérica bovina, etc.) tienden a degradarse más rápido que los medios básicos solos. La mayoría
de los medios de cultivo completos se pueden almacenar en alícuotas entre 2 °C y 8 °C durante aproximadamente un mes. Sin embargo, si se espera que algún suplemento
caduque antes de que haya pasado el período de un mes, la fecha de caducidad del medio de crecimiento completo debería seguir el mismo camino. Algunas líneas celulares
exigentes pueden requerir que los componentes se agreguen inmediatamente antes de su uso. No congele el medio de crecimiento completo. La congelación de los medios de
cultivo celular a –70 ºC o menos hace que algunos de los factores de crecimiento y/o vitaminas se precipiten fuera de la solución.
Puede ser muy difícil lograr que estos componentes vuelvan a la solución después de descongelarlos, incluso si se calientan a 37 °C. ATCC recomienda almacenar los medios
entre 2ºC y 8ºC, protegidos de la luz.

Para obtener información adicional sobre la preparación, el almacenamiento o el uso de suplementos específicos, comuníquese con su proveedor local o consulte la hoja de
información del producto del fabricante.

Osmolalidad
La osmolalidad de los medios de cultivo celular para la mayoría de las células de vertebrados se mantiene dentro de un rango estrecho de 260 mOsm/kg a 320 mOsm/kg, aunque
la mayoría de las líneas celulares establecidas tolerarán una variación bastante grande en la presión osmótica. Por el contrario, los requisitos de osmolalidad para algunas líneas
celulares de invertebrados quedan fuera de este rango. Por ejemplo, el embrión de caracol requiere un medio de alrededor de 155 mOsm/kg, mientras que algunas células de
insectos prefieren 360 mOsm/kg a 375 mOsm/kg. La mayoría de los medios líquidos disponibles en el mercado informan de la osmolalidad y es recomendable comprobar la
osmolalidad de cualquier medio después de añadir soluciones salinas, fármacos u hormonas disueltas en una solución ácida o básica, o grandes volúmenes de tampones (p. ej.,
HEPES).

Antibióticos y Antimicóticos
Se añaden antibióticos y/o agentes antimicóticos a los medios de cultivo celular como profiláctico para evitar la contaminación, como cura una vez que se encuentra la
contaminación, para inducir la expresión de proteínas recombinantes o para mantener la presión selectiva sobre las células transfectadas.

No se recomienda el uso rutinario de antibióticos o antimicóticos para cultivos celulares a menos que se requieran específicamente, como G418 para mantener la presión selectiva
sobre las células transfectadas. Los antibióticos pueden enmascarar la contaminación por micoplasma y bacterias resistentes. Además, pueden interferir con el metabolismo de las
células sensibles. Evite los antimicóticos ya que pueden ser tóxicos para muchas líneas celulares.

Si bien las líneas celulares pueden curarse de la contaminación microbiana con antibióticos y/o antimicóticos, esto no se recomienda a menos que la línea celular sea irremplazable;
el proceso es largo y no hay garantía de que se elimine la contaminación. Incluso si se elimina la contaminación , no hay forma de asegurar que la línea celular resultante tendrá
las mismas características que la inicial debido al estrés del tratamiento. Lo mejor es descartar la línea celular y comenzar de nuevo con nuevas existencias. La contaminación por
micoplasma en particular es muy difícil de eliminar. (Consulte la página 24) En algunos casos, el uso de antibióticos durante períodos breves puede servir como profiláctico valioso.
Por ejemplo, se recomienda el uso de antibióticos al desarrollar y trabajar con cultivos primarios y al utilizar la citometría de flujo para aislar subpoblaciones.

Si se utiliza un antibiótico en medio, se puede agregar solución de penicilina-estreptomicina (ATCC® 30-2300) de 0,5 a 1 mL de solución por 100 mL de medio de cultivo celular
para una concentración final de 50 a 100 UI/mL de penicilina y 50 a 100 µg/ml de estreptomicina. El sulfato de gentamicina, otro antibiótico, se usa en dosis de 50 a 100 µg/mL. El
antimicótico anfotericina B se usa a 2,5 µg/mL.¹³ Estas concentraciones se aplican a medios que contienen suero. Para medios sin suero, reduzca las concentraciones en al menos
un 50%.

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Sueros animales

Los sueros sirven como fuente de aminoácidos, proteínas, vitaminas (particularmente vitaminas liposolubles como A, D, E y K), carbohidratos, lípidos,
hormonas, factores de crecimiento, minerales y oligoelementos. Además, el suero amortigua el medio de cultivo, inactiva las enzimas proteolíticas,
aumenta la viscosidad del medio (lo que reduce la tensión de cizallamiento durante el pipeteo o la agitación) y acondiciona la superficie de crecimiento
del recipiente de cultivo. Se desconoce la composición exacta y varía de lote a lote, aunque la consistencia de lote a lote ha mejorado en los últimos años.

Los sueros de fuentes fetales y bovinas de ternera se usan comúnmente para apoyar el crecimiento de células en cultivo. El suero fetal es una fuente rica en factores de crecimiento y es
apropiado para la clonación celular y para el crecimiento de células exigentes. El suero de ternera, debido a sus menores propiedades promotoras del crecimiento , se utiliza en estudios de
inhibición por contacto con células NIH/3T3 (ATCC® CRL-1658™). A diferencia de los sueros fetales o de ternera, el suero de caballo se recolecta de una manada cerrada de animales adultos,
lo que garantiza la consistencia entre lotes. El suero de caballo tiene menos probabilidades de contener los contaminantes que se encuentran en los sueros bovinos, como virus, y es menos
probable que metabolice poliaminas que pueden ser mitogénicas para algunas células. Los sueros de caballos y terneros bovinos son menos costosos y están más disponibles que el suero
bovino fetal. El precio y la disponibilidad del suero fetal fluctúan considerablemente.

Desafortunadamente, los productos derivados naturalmente de fuentes bovinas pueden contener virus adventicios como el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el parvovirus bovino, el
adenovirus bovino y el virus de la lengua azul. Todos los proveedores acreditados prueban sus productos para detectar virus infecciosos mediante varios métodos, incluidos anticuerpos
fluorescentes, efecto citopático y hemadsorción. Estos productos también se analizan para los contaminantes microbianos estándar, como bacterias, hongos y micoplasma.

El BVDV, a diferencia de otros contaminantes virales, está presente en casi todo el suero bovino en niveles muy bajos, incluso cuando las pruebas para virus infecciosos son negativas.
Afortunadamente, muy pocas líneas celulares (excepto las de origen bovino) son susceptibles a este virus. Para las pocas líneas celulares sensibles, utilice sueros no bovinos o sueros bovinos
irradiados. Se analizaron varias líneas celulares de la ATCC para detectar contaminación por BVDV¹ÿ y los resultados de este estudio se indican en la descripción de la línea celular en el sitio
web. Los productos derivados de bovinos también pueden contener el agente responsable de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Desafortunadamente, no existe una prueba para
detectar la presencia de este agente y recomendamos encarecidamente que obtenga todos los productos bovinos (incluidos los sueros) de países no afectados por la EEB, como Estados
Unidos, Australia y Nueva Zelanda.

Hubo un tiempo en que el suero animal era una fuente importante de contaminación por micoplasma de las células de cultivo de tejidos. Sin embargo, casi todos los sueros hoy en día se filtran
a través de varios filtros de poro de 0,1 µm (o más pequeños) que eliminan eficazmente este organismo.

ATCC ofrece los siguientes tres tipos de sueros animales:

Suero bovino fetal (también conocido como ternero fetal) — ATCC® 30-2020

Suero bovino fetal calificado para células madre embrionarias — ATCC® SCRR-30-2020

Suero bovino de ternero suplementado con hierro — ATCC® 30-2030

Estos productos se prueban rigurosamente para detectar agentes infecciosos adventicios y se obtienen solo de rebaños de EE. UU. Además, cada lote se prueba para determinar su capacidad
para apoyar el crecimiento celular y es el mismo suero que se usa en los laboratorios de la ATCC.

Almacenamiento

Almacene los sueros a -20 °C o menos para almacenarlos durante 30 días. Los sueros ATCC se almacenan de forma rutinaria a -70 °C. No almacene los sueros a temperaturas superiores a
ÿ20 °C durante ningún período de tiempo. Evite las congelaciones y descongelaciones repetidas dispensando y almacenando en alícuotas.

descongelación

El siguiente procedimiento se utiliza para descongelar el suero:

1 Coloque el suero congelado en un refrigerador entre 2 °C y 8 °C durante la noche.

2 Coloque las botellas en un baño de agua a 37°C y agite suavemente de vez en cuando para mezclar los solutos que tienden a concentrarse en el fondo.
de la botella

No mantenga el suero a 37°C más tiempo del necesario para descongelarlo, y no descongele el suero a temperaturas más altas. Descongelar el suero en un baño a más de 40 °C sin mezclar
puede provocar la formación de un precipitado dentro de la botella.

Turbiedad y precipitados

Todos los sueros pueden retener algo de fibrinógeno. Debido a que los factores externos pueden iniciar la conversión de fibrinógeno en fibrina, se puede observar material floculento o turbidez
después de descongelar el suero. La presencia de este material no altera el desempeño del suero. Si le preocupa la presencia de material floculento o turbidez, se puede eliminar mediante
filtración a través de un filtro de 0,45 µm.

Se puede formar un precipitado en el suero cuando se incuba a 37 °C o más durante períodos prolongados de tiempo, lo que puede confundirse con contaminación microbiana. Este precipitado
puede incluir cristales de fosfato de calcio, pero no altera el desempeño del suero como complemento para el cultivo celular. La inactivación por calor de los sueros también puede causar la
formación de precipitados.

Inactivación por calor

La ATCC no usa rutinariamente suero inactivado por calor a menos que se requiera específicamente para una línea celular en particular. La inactivación por calor suele ser innecesaria y puede
ser perjudicial para el crecimiento de algunas células. Reducirá o destruirá los factores de crecimiento presentes en el suero.

La inactivación por calor se realizó originalmente para inactivar el complemento (un grupo de proteínas presentes en los sueros que forman parte de la respuesta inmunitaria), así como para
destruir los contaminantes del micoplasma. Hoy en día, la contaminación por micoplasma, si la hay, se elimina por filtración. La eliminación del complemento suele ser innecesaria, pero puede
ser importante al preparar o analizar virus o en pruebas de citotoxicidad. Según un estudio realizado por HyClone,¹ÿ calentar el suero a 37 °C inactiva los factores del complemento termolábiles.
Algunos tipos de líneas celulares crecen mejor en sueros activados por calor, como las células madre embrionarias¹ÿ y muchas líneas celulares de insectos.¹ÿ

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El siguiente procedimiento se puede utilizar para inactivar el suero con calor:

1 Descongelar suero.

2 Precaliente un baño de agua a 56°C. Use suficiente agua para sumergir la botella por encima del nivel del suero.

3 Mezcle el suero descongelado por inversión suave y colóquelo en el baño a 56°C. La temperatura del baño de agua bajará.

4 Cuando la temperatura del baño de agua vuelva a alcanzar los 56 °C, continúe calentando durante 30 minutos más. Mezclar suavemente cada 5
minutos para asegurar un calentamiento uniforme.

5 Retire el suero del baño de agua, enfríe rápidamente (el enfriamiento lento a veces puede revertir la inactivación de la actividad del complemento), y
almacenar a -20°C o menos.

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Recipientes de cultivo y superficies

Buques
Los recipientes de cultivo proporcionan una barrera contra la contaminación para
proteger los cultivos del ambiente externo mientras mantienen el ambiente interno
adecuado. Para las células dependientes del anclaje, los vasos proporcionan un
sustrato adecuado y consistente para la unión celular . Otras características de los
recipientes incluyen un fácil acceso a los cultivos y superficies de visualización
ópticamente claras.¹ÿ

Originalmente todos los recipientes de cultivo eran de vidrio. Los inconvenientes del vidrio
incluyen el peso pesado, el costo, la limpieza que requiere mucha mano de obra y la visualización
microscópica deficiente en comparación con el plástico. En la década de 1960, se desarrollaron
técnicas de tratamiento de superficies para el poliestireno, lo que permitió que los recipientes de plástico reemplazaran al vidrio para la mayoría de las aplicaciones de cultivo celular.

La siguiente información se centra en los recipientes de cultivo estándar utilizados por muchos investigadores. El equipo de cultivo a gran escala no está incluido.

Selección de la embarcación adecuada

Primero, haga coincidir las características de las células que se van a cultivar con las características de los diferentes sistemas de cultivo. Hay tres tipos básicos de cultivos
celulares:

Dependiente del anclaje, que debe adherirse a una superficie para crecer (por ejemplo, fibroblastos diploides humanos).
Independientes de anclaje, que crecen en suspensión (la mayoría de los cultivos de células derivadas de sangre).
Células que pueden crecer unidas o en suspensión (muchas líneas celulares transformadas como HeLa y BHK-21).

Comprenda los requisitos de crecimiento de los cultivos para ayudar a seleccionar el mejor sistema de cultivo. Hay cuatro sistemas básicos de cultivo:

Cultivos de monocapa estacionarios que crecen en matraces, placas y placas multipocillo sin perturbar. Estos son los sistemas de cultivo más fáciles de usar y requieren
la menor cantidad de equipo. Sin embargo, estos sistemas requieren mucha mano de obra para producir grandes cantidades de células.

Mover cultivos monocapa que se cultivan principalmente en botellas giratorias. Estos recipientes giran lentamente (aproximadamente de 0,5 rpm a 1 rpm) en bastidores o
tambores motorizados y se utilizan ampliamente para producir grandes cantidades de células. Las botellas giratorias emplean tecnología simple pero requieren una inversión
en el equipo adecuado.
Cultivos en suspensión estacionarios que crecen sin agitación en placas y matraces no tratados. Estos son mejores para cultivar pequeños volúmenes de células
independientes del anclaje que crecen mal en cultivos de suspensión agitados tradicionales.
Cultivos en suspensión en movimiento que se cultivan en recipientes agitados mecánicamente (matraces giratorios), biorreactores o fermentadores. Estos sistemas
son los más económicos en términos de espacio, mano de obra y medios; como resultado, los cultivos en suspensión agitada suelen ser el método elegido para producir
grandes volúmenes de células tanto en el laboratorio como en la industria. Muchas células dependientes del anclaje se pueden adaptar para crecer en microportadores para
aprovechar estos sistemas.

A continuación, decida si las células se cultivarán como un sistema abierto o como un sistema cerrado (vea la sección sobre bicarbonato de sodio, página 14).
Los platos de plástico de sistema abierto son menos costosos que los matraces de sistema cerrado, pero requieren incubadoras más costosas que puedan regular el COÿ y la
humedad en la atmósfera. Los sistemas cerrados brindan protección adicional contra la contaminación y tienen requisitos de incubadora más simples. Todos los platos y placas
multipocillos son sistemas abiertos. Todos los demás recipientes de cultivo se pueden usar en cualquiera de los modos dejando las tapas sueltas para un sistema abierto o
apretadas para un sistema cerrado. Las paredes de plástico de los recipientes de cultivo son ligeramente permeables al dióxido de carbono y al oxígeno, lo que permite un
intercambio de gases muy pequeño. Esto no es un problema en la mayoría de las aplicaciones de cultivo, pero puede interferir con los experimentos de anoxia o el almacenamiento
a largo plazo de los medios.¹ÿ Las tapas que permiten el intercambio de gases cuando la tapa está completamente apretada están disponibles para reducir las oportunidades de
derrames de matraces y contaminación en sistemas abiertos. .

El último paso es hacer coincidir el rendimiento celular deseado con un recipiente de cultivo de tamaño adecuado. Para cultivos monocapa, el rendimiento está limitado por el área
de superficie de crecimiento tratada. Aproximadamente 0,5 × 10ÿ células/cm² a 1 × 10ÿ células/cm² de superficie tratada es un rendimiento típico para líneas celulares de mamífero
continuas y confluentes. Para cultivos en suspensión, el rendimiento celular total está determinado por el volumen de trabajo del recipiente. En sistemas agitados, las
concentraciones de células pueden alcanzar fácilmente entre 1 × 10ÿ células/mL y 2 × 10ÿ células/mL de medio. Sin embargo, los rendimientos exactos deberán determinarse
empíricamente para cada línea celular. ATCC recomienda encarecidamente que las células se mantengan en la fase logarítmica de crecimiento y que no se les permita entrar en
la fase estacionaria. Las líneas celulares dependientes del anclaje se pasan o dividen de forma rutinaria antes de que alcancen la confluencia.

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Frascos

Alexis Carrel desarrolló los primeros frascos de vidrio en la década de 1920. Harry Earle desarrolló los matraces en T de vidrio rectangulares (también hexagonales) de cuello recto
más tradicionales en la década de 1940. Hoy en día, los matraces de plástico están disponibles con una variedad de áreas de cultivo, una variedad de formas y varios diseños de
cuello diferentes. La elección del diseño depende de las técnicas de cultivo celular utilizadas, así como de las preferencias personales. Los tamaños más comunes se enumeran a
continuación.

Descripción Área de crecimiento (cm²) Volumen de trabajo recomendado (ml) Rendimiento celular*

T-25 25 5 a 10 2,5 × 10ÿ

T-75 75 15 a 25 7,5 × 10ÿ

T-150 150 30 a 50 15.0 × 10ÿ

T-175 175 35 a 60 17,5 × 10ÿ

T-225 225 45 a 75 22,5 × 10ÿ

*Depende de la línea celular. Basado en una densidad de 1 × 10ÿ células/cm².

Placas de cultivo celular

Las placas de cultivo celular ofrecen la mejor economía y acceso a la superficie de crecimiento. Esto los convierte en los recipientes elegidos para la clonación u otras manipulaciones,
como el raspado, que requieren acceso directo a la monocapa celular. Deben usarse con incubadoras que controlen el COÿ y la humedad. La mayoría de los fabricantes ofrecen platos
en cuatro diámetros: 35 mm, 60 mm, 100 mm y 150 mm. Estos son diámetros nominales y pueden no ser el diámetro real de la superficie de crecimiento. Las placas de cultivo celular
están disponibles con superficies tratadas especialmente para el cultivo de células dependientes del anclaje o con superficies no tratadas (nativas) para el cultivo de cultivos en
suspensión donde no se desea la unión.

Descripción Área de crecimiento (cm²) Volumen de trabajo (ml) Rendimiento celular*

35 8 1a2 0,8 × 10ÿ

60 21 4a5 2.1 × 10ÿ

100 55 10 a 12 5,5 × 10ÿ

150 148 28 a 32 14,8 × 10ÿ

*Depende de la línea celular. Basado en una densidad de 1 × 10ÿ células/cm².

Placas multipocillo
Estos recipientes ampliamente utilizados se diseñaron originalmente para la titulación de virus, pero desde entonces se han vuelto populares en muchas otras aplicaciones,
especialmente en la producción de hibridomas, la detección de alto rendimiento y las pruebas de toxicidad. Las placas de múltiples pocillos ofrecen ahorros significativos en espacio,
medios y reactivos en comparación con el mismo número de placas. Son más cómodos de manejar, especialmente si se utilizan pipetas, lavadoras de placas, lectores y otros equipos
para procesar estas placas. Deben usarse con incubadoras que controlen la humedad y los niveles de COÿ.

Descripción Pozo de crecimiento (cm²) Volumen de trabajo/ pocillo (mL) Rendimiento celular*

96 pocillos 0.32 0,1 a 0,2 0,32 × 10ÿ

48 pocillos 1.00 0,3 a 0,6 0,8 × 10ÿ

24 pocillos 1.88 0,5 a 1,2 1.9 × 10ÿ

12 pozos 3.83 1,0 a 2,4 3,8 × 10ÿ

6-bien 9.40 2.0 a 3.0 9.5 × 10ÿ

*Depende de la línea celular. Basado en una densidad de 1 × 10ÿ células/cm².

Botellas de rodillos

La botella giratoria se desarrolló para cultivar un gran número de células dependientes del anclaje.²ÿ Hoy en día, proporcionan un medio más económico para cultivar grandes
volúmenes de células utilizando esencialmente las mismas técnicas de cultivo que con los matraces pero con una mano de obra considerablemente menor.
Además del diseño tradicional de paredes lisas, las botellas giratorias están disponibles con pequeñas crestas que aproximadamente duplican el área de superficie disponible para el
cultivo de células sin aumentar las dimensiones de las botellas.

Descripción Área de crecimiento (cm²) Volumen de trabajo (ml) Rendimiento celular*

Pequeña 490 100 a 150 4,9 × 10ÿ

Estándar 850 170 a 250 8,5 × 10ÿ

Farmacéutico 1750 340 a 500 17,5 × 10ÿ

*Depende de la línea celular. Basado en una densidad de 1 × 10ÿ células/cm².

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Recubrimientos de superficie y celdas alimentadoras

La mayoría de los trabajos de cultivo de tejidos utilizan recipientes de poliestireno

desechables. La superficie del recipiente se trata para volverla hidrófila (mojable). La
mayoría de las líneas celulares de la colección ATCC se cultivan en superficies de
plástico tratadas en platos, matraces o botellas giratorias. Dado que las propiedades
del plástico de cultivo de tejidos pueden variar entre los fabricantes, se debe evaluar la
capacidad de las muestras para apoyar el crecimiento y la propagación celular antes
de su uso. La ATCC utiliza habitualmente el sistema de cultivo celular totalmente
automatizado SelecT™ . Algunas líneas celulares exigentes requieren un tratamiento
adicional de la superficie de crecimiento antes de que se adhieran y proliferen. Las
técnicas más comunes incluyen recubrir la superficie con suero, colágeno, laminina,
gelatina (ATCC® PCS-999-027), poli-L-lisina o fibronectina.

Más allá de la simple unión, algunas células requieren un tratamiento de superficie

especializado para que puedan diferenciarse en formaciones más similares a tejidos. Por ejemplo, las células endoteliales formarán túbulos y las células neuronales extenderán
los procesos de neuritas cuando se cultiven en una superficie de proteínas de matriz extracelular (ECM) (ATCC® ACS-3035). Estas proteínas de la MEC se parecen mucho a la
membrana de la lámina basal que rodea las células en el tejido y no solo proporcionan puntos de unión, sino que modulan la transducción de señales de factores de crecimiento
y hormonas externos, influyen en la permeabilidad de iones y nutrientes y se “comunican” activamente con los procesos intracelulares a través de las integrinas. .

Finalmente, algunas células, particularmente cuando se siembran a bajas densidades como para la clonación, requieren el apoyo de células vivas. La mayoría de las células
son “más felices en una multitud”. Las células de la capa alimentadora abastecen a una multitud al acondicionar el medio a través de la fuga metabólica y/o la secreción activa
de crecimiento y otros factores. También proporcionan una matriz de soporte para la unión y proliferación celular. Para evitar que las células de la capa alimentadora crezcan
demasiado sobre las células de interés, se tratan para evitar la división. Los métodos comunes incluyen la irradiación con rayos X o rayos gamma o el tratamiento con mitomicina
C. Cada uno de estos tratamientos daña el ADN celular de modo que las células continúan metabolizándose pero ya no pueden proliferar.
ATCC ofrece una variedad de celdas alimentadoras bien caracterizadas.

ATCC® No. nombre del producto Descripción

CRL-2581™ C166 Células endoteliales embrionarias de ratón

CRL-2583™ C166–GFP Células endoteliales embrionarias de ratón con expresión de GFP

CRL-2749™ OP9 Células estromales de médula ósea embrionaria de ratón

55-X™ IRR-MRC-5 Células MRC-5 irradiadas (fibroblasto pulmonar diploide humano)

SCRC-1007™ AFT024 Fibroblastos de hígado embrionario de ratón

SCRC-1007.1™ AFT024 irradiado Fibroblastos de hígado embrionario de ratón irradiados

SCRC-1008™ MEF (C57BL/6) Fibroblastos embrionarios de ratón

SCRC-1008.1™ MEF (C57BL/6) TIR Fibroblastos embrionarios de ratón irradiados

SCRC-1040™ MEF (CF-1) Fibroblastos embrionarios de ratón

SCRC-1040.1™ MEF (CF-1) TIR Fibroblastos embrionarios de ratón irradiados

SCRC-1040.2a™ MEF (CF-1) MITC Fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina C

SCRC-1041™ HFF-1 Fibroblastos de prepucio humano

SCRC-1041.1™ TIR HFF-1 Fibroblastos de prepucio humano irradiados

SCRC-1045™ MEF (DR4) Fibroblastos de ratón resistentes a múltiples fármacos

SCRC-1049™ SNL76/7 Fibroblastos STO con resistencia a G418 y expresión endógena de LIF

SCRC-1050™ SNLP 76/7-4 Fibroblastos STO con resistencia a G418 y puromicina más expresión endógena de LIF

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crioconservación
La mayoría de los cultivos celulares se pueden almacenar durante muchos años, si no indefinidamente, a temperaturas inferiores a –130 °C (criopreservación).
ATCC ha recuperado células de cultivos criopreservados durante más de 40 años. Las numerosas ventajas de la crioconservación superan con creces la
inversión necesaria en equipos y reactivos. Estas ventajas incluyen:

Generación de reservas de seguridad para garantizar que no se pierda el cultivo por fallas en el equipo o contaminación por microorganismos u otras líneas celulares.

Eliminación del tiempo, la energía y los materiales necesarios para mantener los cultivos que no están en uso inmediato.
Preservación de células con duplicaciones de población finitas (que finalmente envejecerán).
Seguro contra la deriva fenotípica en el cultivo debido a inestabilidad genética y/o presión selectiva.
Crear un reactivo estándar que se utilizará para una serie de experimentos.

Visión general

A medida que la suspensión celular se enfría por debajo del punto de congelación, se forman cristales de hielo y aumenta la concentración de solutos en la suspensión.
El hielo intracelular se puede minimizar si se permite que el agua dentro de la celda escape por ósmosis durante el proceso de enfriamiento. Una velocidad de enfriamiento
lenta, generalmente –1 °C por minuto, facilita este proceso. Sin embargo, a medida que las células pierden agua, se reducen de tamaño y perderán rápidamente la viabilidad
si superan un volumen mínimo. La adición de agentes crioprotectores como glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO) mitigará estos efectos.

El procedimiento estándar para la crioconservación es congelar las células lentamente hasta que alcancen una temperatura inferior a –70 °C en un medio que incluya un
crioprotector. Los viales se transfieren a un congelador de nitrógeno líquido para mantenerlos a temperaturas inferiores a –130 °C.

La recuperación de las células crioconservadas es sencilla: las células se descongelan rápidamente en un baño de agua a 37 °C, se retiran del medio de congelación mediante
centrifugación suave y/o se diluyen con medio de crecimiento y se siembran en un recipiente de cultivo en medio de crecimiento completo.

Hay numerosos factores que afectan a la viabilidad de las células recuperadas. Modifique el procedimiento para cada línea celular para lograr una viabilidad celular óptima tras
la recuperación. Algunos de los parámetros críticos para la optimización incluyen la composición del medio de congelación, la fase de crecimiento del cultivo, la etapa de la
célula en el ciclo celular y el número y concentración de células dentro de la solución de congelación.

ATCC proporciona información sobre la crioconservación para todas las líneas celulares en la hoja de producto. La mayoría de las líneas celulares ATCC se congelan con un
medio de crioconservación que consiste en DMSO al 5 % y medio de crecimiento completo.

Congelar medio

El glicerol y el DMSO al 5% al 10% son los agentes crioprotectores más comunes. Si bien el DMSO puede ser tóxico para las células, las penetra mucho más rápido que el
glicerol y produce resultados más reproducibles. Desafortunadamente, el DMSO puede hacer que algunas células se diferencien (p. ej., células de promieloblastos HL-60) y
puede ser demasiado tóxico para algunas células (p. ej., células epiteliales pulmonares HBE4-E6/E7). En estos casos se debe utilizar glicerol.
El glicerol se puede esterilizar en autoclave, mientras que el DMSO debe esterilizarse por filtración. Se debe tener cuidado al manipular cualquier solución de DMSO, ya que
penetrará rápidamente en la piel intacta y puede llevar consigo contaminantes tóxicos.

Use solo DMSO o glicerol de grado reactivo (o mejor, como grado de cultivo celular). Almacene ambos en alícuotas protegidos de la luz. ATCC ofrece DMSO (ATCC® 4-X)
que se ha probado minuciosamente para su uso en cultivos celulares.

Para las células cultivadas en medio sin suero, la adición de medio acondicionado al 50 % (medio sin suero en el que las células crecieron durante 24 horas) tanto al medio de
congelación celular como al de recuperación puede mejorar la recuperación y la supervivencia. La adición de 10 % a 20 % de albúmina de suero bovino de grado de cultivo
celular al medio de congelación sin suero también puede aumentar la supervivencia después de la congelación.

También se han desarrollado medios de congelación sin suero. El medio de congelación de células sin suero ATCC® (ATCC® 30-2600) puede usarse tanto para células
cultivadas en medio de crecimiento suplementado con suero como para células cultivadas en condiciones sin suero. Esta fórmula patentada contiene un 10 % de DMSO y
metilcelulosa y es adecuada para la crioconservación de cultivos de células adherentes y en suspensión. Las células criopreservadas con medio de congelación sin suero
muestran niveles de viabilidad y porcentaje de unión (células adherentes) que son comparables a las células conservadas en DMSO y FBS. (Ver: Figura 3)

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Viabilidad Archivo adjunto

90% 120%
85%
83% 82%
80% 77%
75% 100% 100%
71% 100%
69% 92%
70% 66%
83%
60% 80%

50% 62%
60%
40%

30% 40%
33%

20% 22%
20%
10% 10%

0% 0%
CCL 163™ 3T3 CCL 81™ VERO CCL 23™ HEp-2 CCL 26™ BSC-1 CCL 163™ 3T3 CCL 81™ VERO CCL 23™ HEp-2C CCL 26™ BSC-1
Línea celular Línea celular

Medio de congelación de células sin suero Medio de congelación con FBS Medio de congelación de células sin suero Medio de congelación con FBS

Figura 3: Las células crioconservadas con el medio de congelación de células sin suero ATCC® muestran niveles de viabilidad y porcentaje de unión que son
comparables a las células conservadas en DMSO y FBS.

Otras variaciones de las formulaciones de medio de congelación incluyen concentraciones altas (hasta 90 %) de suero que, presumiblemente, proporciona algo de
protección criogénica, así como factores de crecimiento adicionales; uso de una solución salina balanceada diseñada para condiciones hipotérmicas en lugar de un medio
diseñado para incubación a 37 °C; y la adición de inhibidores apoptóticos que pueden prevenir la muerte celular de inicio tardío después de la recuperación.²¹ Las
formulaciones óptimas para líneas celulares individuales deben determinarse empíricamente.

Equipo
Viales de crioconservación
Hay dos materiales para elegir para viales de crioconservación: vidrio o plástico. Los viales de vidrio
son más difíciles de trabajar; deben esterilizarse antes de su uso, no vienen con etiquetas (la
información está impresa en el vidrio), deben sellarse con una llama caliente y pueden ser difíciles de
abrir. Sin embargo, se prefieren para el almacenamiento a largo plazo (muchos años) de cultivos
valiosos y se consideran a prueba de fallas una vez que se sellan correctamente. ATCC utiliza viales
de vidrio para el almacenamiento de semillas que se colocan en el nivel inferior del tanque de
nitrógeno líquido. Los viales de plástico se utilizan para el almacenamiento de existencias de distribución.

Los viales de plástico vienen en dos variedades: los que tienen rosca interna y junta de silicona y los que tienen
rosca externa. La versión de hilo interno fue la primera disponible comercialmente , pero tiene algunas desventajas
sobre la versión de hilo externo. Por ejemplo, si bien la junta de silicona proporciona un sello excelente, debe
apretarse a la perfección; demasiado apretado o demasiado flojo y el vial se derramará.

Cámaras de congelación de tasa controlada

Existen varios medios para lograr una velocidad de enfriamiento de –1 °C por minuto. Lo mejor es con una
unidad de congelación electrónica programable y controlada por computadora (como CryoMed Freeze) que
mantiene rigurosamente esta velocidad de enfriamiento. Este es el método utilizado exclusivamente en ATCC.
Este equipo es relativamente caro y absolutamente necesario solo para las células más sensibles.

Un enfoque menos costoso es colocar los viales de crioconservación en una cámara aislada y enfriar durante 24 horas en un congelador mecánico a –70 °C o menos. Hay
varias cámaras de congelación disponibles en el mercado que logran una velocidad de enfriamiento muy cercana al ideal –1 °C por minuto (Mr. Frosty, Nalgene® 5100-0001;
o StrataCooler®, Agilent Technologies 401349). Como alternativa, los viales se pueden colocar en una caja de poliestireno con paredes de 15 mm (3/4 de pulgada) de
espesor y una capacidad de 1 l empacada con papel, algodón o bolitas de espuma para aislamiento.

Almacenamiento en congelador de nitrógeno líquido

Las temperaturas ultrabajas (por debajo de –130 °C) requeridas para el

almacenamiento a largo plazo se pueden mantener mediante congeladores
eléctricos especializados o, más comúnmente, mediante congeladores de nitrógeno
líquido. Hay dos tipos básicos de sistemas de almacenamiento de nitrógeno líquido:
sumergir los viales en el líquido y mantener los viales en la fase de vapor sobre el
líquido. El sistema de fase líquida contiene más nitrógeno y, por lo tanto, requiere menos mantenimiento.
Sin embargo, siempre existe la posibilidad de que algo de líquido entre en viales
mal sellados que pueden explotar cuando se recuperan. Por esta razón, la ATCC
recomienda encarecidamente el almacenamiento en sistemas de fase de vapor.

Los sistemas de fase de vapor crean un gradiente de temperatura vertical

dentro del contenedor. La temperatura en el nitrógeno líquido en el fondo.

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será de –196 °C, mientras que la temperatura en la parte superior variará dependiendo de la cantidad de nitrógeno líquido en la parte inferior, así como del tiempo que se abra el recipiente. Para
garantizar el almacenamiento seguro de las células, asegúrese de mantener suficiente nitrógeno líquido en el recipiente para que la temperatura en la parte superior sea de -130 °C o menos. Todos
los sistemas de almacenamiento deben estar equipados con alarmas de temperatura.

Procedimiento de crioconservación
El siguiente procedimiento funcionará para la mayoría de los cultivos celulares y debe modificarse según sea necesario. Las formulaciones de medio congelado para todas las líneas celulares ATCC
se proporcionan en la hoja de producto. Cosecha de células en crecimiento exponencial.

1 Inmediatamente antes de la crioconservación, verifique su cultivo celular en busca de contaminación por bacterias, hongos, micoplasmas y virus (consulte Contaminación, página 28). En la
mayoría de los casos, los resultados de la detección de contaminación estarán disponibles algún tiempo después de que se criopreservaron los cultivos (10 a 14 días). Si se confirma la
contaminación, destruya el material congelado.

2 Prepare un medio de congelación compuesto por medio de crecimiento completo y DMSO al 5 % (ATCC® 4-X). No agregue DMSO sin diluir a una celda
suspensión como disolución de DMSO en soluciones acuosas emite calor.

3 Recoja las células mediante centrifugación suave (10 minutos a 125 × g) y vuelva a suspenderlas en el medio de congelación a una concentración de 1 ×
10ÿ a 5 × 10ÿ células viables/mL. Continúe manteniendo las células en cultivo hasta que se confirme la viabilidad de las células recuperadas (consulte el Paso 9).

4 Etiquete el número apropiado de viales con el nombre de la línea celular y la fecha. Luego, agregue de 1 a 1,8 ml de la suspensión celular a cada uno de los viales (dependiendo del volumen del
vial) y selle.

5 Deje que las células se equilibren en el medio de congelación a temperatura ambiente durante un mínimo de 15 minutos, pero no más de 40. Este tiempo suele emplearse para dispensar
alícuotas de la suspensión celular en los viales. Después de 40 minutos, la viabilidad celular puede disminuir debido al DMSO.

6 Coloque los viales en una cámara de congelación de velocidad controlada preenfriada (4 °C) y coloque la cámara en un congelador mecánico a –70 °C (o menos) durante al menos 24 horas.
Como alternativa, utilice una unidad de congelación programable preenfriada (4 °C) configurada para enfriar los viales a -1 °C por minuto hasta que se alcance una temperatura inferior a -40
°C y luego configurada para que baje abruptamente a -130 °C.

7 Transfiera rápidamente los viales a un congelador de nitrógeno líquido o de –130 °C. El material congelado se calentará a una velocidad de 10°C por minuto y las células
se deteriorará rápidamente si se calienta por encima de –50°C.
8 Registre la ubicación y los detalles de la congelación.

9 Después de 24 horas a –130 °C, retire un vial, restablezca las células en medio de cultivo y determine su viabilidad y esterilidad.

Recuperación de Células Criopreservadas

La solución de células en el vial congelado debe calentarse lo más rápido posible y luego combinarse inmediatamente con medio de cultivo completo y sembrarse en un matraz apropiado. Si bien las
células cultivadas en monocapas se pueden recuperar de la crioconservación en placas de múltiples pocillos, los resultados no son tan consistentes como con los matraces.

Algunas líneas celulares, como los cultivos de hibridomas, tardan varios días en recuperarse por completo de la criopreservación. Algunos hibridomas muestran baja viabilidad el primer día de cultivo
y generarán restos celulares. La viabilidad de la mayoría de las células disminuye y alcanza su punto más bajo a las 24 horas después de la descongelación. La mayor parte, si no todo, de esta
disminución parece deberse a la apoptosis (en oposición a la necrosis) inducida por el estrés del proceso de crioprensión.²² Después de este punto de tiempo, las células comienzan a recuperarse y
entran en un crecimiento exponencial.

1 Preparar un recipiente de cultivo (matraz T-75) de manera que contenga al menos 10 mL del medio de cultivo apropiado equilibrado para temple
temperatura y pH.

2 Retire el vial del congelador de nitrógeno líquido y descongélelo agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 °C (o un baño ajustado a la temperatura normal).
temperatura de crecimiento para esa línea celular). Descongele rápidamente hasta que los cristales de hielo se hayan derretido (aproximadamente 2 minutos).

3 Retire el vial del baño de agua y descontamine sumergiéndolo o rociándolo con etanol al 70 %. Siga estrictas condiciones asépticas
ciones en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar para todas las manipulaciones posteriores.

4 Desenrosque la parte superior del vial y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga estéril que contenga 9 ml de medio de cultivo completo.
Retire el agente crioprotector mediante centrifugación suave (10 minutos a 125 × g). Deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento blando, y vuelva a suspender
las células en 1 mL o 2 mL de medio de crecimiento completo. Pipetear suavemente para aflojar el sedimento y romper los grumos. (Si las células normalmente crecen como grupos, evite
pipetear en exceso durante la resuspensión). Transfiera la suspensión celular al medio en el recipiente de cultivo y mezcle bien.

5 Examine los cultivos después de 24 horas y realice subcultivos según sea necesario.

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Contaminación y Bioseguridad
La contaminación de las células en cultivo puede provenir de muchas fuentes, incluidas otras líneas celulares, reactivos, suministros como pipetas y recipientes de cultivo,
equipos como campanas e incubadoras de cultivo de tejidos y personal de laboratorio. Si bien el potencial de contaminación es constante, el riesgo puede reducirse o eliminarse
tomando las precauciones adecuadas: usando solo reactivos de calidad y esterilidad conocidas, poniendo en cuarentena las nuevas líneas celulares hasta que se compruebe
que no están contaminadas, realizando el mantenimiento y la limpieza de rutina de todo el equipo. y capacitar adecuadamente al personal de cultivo celular.

Compruebe si hay contaminación microbiana

Cuando ocurre la mayor parte de la contaminación bacteriana, generalmente ocurre dentro de unos pocos días y, por lo general, es evidente a simple vista. Distintos cambios
en el medio, como la turbidez, la presencia de partículas visibles en suspensión y una rápida disminución del pH (color amarillo, que indica acidez) son indicadores de
contaminación bacteriana. Las especies de bacterias fastidiosas que crecen muy lentamente pueden ser difíciles de detectar.

Los contaminantes fúngicos pueden o no provocar un cambio en el pH del medio y pueden distinguirse de las bacterias comprobando la presencia de estructuras filamentosas
en la suspensión. Las células de levadura son más grandes que las bacterias, pero es posible que no cambien apreciablemente el pH del medio y aparecerán como partículas
redondas u ovoides separadas. Los medios microbacterianos que se pueden usar para probar la contaminación bacteriana y fúngica incluyen agar sangre, caldo de tioglicolato,
caldo de soja tríptica, caldo BHI, caldo Sabouraud, caldo YM y caldo nutritivo con 2% de extracto de levadura.²³ Sin embargo, cierta contaminación microbiana no es aparente.
Por ejemplo, el uso de antibióticos puede suprimir el crecimiento bacteriano y así enmascarar la contaminación. Algunas infecciones virales no alteran la morfología de las
células, y la detección de contaminación por micoplasma requiere ensayos específicos.

Contaminación por micoplasma

Las líneas celulares se analizan en busca de contaminación por micoplasma mediante métodos directos (agarosa y caldo de cultivo) e indirectos (Hoechst).²ÿ,²ÿ Por ejemplo, la
tinción de ADN con fluorocromo Hoechst se unirá al ADN del micoplasma y los organismos se pueden detectar fácilmente cuando se examinan. usando un microscopio equipado
con la óptica de fluorescencia adecuada. El método de cultivo directo que requiere tanto caldo como agar permitirá el aislamiento de cepas cultivables, como lo demuestra la
aparición de colonias de micoplasma características en el medio de agar.

Tanto los métodos directos como los indirectos para la detección de micoplasmas se utilizan varias veces en la ATCC mientras se expande una línea celular para la preparación
de las existencias de muestras, semillas y distribución.

La mayoría de los laboratorios de cultivo celular han incorporado pruebas de micoplasma basadas en PCR, utilizando kits como el kit universal de detección de micoplasma de
ATCC (ATCC® 30-1012K) en sus operaciones de cultivo celular de rutina.

Los cultivos celulares se pueden enviar al Servicio de Pruebas de Micoplasma de la ATCC. Consulte la sección Servicios ATCC del sitio web para obtener más detalles.

Tinción Hoechst 33342 de un cultivo celular no contaminado. Tinción Hoechst 33342 de un cultivo celular contaminado.

Tratamiento de contaminación microbiana

La eliminación de la contaminación de una línea celular requiere mucho tiempo y no siempre funciona. Es preferible descartar el cultivo y empezar de nuevo.
Sin embargo, si las células son únicas e irremplazables, primero se debe identificar el contaminante y seleccionar un antibiótico adecuado para el tratamiento.
Lo mejor es probar el microbio contaminante para determinar su sensibilidad a los antibióticos antes del tratamiento; esto permite un tiempo de tratamiento más corto y limita la
exposición de la línea celular a reactivos potencialmente dañinos.

Las células se cultivan durante 1 a 2 semanas en presencia del antibiótico y luego se cultivan sin antibiótico durante 1 a 2 meses. En este punto, la línea debe volver a probarse
con un método de prueba muy sensible para asegurarse de que el cultivo esté limpio. Se deben realizar pruebas periódicas para asegurarse de que el contaminante no vuelva
a aparecer. Dado que los antibióticos pueden ser tóxicos para las células, puede resultar una población seleccionada que ya no exhibe las cualidades de la línea parental.
Puede ser necesario examinar el cultivo curado para determinar si es lo suficientemente similar a la línea original.

Contaminación cruzada celular

La contaminación cruzada de una línea celular con otra a veces puede llevar al reemplazo de la célula original con el contaminante, particularmente cuando el contaminante
crece más rápido que la línea original. Las células HeLa son quizás el ejemplo más famoso de una línea celular de contaminación cruzada que se hace pasar por la original y
luego se hace pasar por ella.

En las décadas de 1950 y 1960, muchas líneas continuas se contaminaron sin saberlo con otras líneas celulares, incluidas las células HeLa. En las décadas de 1970 y 1980,
una de cada tres líneas celulares depositadas en repositorios celulares eran impostores.²ÿ Esta contaminación cruzada solo se descubrió con el desarrollo de marcadores
genéticos adecuados a partir de 1967.²ÿ De hecho, varias líneas celulares "únicas" en la colección de ATCC convertida

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resultaron ser células HeLa después de un estudio adicional. A pesar de la confirmación de su origen celular HeLa, el análisis citogenético sugiere que existen diferencias entre estas
líneas celulares derivadas de HeLa. Varios de ellos poseen propiedades únicas. Sin embargo, estas líneas celulares no deben utilizarse como modelos funcionales de sus tejidos de
origen declarados.

Más recientemente, la ATCC y otros depósitos de células han utilizado polimorfismos de ADN además de polimorfismos enzimáticos, tipificación de HLA y cariotipificación para
confirmar la identidad de sus líneas celulares. Uno de los métodos más confiables para estudiar los polimorfismos de ADN es el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR)
mediante amplificación por PCR seguida de electroforesis capilar.²ÿ Los perfiles de STR para todas las líneas de células humanas ATCC están disponibles en el sitio web en las
descripciones del catálogo. (Ver: Figura 4)

Figura 4: Perfiles STR para dos líneas celulares humanas no relacionadas. Arriba: KU812E (ATCC® CRL-2100™). Abajo: MRC-5 (ATCC® CCL-171™). Los amplicones se
generaron con la plataforma PowerPlex® de Promega, se separaron mediante electroforesis capilar y se analizaron con el software GeneMapper® de Life Technologies.

Pruebe los cultivos celulares de forma regular para garantizar la ausencia de contaminación tanto de microorganismos como de otras líneas celulares. Si se encuentra contaminación,
deseche el cultivo y comience de nuevo con un nuevo caldo.

bioseguridad
La necesidad de precauciones al experimentar con células en cultivo depende de la fuente y la naturaleza del material biológico, el procedimiento experimental y las condiciones de
laboratorio/contención. Dado que cada situación es diferente, es necesario identificar los riesgos y tomar las precauciones adecuadas antes de comenzar cualquier trabajo.

Se puede encontrar más información sobre la evaluación de riesgos y las precauciones en la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, (BMBL) 6th Edition
del Centro para el Control de Enfermedades (CDC).²ÿ El texto de esta publicación está disponible en su totalidad en línea (https://
www.cdc.gov/labs/BMBL.html). En esta publicación se puede encontrar información sobre la evaluación del riesgo del agente y una descripción de los cuatro niveles de bioseguridad.

La ATCC asigna un nivel de bioseguridad (BSL) a cada línea celular con el fin de empaquetar para un envío seguro. Cuando se sabe que una línea celular contiene un agente
etiológico, la clasificación de la ATCC es al menos comparable al BSL asignado al agente por los CDC y, en algunos casos, la designación de la ATCC es más restrictiva. ATCC sigue
las pautas federales de bioseguridad y tiene en cuenta varios factores al evaluar el peligro potencial.

Nivel de bioseguridad 1
Líneas celulares de origen animal no incluidas en el Nivel de Bioseguridad 2

Nivel de bioseguridad 2

Líneas celulares que albergan micoplasma o cualquier otro agente BSL 2 (Ver: NOTA)
Líneas celulares expuestas o transformadas por un virus oncogénico de primates
Líneas celulares de primates que contienen virus

Líneas celulares que portan una parte de ciertos genomas virales, incluso si la célula no libera el virus completo³ÿ

Como receptor de una línea celular, tenga en cuenta no solo la naturaleza del material, sino también las manipulaciones empleadas durante su manipulación al evaluar el riesgo
potencial de laboratorio. Por ejemplo, los procedimientos que involucran grandes volúmenes de líneas celulares que contienen VIH o que incluyen la manipulación de VIH en alta
concentración deben realizarse en condiciones BSL 3.²ÿ No es posible examinar las líneas celulares para detectar la presencia de todos los agentes. Para mayor precaución, la

ATCC maneja todas las líneas celulares según las prácticas BSL 2, incluso aquellas clasificadas como BSL 1. Es prudente tratar todas las líneas celulares de mamíferos como
potencialmente peligrosas.

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Glosario
El siguiente glosario fue publicado originalmente por el Comité de Medio químicamente definido. Una solución nutritiva para el cultivo de células en la
Terminología de la Asociación de Cultivo de Tejidos en 1990.³¹ que cada componente es especificable e, idealmente, es de estructura química conocida.

Células o cultivos dependientes de anclaje. Células, o cultivos derivados de ellas,

que crecerán, sobrevivirán o mantendrán su función solo cuando estén adheridas a Clon. En la terminología de cultivo de células animales, una población de
una superficie como vidrio o plástico. El uso de este término no implica que las células células derivada de una sola célula por mitosis. Un clon no es necesariamente
sean normales o que no estén transformadas neoplásicamente. homogéneo y, por lo tanto, los términos clon y clonado no indican homogeneidad
en una población celular, genética o de otro tipo.

aneuploide. Situación en la que el núcleo de una célula no contiene un múltiplo Eficacia de la clonación. El porcentaje de células sembradas (sembradas,
exacto del número haploide de cromosomas, estando presente uno o más inoculadas ) que forman un clon. Uno debe estar seguro de que las colonias
cromosomas en mayor o menor número que el resto. Los cromosomas pueden formadas surgieron de células individuales para usar correctamente este término.
o no mostrar reordenamientos. (Ver eficiencia de formación de colonias.)

Eficacia formadora de colonias. El porcentaje de células sembradas (sembradas,

Técnica aséptica. Procedimientos utilizados para prevenir la introducción inoculadas) que forman una colonia.
de hongos, bacterias, virus, micoplasmas u otros microorganismos en
Inhibición por contacto de la locomoción. Un fenómeno que caracteriza
cultivos de células, tejidos y órganos. Aunque estos procedimientos se
ciertas células en las que dos células se encuentran, la actividad
utilizan para evitar la contaminación microbiana de los cultivos, también locomotora disminuye y se detiene el movimiento de avance de una célula
evitan la contaminación cruzada de los cultivos celulares.
sobre la superficie de la otra.
Eficacia del apego. El porcentaje de células sembradas (sembradas,
Cultivo celular continuo. Un cultivo que aparentemente es capaz de duplicar una
inoculadas ) que se adhieren a la superficie del recipiente de cultivo
cantidad ilimitada de poblaciones, a menudo denominado cultivo de células inmortales.
dentro de un período de tiempo específico. Deben indicarse siempre
Tales células pueden o no expresar las características de la transformación neoplásica
las condiciones en las que se hace tal determinación.
o maligna in vitro. (Véase también inmortalización.)
Célula autocrina. En animales, célula que produce hormonas, factores de crecimiento
u otras sustancias señalizadoras para las que también expresa los correspondientes
Crisis. Una etapa de la transformación in vitro de células. Se caracteriza por una
receptores. (Véase también endocrino y paracrino.)
proliferación reducida del cultivo, figuras mitóticas anormales, desprendimiento de
Cultivo de células. Término utilizado para indicar el mantenimiento o células del sustrato de cultivo y formación de células multinucleadas o gigantes. Durante
cultivo de células in vitro, incluido el cultivo de células individuales. En los esta degeneración cultural masiva, un pequeño número de colonias generalmente, pero
cultivos celulares, las células ya no se organizan en tejidos. no siempre, sobrevive y da lugar a un cultivo con una vida in vitro aparentemente
ilimitada . Este proceso se describió por primera vez en células humanas después de
Tiempo de generación de células. El intervalo entre divisiones consecutivas
la infección con un virus oncogénico (SV40). Véase también línea celular, transformación
de una célula. Este intervalo se puede determinar mejor, en la actualidad, con
in vitro y senescencia in vitro.
la ayuda de cinefotomicrografía. Este término no es sinónimo de tiempo de
duplicación de la población.
Criopreservación. Almacenamiento a temperatura ultrabaja de células, tejidos,
Hibridación celular. Fusión de dos o más células diferentes que embriones o semillas. Este almacenamiento se suele realizar a temperaturas inferiores
conducen a la formación de un sincarión. a –100°C.

Línea celular. Una línea celular surge de un cultivo primario en el momento del primer
Inhibición del crecimiento dependiente de la densidad. La inhibición
subcultivo exitoso. El término implica que los cultivos del mismo consisten en linajes de
mitótica se correlacionó con una mayor densidad celular.
células originalmente presentes en el cultivo primario.
Los términos finito o continuo se usan como prefijos si se conoce el estado de la cultura. Diferenciado. Células en cultivo que mantienen toda o gran parte de la
En caso contrario, bastará la línea de plazo. El término línea continua reemplaza el estructura y función especializadas típicas del tipo de célula in vivo.
término línea establecida. En cualquier descripción publicada de una cultura, uno debe
diploide. El estado de la célula en el que todos los cromosomas, excepto los
hacer todo lo posible por publicar la caracterización o historia de la cultura. Si ya se ha
cromosomas sexuales, son dos y son estructuralmente idénticos a los de la especie de
publicado, se debe hacer una referencia a la publicación original.
la que se derivó el cultivo.

Al obtener un cultivo de otro laboratorio, se debe mantener la designación adecuada Electroporación. Creación por medio de una corriente eléctrica de poros
del cultivo, como se nombró y describió originalmente, y cualquier desviación en el transitorios en el plasmalema normalmente con el propósito de introducir
cultivo del original se debe informar en cualquier publicación. material exógeno, especialmente ADN, del medio.

cultivo de embriones. Desarrollo o mantenimiento in vitro de

Cepa celular. Una cepa celular se deriva de un cultivo primario o de una línea celular embriones maduros o inmaduros aislados.
mediante la selección o clonación de células que tienen propiedades o marcadores
específicos. Al describir una cepa celular, deben definirse sus características específicas. embriogénesis. El proceso de iniciación y desarrollo embrionario.
Los términos finito o continuo deben usarse como prefijos si se conoce el estado de la
Célula endocrina. En los animales, célula que produce hormonas, factores de
cultura. Si no, el término cepa será suficiente. En cualquier descripción publicada de crecimiento u otras sustancias señalizadoras para las que las células diana, que
una cepa celular, se debe hacer todo lo posible por publicar la caracterización o la expresan los correspondientes receptores, se encuentran a distancia.
historia de la cepa. Si ya ha sido publicado, se debe hacer una referencia a la (Véase también autocrino o paracrino.)
publicación original. Al obtener un cultivo de otro laboratorio, se debe mantener la
designación adecuada del cultivo, como se describió y nombró originalmente , y
cualquier desviación en el cultivo del original se debe informar en cualquier publicación.

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De tipo epitelial. Parecido o característico de, o que tiene la forma Paracrino. En animales, una célula que produce hormonas, factores de
o apariencia de células epiteliales. Para definir una célula como crecimiento u otras sustancias señalizadoras para las cuales las células
célula epitelial, debe poseer características típicas de las células epiteliales.
diana, que expresan los correspondientes receptores, están situadas en su
A menudo, se puede estar seguro del origen histológico y/o la función de las vecindad , o en un grupo adyacente a ella. (Véase también autocrino y endocrino.)
células colocadas en cultivo y, en estas condiciones, se puede estar razonablemente
Paso. La transferencia o trasplante de células, con o sin dilución, de un
seguro de designar las células como epiteliales. El individuo que informa sobre
recipiente de cultivo a otro. Se entiende que cada vez que las células se
tales células debe usar tantos parámetros como sea posible al asignar este
transfieren de un recipiente a otro, una determinada porción de las células
término a una cultura. Hasta que sea posible una definición rigurosa, es más
puede perderse y, por lo tanto , puede producirse una dilución de las células,
correcto utilizar el término de tipo epitelial.
ya sea deliberada o no. Este término es sinónimo de subcultura.
Euploide. Situación en la que el núcleo de una célula contiene múltiplos exactos
del número haploide de cromosomas.
Número de pasaje. El número de veces que se han subcultivado o pasado las
Capa alimentadora. Una capa de células (generalmente irradiadas o tratadas con células del cultivo. En las descripciones de este proceso, se debe indicar la
mitomicina C ) que no se dividen pero son metabólicamente activas, sobre las proporción o dilución de las células para que se pueda determinar la "edad"
cuales se cultiva un tipo de célula exigente. cultural relativa .

Cultivo de células finitas. Una cultura que es capaz de solo un número Eficiencia de enchapado. Este término originalmente abarcaba los
limitado de duplicaciones de población después de lo cual la cultura deja términos eficiencia de unión, eficiencia de clonación y eficiencia de
de proliferar. (Ver senescencia in vitro). formación de colonias ; ahora es mejor usar uno o más de ellos en su lugar
porque el enchapado no es suficientemente descriptivo. (Consulte eficiencia
Heterocarionte. Célula que posee dos o más núcleos genéticamente diferentes
de unión , eficiencia de clonación y eficiencia de formación de colonias).
en un citoplasma común, generalmente derivado como resultado de la fusión de
célula a célula. Densidad de población. El número de células por unidad de área o volumen de
un recipiente de cultivo, o el número de células por unidad de volumen de medio
Heteroploide. Un cultivo cuyas células contienen un número de cromosomas
en un cultivo en suspensión.
diferente al número diploide. Este es un término que se usa solo para describir un
cultivo y no se usa para describir células individuales. Así, un cultivo heteroploide Nivel de duplicación de la población. Número total de duplicaciones de
sería aquel que contiene células aneuploides. la población de una línea o cepa celular desde su inicio in vitro. Este
término es sinónimo de tiempo de generación celular.
histiotípico. La semejanza in vitro de células en cultivo con un tejido en
forma, función o ambas. Por ejemplo, una suspensión de células similares Tiempo de duplicación de la población. El intervalo, calculado durante la fase
a fibroblastos puede secretar una matriz de glucosaminoglucano- logarítmica de crecimiento en la que las células se duplican en número; por
colágeno y el resultado es una estructura que se asemeja al tejido ejemplo, 1,0 x 10ÿ celdas aumentan a 2,0 x 10ÿ celdas. Este término no es
conectivo fibroso, que es, por lo tanto, histiotípica. Este término no debe sinónimo de tiempo de generación celular.
usarse junto con cultura. Por tanto, un sistema de cultivo de tejidos que
Cultura primaria. Un cultivo partía de células, tejidos u órganos tomados
demuestre la forma y la función típicas de las células in vivo se diría que es histiotípico.
directamente de organismos. Un cultivo primario puede considerarse como
Homocarion. Una célula que posee dos o más núcleos genéticamente tal hasta que se subcultiva con éxito por primera vez. Luego se convierte
idénticos en un citoplasma común, derivado como resultado de la fusión de en una línea celular.
célula a célula .
Pseudodiploide. La condición en la que el número de cromosomas en
Hibridoma. Célula que resulta de la fusión de una célula tumoral una célula es diploide pero, como resultado de los reordenamientos
productora de anticuerpos (mieloma) y una célula plasmática normal cromosómicos , el cariotipo es anormal y las relaciones de ligamiento
estimulada antigénicamente. Tales células se construyen porque pueden estar interrumpidas.
producen un solo anticuerpo dirigido contra el epítopo del antígeno
Densidad de saturación. El número máximo de células alcanzable, en condiciones
que estimuló la célula plasmática. Este anticuerpo se denomina
de cultivo específicas, en un recipiente de cultivo. Este término suele expresarse
anticuerpo monoclonal.
como el número de células por centímetro cuadrado en un cultivo monocapa o el
Inmortalización. El logro por un cultivo celular, ya sea por perturbación o número de células por centímetro cúbico en un cultivo en suspensión.
intrínsecamente, de los atributos de una línea celular continua. Una célula
inmortalizada no es necesariamente una que se transformó neoplásica o
malignamente.
Cultura de suspensión. Un tipo de cultura que crecerá y se
puede mantener sin adherirse a una superficie, como vidrio o plástico.
Senescencia in vitro. La incapacidad de un cultivo de células de vertebrados para
Transfección. La transferencia, con el propósito de integración genómica, de ADN
crecer más allá de un número finito de duplicaciones de población. Ni los cultivos
extraño a células en cultivo. El uso microbiológico tradicional de este término
de invertebrados ni de células vegetales exhiben esta propiedad.
implicaba que el ADN transferido se derivaba de un virus. La definición que se
Transformación in vitro. Un cambio heredable que ocurre en células en establece aquí describe la transferencia general de ADN independientemente de
cultivo, ya sea intrínsecamente o por tratamiento con carcinógenos su origen.
químicos, virus oncogénicos, irradiación, transfección con oncogenes, etc.,
Indiferenciado. Con células animales, este es el estado en el que
que conduce a la adquisición de propiedades morfológicas, antigénicas,
la célula en cultivo carece de la estructura y/o función especializada
neoplásicas, proliferativas u otras alteradas. . Esta expresión se distingue
del tipo de célula in vivo.
de la transformación neoplásica in vitro en que las alteraciones que se
producen en la población celular pueden no incluir siempre la capacidad de
las células para producir tumores en huéspedes apropiados. El tipo de
transformación siempre debe especificarse en cualquier descripción.

Cultivo de órganos. El mantenimiento o crecimiento de primordios de

órganos o la totalidad o partes de un órgano in vitro de manera que pueda
permitir la diferenciación y preservación de la arquitectura y/o función.

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Referencias
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labs/pdf/SF__19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf.

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Medios ATCC, sueros y reactivos

Tabla 1: Lista de productos de ATCC Media

ATCC® No. nombre del producto Volumen

30-2002 Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) 500ml

30-2006 DMEM:F12 medio (relación 1:1) 500ml

30-2003 Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) 500ml

30-2004 F12K Medio 500ml

46-X Medio Hybri-Care, en polvo Prepara 1L

30-2005 Medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) 500ml

30-2008 Medio L-15 de Leibovitz 500ml

30-2007 Medio 5A de McCoy, modificado 500ml

30-2001 RPMI-1640 Medio 500ml

Con la excepción del Medio L-15 de Leibovitz, los medios ATCC están formulados* para usarse con 5% de CO2. La cantidad de bicarbonato de sodio en cada medio oscila entre
1,2 g/L y 2,2 g/L (1,5 g/L es la concentración más común).
*
Consulte el sitio web de la ATCC para conocer las formulaciones de medios completas.

Tabla 2: Lista de productos de Animal Sera

ATCC® No. nombre del producto Volumen

30-2020 Suero bovino fetal 500ml

30-2021 Suero bovino fetal 100ml

SCRR-30-2020 Suero Fetal Bovino, Calificado ES* 500ml

30-2030 Suero bovino de ternera 500ml

30-2031 Suero bovino de ternera 100ml

* Calificado para células madre embrionarias humanas y de ratón.

Tabla 3: Lista de productos de suplementos y antibióticos

ATCC® No. nombre del producto Volumen

30-2214 Solución de L-Glutamina 100ml

PCS-999-002 Solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B 1,0 ml

30-2300 Solución de penicilina-estreptomicina 100ml

Tabla 4: Lista de productos de tampones, colorantes y reactivos de disociación

ATCC® No. nombre del producto Volumen

30-2103 Solución de disociación celular no enzimática 100ml

30-2104 Inhibidor de tripsina de soja Solución de tripsina 20ml

30-2101 al 0,25 %/EDTA 0,53 mM Tripsina-EDTA para 100ml

PCS-999-003 células primarias* 100ml

PCS-999-004 Solución neutralizante de tripsina 100ml

30-2200 Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)* 500ml

30-2213 Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)* 500ml

PCS-999-001 Fenol rojo 1,0 ml

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Tabla 5: Lista de productos de reactivos de crioconservación

ATCC® No. nombre del producto Volumen

4-X Dimetilsulfóxido (DMSO) 5 x 5 ml

30-2600 Medio de congelación de células sin suero 20 ml

Tabla 6: Lista de productos de suplementos y antibióticos

ATCC® No. nombre del producto Volumen

PCS-999-027 Solución de gelatina al 0,1 % 100ml

Tabla 7: Ensayos de proliferación celular y detección de micoplasma

ATCC® No. nombre del producto

30-1010K Ensayo de proliferación celular ATCC MTT

30-1011K Kit de ensayo de proliferación celular XTT

30-1012K Kit universal de detección de micoplasma

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comercial registrada de Promega Corporation. GeneMapper® es una marca registrada de Life Technologies Corporation.
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