WESTERN BLOT

El Western Blot es una técnica analítica usada para detectar una proteína especifica en un
extracto crudo, mediante el uso de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas producidas por
el sistema inmune de un animal (inmunoglobulinas) que son capaces de detectar proteínas
ajenas (antígenos) y unirse específicamente a ellas.

METODOLOGIA

El procedimiento comienza con una corrida electroforética en gel de poliacrilamida para

separar las proteínas de la muestra según el criterio del método utilizado (SDSPAGE con β-
mercaptoetanol o sin el, electroenfoque, electroforesis nativa, entre otros).

Luego, las proteínas ya separadas son transferidas a una membrana de nitrocelulosa que las
une con firmeza y en forma no especifica por difusión, aunque la más utilizada en la actualidad
es la electrotransferencia. Si se usa la difusión, una vez que las proteínas fueron separadas el
gel se recubre con una hoja de nitrocelulosa que a su vez se cubre con una capa gruesa de
toallas de papel y el ensamble entero se comprime con una placa pesada. En consecuencia, el
líquido en el gel se transfiere a través de la nitrocelulosa. La otra posibilidad es emplear la
electrotransferencia que se basa en aplicar una corriente eléctrica y la utilización de un
tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel a la membrana. Para ello se
apilan en forma de sándwich los siguientes elementos: esponja, papeles empapados con buffer
de transferencia, gel, membrana, papeles empapados con buffer y esponja, y luego se le aplica
una corriente eléctrica a todo el montaje para que las proteínas corran al polo positivo y se
atrapen en la membrana. Esta técnica es más rápida e involucra a una mayor cantidad de
proteínas que los otros métodos.

Una vez lograda la transferencia de la banda de proteínas a la membrana de nitrocelulosa por

alguno de los dos tipos de transferencia descriptos se corrobora el éxito de dicha transferencia
por tinción con algún colorante como el Panceau S que es fácil de remover.

Los sitios de adsorción de la nitrocelulosa no ocupados por proteínas se bloquean con una
proteína no específica como la caseína (proteína de la leche) para prevenir la adsorción no
específica de los anticuerpos que luego se incorporan. La membrana es sumergida en una
solución que contiene al anticuerpo específico primario que se asociara a la proteína de
interés. Luego de eliminar por lavado el exceso de anticuerpo primario la membrana se incuba
con un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico. Este segundo anticuerpo
esta acoplado de manera covalente a una enzima detectable con facilidad por métodos
espectrofotométricos. Este método se conoce como detección indirecta. Luego de eliminar el
exceso de anticuerpo secundario, la enzima acoplada al anticuerpo se detecta mediante una
reacción cromogenica en la membrana, lo que hace que aparezcan bandas coloreadas sobre la
nitrocelulosa en el lugar donde estaba la proteína de interés. De esta forma el experimentador
puede seguir el desarrollo de la enzima en cada banda de proteína. Otro de los métodos seria
la detección directa, que utiliza un anticuerpo primario ya marcado con una enzima o sonda
fluorescente permitiendo detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana.

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Todo procedimiento de Western Blot consta de 3 etapas (41): 1. Electroforesis: Es la

separación electroforética, de los componentes antigénicos de un determinado parásito en
geles de poliacrilamida, influenciados por un campo eléctrico externo. 2. Transferencia:
Inmovilización de proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa. 3. Blot: Reacción de la
muestra problema con el antígeno fijado en el papel de nitrocelulosa que contienen la
proteína del parásito mediante una ELISA.

3.4 METODOLOGÍA El Western Blot (Inmunoblot, EITB–ElectroInmunoTransferencia Blot) para

el antígeno recombinante rES33, se realizó de acuerdo a la descripción original (37).

3.4.1 ELECTROFORESIS: Los vidrios, los espaciadores y el tanque se lavaron con abundante
agua y detergente. Posteriormente se enjuagaron con agua destilada, se secaron y guardaron a
temperatura ambiente. El antígeno rES33 fue purificado en geles SDS-PAGE en gradiente 5-
22.5% (41) de la siguiente manera. Los geles se prepararon 4 horas antes, se lavaron y se
guardaron en refrigeración con 5 ml de agua destilada y se secaron con papel filtro.
Seguidamente se armaron las cámaras de electroforesis, acoplando 2 geles por cámara y se
colocó un peine en forma recta, para luego verter el stacking gel o gel de empacamiento
(donde el antígeno se alineará), dejando gelificar por lo menos 15 minutos. Para iniciar la
electroforesis se colocaron los geles en un tanque conteniendo buffer de electroforesis,
asegurándose que no haya flujo de buffer superior (upper) hacia el inferior (lower).
Previamente el antígeno recombinante rES33 fue tratado con SDS 1%, Azul de bromophenol
0.1%, Tris HCl 0.01 M, pH 8, y calentado a 65 ˚C por 15 minutos. Mediante el uso de una punta
de 100 µl de capacidad, se procedió a depositar cuidadosamente el antígeno a una
concentración de 0.1 g de proteína/mm de gel. En el pocillo del extremo de la cámara se
colocaron 3 µl del marcador de peso molecular o estándar. Posteriormente se conectó la
cámara de electroforesis a la fuente de poder a 200 V y 5 mA/gel, con el propósito de alinear el
antígeno en un tiempo aproximado de 5 minutos. Enseguida se subió a un amperaje de 20 a
25mA por gel para la resolución de las proteínas. El tiempo de electroforesis fue de 50
minutos. Una vez terminada se descartó el upper buffer y se guardó el lower buffer (este
último se puede usar hasta 6 veces), procediendo luego a la transferencia.

3.4.2 TRANSFERENCIA: La transferencia viene a ser el paso del antígeno del gel hacia el papel
de nitrocelulosa, por medio de la corriente eléctrica. Se debe tener todo el material limpio y
seco. Previamente se cortó papel de nitrocelulosa en rectángulos de 8.3 cm por 7 cm,
trazándose una raya a lo largo del papel a 0.5 cm aproximadamente del borde superior,
utilizando guantes y trabajando con cuidado para evitar la degradación de la proteína.
Adicionalmente se cortó papel filtro para transferencia 0.5 a 1 cm más grande que el papel de
nitrocelulosa. A continuación se colocó papel filtro en un recipiente con buffer de transferencia
para que se mantenga húmedo al igual que el papel de nitrocelulosa; se cogió el gel, se
descartó el stacking, y se colocó sobre el papel de nitrocelulosa, cuidando que el borde del gel
quede alineado con la raya trazada en el papel. Posteriormente se colocó otro papel filtro
encima y se siguió presionando en un solo sentido para conseguir la unión de los 4
componentes. A continuación se tomó este conjunto y se colocó en un sostenedor o rejilla
conteniendo una esponja y se presionó con la ayuda de un separador tratando de eliminar
cualquier burbuja que haya entre el gel y el papel. Se colocó otra esponja encima y se cerró la
rejilla. De esa manera se colocó el sostenedor en el tanque de transferencia cuidando que el
lado negro coincida con el electrodo negro para que la dirección de la corriente eléctrica sea
del gel al papel. Se colocó buffer de transferencia hasta dos centímetros antes del borde
superior, se cubrió el tanque con su tapa y se conectó a la fuente de poder. El voltaje máximo
fue de 200 V y 2A. Todo este sistema de transferencia se llevo a cabo a temperatura
controlada menor a 35 ˚C mediante el paso constante de agua fría. Luego de 2 horas de
transferencia se apagó la fuente poder, se recuperó el buffer de transferencia y se guardaron
los papeles de nitrocelulosa en buffer fosfosalino, PBS-Tween 20 al 0.3% en agitación por 12
horas en refrigeración. Luego los papeles de nitrocelulosa se lavaron en PBS solo, para eliminar
cualquier resto de gel o alguna cosa extraña antes de ser cortados en tiras de 3 mm. Se
tomaron dos tiras laterales como controles, las cuales fueron enfrentadas a un suero control
positivo a teniosis y un suero control negativo. El resto de tiras se colocaron en una bolsa y se
congelaron a -20 ˚C hasta el momento de ser utilizadas.

3.4.3 BLOT: Las tiras de nitrocelulosa fueron enfrentadas con sueros individuales de pacientes
a la dilución 1:50, 490 l de PBS-Tween 20 al 0.3% / 5% leche descremada más 10 l de suero. Las
placas fueron colocadas en un agitador bidireccional y se incubaron por toda la noche a 4 °C.
Después de transcurrida la incubación se procedió a lavar las tiras con PBS-Tween 20 al 0.3%
caliente a 40 ˚C tres veces, por 3 minutos cada uno. Luego se agregó 500 l del conjugado anti Ig
G humano marcado con peroxidasa, a la dilución 1:12000, diluído en PBSTween 20 al 0.3% y se
incubó a temperatura ambiente por dos horas. Se lavó igual que la primera vez, usando PBS-
Tween 20 al 0.3% frío por 3 veces y luego PBS a temperatura ambiente por 2 veces.
Finalmente, se preparó el cromógeno 3,3`-diaminobencidina (DAB) más peróxido de hidrógeno
y se agregó 500 l a cada canaleta por 10 minutos. Una vez que se observó la banda diagnóstica
específica en el control positivo, se lavaron las tiras con agua destilada por tres veces y se
colocaron en orden sobre una lámina transparente, alineándolas a la altura de la línea trazada
en el papel de nitrocelulosa, a ese nivel se pegaron con una cinta adhesiva, se dejaron secar y
se codificaron para la lectura respectiva.
Jiménez Chunga, J. A. (2006). Evaluación del Western Blot con el antígeno recombinante
reES33 para el diagnóstico de teniosis por Taenia solium.

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