U.T.

2 - EQUIPOS Y TÉCNICAS
DE VISUALIZACIÓN DE
MICROORGANISMOS

Tema 4: Microscopio óptico

 Introducción
◼ La microbiología requiere observar microorganismos
 Introducción

◼ Limitaciones del ojo humano:

◼ no puede enfocar los objetos a menos de 25cm de

distancia
◼ necesita que el ángulo entre objeto-ojo sea ≥ 1°

Esto significa que no podemos percibir objetos

menores de 0,1 mm.
Introducción
◼ Primeros microscopios:
◼ Fueron construidos, en el s. XVII, por Antonie van
Leeuwenhoek. Algunos llegaban a 300 aumentos y le
permitieron observar y describir muchos tipos de células
(espermatozoides, protozoos, ... ).
 Introducción
◼ Ventajas del microscopio:
◼ Permite amplificar mediante lentes
▪ Son lentes plano convexas que funcionan como un conjunto de
prismas. Cuando la luz incide sobre ellas se desvía hacia dentro,
convergiendo en un punto (punto focal de la lente) y a partir de
éste divergen creando una imagen aumentada e invertida.
Introducción
Las características ópticas de una lente:
◼ distancia focal de la lente (distancia entre el centro de
la lente y el punto focal)
◼ diámetro de la lente o luminosidad, que determina su
capacidad para recoger luz.
 Introducción
◼ Ventajas del microscopio:
◼ Crea contraste entre objeto-medio circundante -
para que se perciba con nitidez.
◼ Tiene poder de resolución - suficiente para que
percibamos diferenciados objetos muy próximos.
Introducción
Microscopio
óptico de
campo
luminoso
Elementos de un microscopio óptico
Microscopio óptico
◼ Para crear la imagen consta de tres
sistemas separados de lentes:
◼ Condensador - situado entre la fuente de luz y la
muestra, rectifica los rayos de luz en el plano del
microscopio.
◼ Objetivo - amplía la imagen del campo del
microscopio.
◼ Ocular - amplía más la imagen del objetivo y
permite que sea percibida por el ojo.
Microscopio óptico
Tanto la lente del ocular como la del objetivo están diseñadas
para reducir al mínimo los efectos ópticos inherentes:
◼ aberración esférica (no pueden enfocar a la vez todo el
campo del microscopio)
◼ y aberración cromática (producen irisaciones alrededor de
los objetos que están en el campo del microscopio).
Según el sistema de iluminación podemos diferenciar cinco tipos
de microscopios ópticos:
◼ De campo luminoso Estos tres son los más usados en microbiología
◼ De campo oscuro

◼ De contraste de fases

◼ De luz ultravioleta

◼ De fluorescencia
Microscopio óptico de campo luminoso

Se caracteriza porque el fondo está intensamente

iluminado y los objetos se perciben oscuros.
Permiten aumentos útiles de 1000x - 1200x
◼ En la estructura de un microscopio de campo luminoso
podemos diferenciar dos partes fundamentales y en cada
una de ellas diferentes componentes:
1. El soporte mecánico
2. La parte óptica
 Microscopio óptico de campo luminoso
El soporte mecánico- está formado por:
◼ PIE O BASE, que da estabilidad al
microscopio
◼ BRAZO, que articula con el pie.
◼ TUBO ÓPTICO, que lleva las lentes oculares
en la parte superior y los objetivos en una
pieza giratoria o revólver en la parte inferior.
◼ PLATINA, es la plataforma sobre la que se
colocan las preparaciones. Un carro móvil
permite desplazar el portaobjetos en sentido
transversal y vertical.
◼ MACROMÉTRICO y MICROMÉTRICO, son
tornillos de enfoque, mueven la platina hacia
arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace
de forma rápida (enfoque grosero) y el
micrométrico de forma lenta (enfoque fino).
Llevan incorporado un mando de bloqueo que
fija la platina a una determinada altura.
 Microscopio óptico de campo luminoso
La parte óptica- formado por:
◼ OCULARES –
◼ Microscopio monoculares: tiene un solo
ocular
◼ Microscopio binocular: dos oculares.
◼ Microscopios trioculares: incorporan un
tercer ocular que permite acoplar una
cámara fotográfica o de vídeo.
El aumento de la lente viene indicado en
cada uno de ellos: x8, x10, x12, ... Algunos
oculares incluyen una escala micrométrica
para medir los objetos. Los más utilizados
son:
◼ Oculares Huygens, consisten en dos
lentes simples (planoconvexas). No
poseen una corrección perfecta de los
colores ni del aplanamiento del campo.
◼ Oculares compensadores, son oculares
muy corregidos, para reducir aberraciones
cromáticas y de esfericidad del objetivo.
Microscopio óptico de campo luminoso
◼ OBJETIVOS - están situados en la base de una pieza giratoria
llamada revólver. Son sistemas de lentes que se clasifican según
su distancia de trabajo, que es la distancia entre el frente del
objetivo y la superficie superior del cubre o portaobjetos, cuando la
imagen está enfocada. Cada microscopio tiene varios objetivos de
distintos aumentos. los aumentos están indicados en la lente: 4x,
10x, 40x, 100x, ...
◼ Grabada sobre el objetivo hay información útil: nombre del fabricante,
nO de aumentos, apertura numérica y otras características
interesantes.
Microscopio óptico de campo luminoso
Inscripciones que llevan los objetivos
◼ Fabricante/Pa’s. Por ejemplo: Zeiss/West Germany
◼ Numero de serie.
◼ Aumentos y Apertura Numérica. Por ejemplo: 25/0,8
indica un objetivo con una potencia de 25 aumentos y una
apertura numérica de 0,8.
◼ Longitud de tubo/cubreobjetos. Por ejemplo: 170/0,17
indica que es un objetivo para un microscopio de tubo de
17 cm y que está corregido para ser utilizado con
cubreobjetos de un grosor de 0,17 mm.
La especificación 170/0 indica que está corregido para poder
observar preparaciones sin cubrir.
Cuando se encuentra la inscripción Korr se indica que el
objetivo puede regularse para diferentes grosores de
cubreobjetos
◼ Inmersión. La especificación Oil indica que se trata de un
objetivo que debe utilizarse con aceite de inmersión; W =
Inmersión en agua; Glyc: Inmersión en glicerina.
◼ Tipo y corrección. Si no llevan ninguna especificación es
que se trata de objetivos acromáticos. Denominaciones
frecuentes que pueden encontrarse son: PLAN = objetivo
planacromático;
Microscopio óptico de campo luminoso

Clasificación de los objetivos:

◼ Según su empleo:
◼ Secos: entre objetivo y objeto se interpone aire
◼ De Inmersión: entre objetivo y objeto se interpone un líquido
(normalmente aceite de cedro con un η=1,56)

La especificación Oil indica que se trata de un objetivo que debe utilizarse con aceite de
inmersión; W = Inmersión en agua; Glyc: Inmersión en glicerina.

◼ Según el tipo de lente:

◼ Acromáticos: eliminan la aberración cromática
◼ Planáticos: eliminan la aberración esférica
Si no llevan ninguna especificación es que se trata de objetivos acromáticos. Si aparece
PLAN = objetivo planacromático;
[Link]

◼ Aberración cromática

No corregida

Corregida acromáticos y apocromáticos

 [Link]

◼ Aberración esférica

Sin corrección

Con corrección
(Lente planática)
Microscopio óptico de campo luminoso

◼ CONDENSADOR - una o varias lentes que

dirigen la luz hacia la muestra.
◼ DIAFRAGMA - esta pieza permite crear contraste
entre la muestra observada y el medio que la
rodea. Regula la cantidad de luz que pasa a través
de la muestra y a través de las lentes del
microscopio. La apertura del diafragma se ha de
ajustar para cada muestra y cada aumento
aplicado.
◼ SISTEMA DE ILUMINACiÓN - pueden tener
una luz incorporada en la base o captar mediante
un espejo la luz ambiental o la de una lámpara.
Microscopio óptico de campo luminoso

PODER DE RESOLUCIÓN
◼ Se define como la capacidad de una lente para
mostrar dos objetos muy cercanos como distintos,
discretos y separados.
Microscopio óptico de campo luminoso

LÍMITE DE RESOLUCIÓN
◼ Se define como la menor distancia que pueden tener dos
puntos para ser distinguidos como dos entidades
independientes.

Límite de resolución y poder de resolución están

relacionados:
Cuanto más pequeño es el límite de resolución (d),
mayor es el poder de resolución y mayor el detalle con
el que se distingue una muestra.
Microscopio óptico de campo luminoso
LÍMITE DE RESOLUCIÓN
◼ Se define como la menor distancia que pueden tener dos
puntos para ser distinguidos como dos entidades
independientes.
◼ Para el ojo humano esta distancia es de 100 μm =0,1 mm
◼ Está definido por la ecuación de ABBE

 0,5 
d= = = AN
(ANobj+ ANcond) 2AN   sen Apertura Numérica

λ = longitud de onda de la fuente de luz (~ 450 nm)

α = mitad del ángulo de la lente del objetivo
η= índice de refracción del medio

Cuanto más pequeño es d, mayor es la resolución del microscopio y mayor

el detalle con el que se distingue una muestra
 [Link]

Microscopio óptico de d=
0,5
  sen
campo luminoso
APERTURA NUMÉRICA
Depende:
◼ Las características de la lente
(ángulo para el que puede captar radiación)

◼ El medio entre la muestra y el objeto

Veamos como cambia AN con el senα

Microscopio óptico de campo luminoso
ÍNDICE DE REFRACCIÓN
◼ AN = η.sen θ Veamos como cambia AN con el índice de refracción

En aire En aceite de inmersión

[Link]
Microscopio óptico de campo luminoso

ÍNDICE DE REFRACCIÓN de un medio: “η”

En el vacío, la luz se propaga a una velocidad de C=3,0x108 mientras que en
cualquier otro medio, se propaga más lentamente. Este cambio de velocidad se
traduce en un cambio de dirección del haz de luz. La relación entre “C” y la
velocidad de la luz en cualquier otro medio, se denomina índice de refracción de
ese material, representado como “n”.
Microscopio óptico de campo luminoso
Límite de resolución del microscopio depende de la AN del
condensador y la AN del objetivo:

 0,5 En el caso de que

= = AN obj y AN condr
2AN   sen fueran iguales

0, 61
d=
  sen AN obj
 Microscopio óptico de campo luminoso

◼ Otros conceptos útiles

en microscopía:

◼ Aumentos
◼ Profundidad de campo
◼ Distancia de trabajo
◼ Campo de visión

Espesor de la preparación enfocada

 Microscopio óptico de campo luminoso

◼ Otros conceptos útiles

distancia focal
en microscopía:
*

◼ Aumentos
◼ Profundidad de campo
◼ Distancia de trabajo
◼ Campo de visión

¡OJO! No confundir distancia de

trabajo dt con distancia focal *
Microscopio óptico de campo luminoso

◼ Tabla
OTROS MICROSCOPIOS ÓPTICOS
◼ De contraste de fases
◼ De campo oscuro
◼ Ultravioleta y de Fluorescencia
OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
◼ De contraste de fases
◼ Muy útil en el estudio de células vivas
◼ Consta de un sistema óptico que detecta como diferentes,
objetos con índices de refracción tan similares que no se
perciben como diferenciados en un microscopio luminoso. El
dispositivo de contraste de fases transforma las pequeñas
variaciones de densidad e índice de refracción, en distintas
luminosidades, permitiendo distinguir pequeños detalles
estructurales de las células.
◼ Se basa en el efecto de difracción que un medio con diferente
índice de refracción (nD) produce sobre una onda luminosa que
lo atraviesa.
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
◼ De contraste de fases
◼ Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la
onda luminosa varía en relación al índice de refracción de la
célula: la luz que pasa a través de una zona relativamente
gruesa o densa de la célula, como por ejemplo el núcleo, se
retrasa y su fase queda desplazada de forma
correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a
través de una región adyacente de citoplasma, más fina.

Resumen: Se basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz

al atravesar objetos de distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando
dichos retrasos
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
◼ De contraste de fases (continuación)
Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un
microscopio óptico de campo claro con algunas modificaciones,
como objetivos y condensadores especiales.

La luz procedente del condensador, al atravesar una muestra,

algunos rayos se desvían debido a variaciones en la densidad y el
índice de refracción de la muestra, retrasándose en casi 1/4 de
longitud de onda. Condensador de un
microscopio de
contrate de fases
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
Constitución del microscopio de
contraste de fase
Presenta dos elementos especiales:
Condensador anular que proyecta un
cono hueco de luz sobre la muestra.
Placa cambiadora de fase, disco óptico
especial situado en el objetivo.
Se suelen utilizar filtros de color para
mejorar la imagen.

Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes
claras de la imagen corresponden a porciones menos densas.
OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
◼ De contraste de fases
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS

◼ Nomarski ( De interferencia diferencial)

◼ Basada en los estudios de Georges
Nomarski de finales de los cincuenta.
◼ Utiliza las diferencias en los índices de
refracción y produce el contraste por
interferencia.
◼ El microscopio de Nomarski utiliza un
par de prismas, llamados prismas de
Wollaston, situados en los mismos sitios
que el microscopio de contraste de
fases. pero se diferencian en el sistema
mediante el cual se separan los rayos
interferentes.
◼ Mediante estos prismas se generan dos
ondas de luz polarizada plana en ángulo
recto una respecto a la otra. Una de ellas
pasa a través de la muestra, mientras que la
otra sirve de referencia y pasa por una zona
clara. Tras atravesar la muestra, las dos
ondas se combinan e interfieren entre si
formando la imagen
La microscopía de Nomarski produce una
imagen casi tridimensional con más detalle
que la microscopía de contraste de fases.

Se utiliza para visualizar microorganismos

vivos en tejidos animales, estructuras
como paredes celulares, gránulos,
vacuolas, núcleo de las eucariotas, etc.
OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
◼ De campo oscuro
◼ Gran aplicación en la observación de
especímenes no teñidos y en suspensión
líquida (preparaciones en húmedo)
◼ El campo de visión del objetivo se encuentra
en la zona hueca del cono de luz y sólo
recoge la luz que se refleja en el objeto.
◼ En esta técnica el fondo se percibe oscuro y
los objetos intensamente iluminados.
◼ Este efecto se consigue porque el aparato
incorpora un condensador especial.

Diafragma

Este condensador produce un hueco de luz de forma que

sólo entra en el objetivo la luz que procede de la muestra.
OTROS MICROSCOPIOS ÓPTICOS:
de Ultravioleta

De Ultravioleta
◼ La luz Ultravioleta (UV)- rayos luminosos de corta longitud de
onda (100-400 nm)- se utiliza para mejorar el poder de
resolución del microscopio óptico.

◼ Sin embargo, su escaso uso en microbiología deriva de dos

factores:
◼ que el vidrio es opaco a la radiación UV
◼ y que los rayos UV no son percibidos por el ojo humano,

Por lo cual, las lentes deben ser de cuarzo y la imagen ha de

registrarse mediante cámara fotográfica adecuada.
OTROS MICROSCOPIOS ÓPTICOS:
de Fluorescencia
De Fluorescencia
◼ Es una variante del microscopio anterior (utiliza luz ultravioleta) y en ellos sólo las lentes del
condensador son de cuarzo.
◼ Los microscopios descritos hasta ahora producen una imagen a partir de la luz que pasa a
través de un espécimen. Pero un objeto, también puede verse, cuando emite luz; ésta es la
base del microscopio de fluorescencia.
◼ Cuando algunas moléculas absorben energía radiante, quedan excitadas y posteriormente
liberan la energía atrapada en forma de luz, se denomina luz fluorescente. Cualquier luz
emitida por una molécula excitada tendrá una longitud de onda (de energía inferior) a la
radiación original absorbida. La luz fluorescente es emitida muy rápidamente por una
molécula excitada, ya que ésta tiende a recuperar un estado más estable liberando la
energía atrapada.
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS: de Fluorescencia
◼ El microscopio de fluorescencia expone un espécimen a luz
ultravioleta, y forma la imagen del objeto con la luz fluorescente
(visible) emitida por éste.
◼ Una lámpara de arco de vapor de mercurio u otra
fuente produce un rayo intenso; la transferencia de
calor debe limitarse con un filtro especial de
infrarrojos.
◼ La luz resultante pasa a través de un filtro de
excitación que transmite sólo la longitud de onda
deseada.
◼ Un condensador de campo oscuro crea un fondo
negro en el que los objetos fluorescentes brillan.
 OTROS MICROSCOPIOS
ÓPTICOS: de Fluorescencia
◼ Normalmente, las muestras se tiñen con moléculas
coloreadas, denominadas fluorocromos, que brillan
intensamente bajo la exposición de la luz de una
longitud de onda específica, pero algunos
microorganismos ya contienen dichas moléculas, por
lo que son autofluorescentes.

◼ El microscopio forma una imagen de los

microorganismos teñidos a partir de la luz que emiten.

◼ Un filtro de barrera colocado después de la lente del

objetivo elimina cualquier luz ultravioleta parásita
sobrante, que podría dañar los ojos del observador.
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
◼ Recordemos que la resolución de un microscopio óptico
aumenta al disminuir la longitud de onda de la luz empleada 0,5
para iluminar. Los haces de electrones actúan como una d =
fuente de radiación y pueden enfocarse al igual que la luz en   sen
un microscopio óptico. Si los electrones iluminan el
espécimen, la resolución del microscopio aumenta
considerablemente porque la longitud de onda de la radiación
es de aproximadamente 0.005 nm, aproximadamente 100.000
veces menor que la luz visible.

◼ Existen dos tipos de microscopios electrónicos de uso común:

◼ microscopio electrónico de transmisión (MET o TEM)
◼ microscopio electrónico de barrido (MEB o SEM)
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
De transmisión (MET)
◼ El microscopio electrónico de transmisión
tiene una resolución práctica de
aproximadamente 1000 veces superior a la
del microscopio óptico; incluso, con muchos
microscopios electrónicos se pueden
distinguir puntos separados por 5 A (0.5
nm), y el aumento eficaz es superior a
100.000x.
◼ Un microscopio electrónico de transmisión
moderno (MET) es complejo y sofisticado,
pero los principios básicos de su
funcionamiento pueden comprenderse
fácilmente.
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
De transmisión (MET)
◼ Un filamento de tungsteno calentado en un generador
de electrones, libera un haz de electrones que se enfoca
a continuación sobre la muestra mediante el
condensador.
◼ Como los electrones no pueden atravesar una lente de
vidrio, se emplean electroimanes con forma de «donut»,
denominados lentes magnéticas, para enfocar el haz.
◼ La columna que contiene las lentes y la muestra deben
estar en condiciones de vacío para obtener una imagen
clara porque los electrones se desvían al chocar con las
moléculas de aire.
◼ La muestra dispersa los electrones que pasan a su
través, y este haz se enfoca con lentes magnéticas para
formar una imagen aumentada y visible sobre una
pantalla fluorescente.
◼ Aquella zona de la muestra que sea más densa,
dispersará más electrones (densa a los electrones) y,
por ello, aparecerá más oscura en la imagen, pues
inciden menos electrones en ese área de la pantalla.
◼ Por el contrario, las zonas electrotransparentes
aparecen más claras.
◼ La pantalla puede desplazarse y capturar la imagen
sobre película fotográfica (microfotografía electrónica de
transmisión).
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
◼ De transmisión
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

◼ Las propiedades del MET limitan la naturaleza de las muestras que pueden
observarse, y los métodos para su preparación.
◼ Como los electrones se absorben y dispersan con bastante facilidad por la
materia sólida, solamente se pueden observar cortes extremadamente finos de
muestras microbianas. La muestra debe tener un grosor de 20 a 100 nm, y, al
mismo tiempo, debe ser capaz de mantener su estructura cuando se
bombardee con los electrones en alto vacío.
◼ Algunos de los métodos de preparación son:
◼ Inclusión en plástico, normalmente para revelar la estructura interna de
las células.
◼ Tinción negativa, para estudiar la estructura de virus, vesículas de gas
bacterianas, y otros materiales similares.
◼ Sombreado metálico, se cubre con una capa fina de platino u otro metal
pesado por evaporación, el área cubierta con metal dispersa electrones y
aparece brillante.
◼ Criofractura, permite visualizar la presencia y forma de orgánulos en el
interior de microorganismos
 Imágenes
Inclusión en plástico Tinción negativa Sombreado metálico

Criofractura
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO
◼ De transmisión (MET)
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
De Barrido (MEB)
◼ Los microscopios descritos anteriormente crean una imagen a
partir de la radiación que ha pasado a través de la muestra.
◼ Recientemente, se ha empleado el microscopio electrónico
de barrido (MEB) para estudiar superficies de microorganismos
con mayor detalle; normalmente, tienen una resolución de 7 nm
o inferior.
◼ El MEB se diferencia de otros microscopios electrónicos en que
produce una imagen a partir de electrones emitidos por la
superficie de un objeto, en lugar de a partir de electrones
transmitidos.
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
◼ El MEB realiza un escáner con un
estrecho haz de electrones, en forma de
prisma, de adelante hacia atrás sobre la
muestra.
◼ Cuando el haz incide sobre una zona
concreta de la muestra, los átomos de la
superficie emiten una nube tenue de
electrones denominados electrones
secundarios, que son atrapados por un
detector especial.
◼ Los electrones secundarios que entran en
el detector inciden sobre un centelleador,
causando la emisión por éste de
centelleos de luz que un fotomultiplicador
transforma en una corriente eléctrica y la
amplifica.
◼ La señal se envía a un tubo de rayos
catódicos y se produce una imagen como
en la pantalla de televisión, que puede
verse y fotografiarse.
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
◼ El número de electrones secundarios que alcanzan el detector depende de la
naturaleza de la superficie de muestra.
◼ Cuando el haz de electrones incide sobre un área elevada, entra en el detector un
número grande de electrones;
◼ por el contrario, pocos electrones podrán escapar una depresión o «valle»
llegando al detector.
◼ En consecuencia, las áreas elevadas aparecen más claras en la pantalla y las
depresiones, más oscuras. Se produce una imagen tridimensional realista de la
superficie de un microorganismo con una gran profundidad de campo. También
se puede examinar la localización real de los microorganismos in situ, en nichos
ecológicos, como la piel humana y la pared intestinal.
◼ La preparación de muestras es sencilla y en algunos casos, se puede examinar
directamente material secado al aire. Sin embargo, con mayor frecuencia, los
microorganismos deben primero fijarse, deshidratarse y secarse para conservar
la estructura de superficie y evitar el colapso de las células cuando se expongan
a alto vacío en el MEB. Antes de la observación, se montan las muestras secas y
se cubren con una capa fina de metal para evitar la formación de carga eléctrica
superficial, formándose una imagen de mayor calidad.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Imágenes
Esquema comparativo:
FIN