EQUIPOS, PRODUCTOS QUÍMICOS Y COLORANTES DE CALIDAD PARA EL

LABORATORIO

Deben comprobarse todos los equipos e instrumentos antes de comprarlos, a pesar que las
casas comerciales sean de reconocido prestigio.

Todos los equipos utilizados en el laboratorio deberán comprobarse periódicamente en

relación con su funcionamiento adecuado.

Todos los productos químicos deberán cumplir con las especificaciones de la American
Chemical Society, y deben tener la fecha en que se recibieron en el Laboratorio de
Procedimientos Histológicos y la fecha cuando se abrieron para su uso.

Tabla N° 2.- Fijadores a utilizar según la muestra a evaluarse.

Grasas Fibras Depósitos Cromatina

Fosfolípidos Amiloide Calcificaciones
neutras colágenas de hierro sexual
Formol
neutro al - - - - X X -
10%
Líquido de
- - X - - - -
Bouin
Alcohol - - - X X - X
Líquido de
- X - - - - -
Baker
Congelación X X - - - - -

Se deben usar productos químicos y colorantes de buena calidad en la preparación de

soluciones colorantes, soluciones buffer y reactivos. Éstos, una vez preparados, deben ser
apropiadamente identificados, y las etiquetas deben contener la siguiente información:

a.- Nombre del reactivo o solución colorante.

b.- Concentración del reactivo o solución colorante.

c.- Requerimiento de almacenamiento (medio ambiente o refrigeración).

d.- Iniciales de la persona que preparó el reactivo o solución colorante.

e.- Fecha de preparación.

f.- Expectativa de duración y fecha de expiración.

g.- Peligros potenciales del reactivo o solución colorante.

El agua usada en el laboratorio debe ser destilada para satisfacer los requerimientos señalados
en los métodos histológicos (p. ej., Impregnación Argéntica de Gomori), histoquímicos (p. ej.,
Reacción de P.A.S.) e inmunohistoquímicos. Es por eso que la unidad de destilación de agua
deberá comprobarse periódicamente para asegurar un funcionamiento adecuado; podemos
comprobar que nuestra agua es destilada agregando a una alícuota de ella unas gotas de
nitrato de plata al 10%, si se forma una nubécula quiere decir que no lo está.

En cuanto a la preparación de fijadores, tomaremos como ejemplo la solución de formol al

10%. Es importante que el pH de la solución de formol al 10% no caiga por debajo del valor 6,0.
Esta caída se atribuye a la formación de ácido fórmico y puede ser prevenida usando formol
neutro al 10% o formol tamponado. Cuando la solución está por debajo del pH 6,0, el ADN y
ARN se preservan pobremente, las fibras de reticulina son parcialmente hidrolizadas y los
glucosaminoglicanos ácidos se hacen más solubles. Como resultado, la coloración histoquímica
del verde metil-pironina, la impregnación argéntica de Gomori para reticulina y la reacción
histoquímica del hierro coloidal de Hale son pobres.

Deben registrarse los datos para preparar apropiadamente el formol neutro al 10% o el formol
tamponado. Se debe establecer definitivamente el volumen de formol comercial (37-40%), el
volumen de agua usada, así como los pesos de las sales amortiguadoras y el pH final. Si el
fijador se prepara en botellas de 10 o 20 galones, deben colocarse los datos respectivos en la
etiqueta de cada botella y cada cierto tiempo se revisará su pH.

En el caso de los reactivos, tomaremos como ejemplo el reactivo de Schiff, el cual debe ser
cuidadosamente preparado y reunir una serie de características que permitan confiar en los
resultados obtenidos. La base de este reactivo es el clorhidrato de p-rosanilina, que es un
componente de la fucsina básica, la cual debe ser de la mejor calidad.

Dentro de las recomendaciones tenemos:

a.- Evitar la disolución (ni aún con agua destilada), ya que ello lleva como consecuencia la
ruptura del equilibrio iónico del reactivo.

b.- Debe evitarse la pérdida del anhidrido sulfuroso, por esta razón el reactivo se almacena en
frascos pequeños completamente llenos y herméticamente cerrados, conservándolos en
refrigeración cuando no estén en uso.

c.- Evitar la aireación excesiva al tener los frascos del reactivo destapados o agitándolos
innecesariamente.
d.- Cuando el reactivo va a ser usado, debe sacarse con anticipación del refrigerador para que
tome la temperatura del medio ambiente, debe evitarse la elevación de la temperatura por
medios artificiales.

e.- La recoloración espontánea o la presencia de precipitados en el reactivo son signos

suficientes para desecharlo.

f.- Si después de la preparación del reactivo, éste conserva un color rosado, esto es debido a
que la p-rosanilina usada no es de buena calidad.

g.- El reactivo de Schiff se prueba tomando una alícuota de él, al que se le adiciona unas gotas
de formol; se formará entonces una solución de color rojo púrpura.

MANTENIMIENTO PREVENTIVO DE INSTRUMENTOS Y EQUIPOS

Todos los instrumentos y equipos eléctricos o mecánicos deben estar incluidos en un programa
preventivo de manutención que garantice el control de todas sus funciones a intervalos
prescritos. Ciertas partes operativas requieren una cierta dedicación a su mantenimiento (tales
como lubricación, cambio de bombillas y limpieza) en relación a obtener operaciones
adecuadas, seguras y para evitar pérdidas de tiempo. Por dar un ejemplo, recomendamos
acostumbrarse a limpiar el micrótomo luego de cada corte; los restos de los cortes se quitarán
con un paño humedecido con alcohol. Ello es especialmente válido para las guías. Luego de la
limpieza se aplicará el aceite especial para micrótomos (puede ser Aceite 3 en 1®) sobre las
guías. De esta manera quedará garantizado el movimiento fácil y uniforme del portacuchillas.
Además se recomienda limpiar de tiempo en tiempo las partes metálicas al descubierto con un
paño embebido en aceite. Solamente el cuidado meticuloso del micrótomo y sus cuchillas
garantiza el buen funcionamiento del instrumento.

Los fabricantes de instrumentos frecuentemente recomiendan todos los pasos que se deberán
seguir para realizar un programa de mantenimiento preventivo.

La Tabla N° 4 presenta una breve lista de algunos instrumentos y equipos de laboratorio, el

procedimiento para su control, y la frecuencia y los límites de tolerancia. El tecnólogo médico
debe vigilar que estas funciones sean llevadas a cabo, y es preciso que todos los datos sean
registrados en gráficos o cartillas de mantenimiento, de modo que las tendencias a las
desviaciones hacia arriba o abajo se puedan detectar de inmediato y puedan tomarse las
medidas correctivas apropiadas antes que se produzcan serios desperfectos.
EQUIPOS Y MATERIALES DE UN LABORATORIO DE ANATOMOPATOLOGÍA

· Tubos: forma cilíndrica, alargada, hay de distintos tipos: ensayo, hemólisis, centrifugado
(más duros), de fondo cónico o redondeado.

· Probetas: tubos altos cilíndricos base ensanchada, distintos tamaños y capacidades,

sirven para medir.

· Matraces: se utilizan para hacer disoluciones. Cada matraz tiene 1 cantidad determinada
no usar lugar almacén.

-Aforado: tiene aforo en el cuello, se utiliza para volúmenes exactos, fondo redondo o plano.

-Erlenmeyer: son más exactos que los aforados.

· Vasos de Precipitado: vaso con vertedor y escala orientativa de volúmenes, hay de

distintos tamaños.

· Portaobjetos: o portas pieza rectangular sirve para colocar muestras para observar al
microscopio puede tener en uno de sus extremos una banda mate para escribir con lápiz y
puede tener los bordes esmerilados.

· Cubreobjetos: Cuadrado o rectángulo mucho mas fino que se coloca encima de la

muestra situada sobre el porta hay distintos tamaños.

· Embudos: son recipientes cónicos que sirven para trasvasar líquidos de un recipiente a
otro y colocamos dentro un papel de filtro sirve como filtrador.

· Vidrio de Reloj: Recipientes algo cóncavos que se utilizan para tener sustancias sólidas y
pesarlas en la balanza ya que nunca se puede pesar directamente.

· Cristalizador o cubeta de tinción: sirve para poner a escurrir los portas ya teñidos

· Cubetas de tinción: son de forma rectangular y se utiliza para contener soluciones en

estas cubetas puede tener cestillos de tinción que contienen los portas y también pinzas para
sujetar los cestillos.

-Cubeta de Koplin: tiene hendiduras para introducir los portas (5 portas)

-Cubeta de Hellenbach: es lo mismo solo que para 8 portas.

· Pipetas: pueden ser aforadas o graduadas, sirven para tomar mediciones. Puede haber
de plástico también.

· Placas de Petri: están formadas por dos partes que se acoplan y sirven para contener
soluciones.

· Varillas agitadoras: son cilindros gruesos de cristal sirven para agitar disoluciones.

· Frascos lavadores

· Espátula: Material metálico de múltiples usos

· Escobillones
· Gradillas: Material de madera o de metal en el cual sirve para colocar los diferentes
tubos de ensayo

· Escurretubos

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

· Procesadores automáticos de tejido

· Micrótomo:

El micrótomo de rotación provoca el corte gracias a la transformación de un movimiento de

rotación en otro de ascenso y descenso de la portamuestras. En el movimiento de bajada
sobre la cuchilla se produce un acercamiento de la portamuestras hacia la cuchilla según el
grosor de corte seleccionado. En la portamuestras existe un sistema mecánico que permite
orientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos micrótomos la
cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse el ángulo de
ataque, es decir, el ángulo de la hoja de la cuchilla respecto a la superficie de la muestra. Con
el micrótomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento
del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos micrótomos el movimiento lo proporciona
directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posición del
bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte.

· Criostato:

Un criostato es un equipo diseñado para operar (en investigación generalmente realizamos

experimentos) a bajas temperaturas. En general hablamos de crio generador cuando el propio
equipo, mediante ciclos termodinámicos de compresión y expansión, es capaz de mantener un
gas o líquido criogénico frío en un circuito cerrado. Nos referimos a un criostato cuando el
sistema se enfría gracias a un líquido o gas criogénico generado en un sistema auxiliar
liquefactor.

· Teñidores automáticos:

El teñidor de tejidos HMS 70 de Myr ha sido desarrollado para realizar tinciones de rutina de
muestras histológicas y citológicas. Su sistema lineal y su diseño compacto proporciona una
gran facilidad de uso y una fiabilidad máxima

Capacidad de tinción para más de 70 portaobjetos, 16 cubetas de reactivo, una estación de

lavado y otra más calefactada para el secado. Fácil llenado de las cubetas al poderse retirar
fácilmente del instrumento. 20 programas de tinción individualizables por parte del cliente.
Cada programa puede almacenar hasta 50 pasos diferentes del proceso de tinción.

· Montador Automático:

Es un equipo que facilita el trabajo, para obtener mejores resultados, debido a que el equipo
prepara la muestra de tejido que se quiere analizar.
TECNICAS CITOLOGICAS CONVENCIONALES

· Centrifuga: Sistema Civagen Prepstain tripath imaging ( Vortex, Centrífuga Rotina 46,
Prepstain, Prep-mate):

AUTOPSIAS

· Mesa de autopsia.

· Mesa de disección

· Sierra oscilante con aspiración

· Balanza

TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

· Teñidores automáticos DAKO Autostainer link 48.

· Un teñidor automático DAKO Autostainer plus

· Congelador de – 80º.

PATOLOGÍA MOLECULAR.

· Termociclador Hybaid mod.

· Touchdown;

· Hybridizer Stat spin DAKO;

· Equipo OSNA para PCR de ganglio centinela de mama.

MICROSCOPÍA ÓPTICA

· Microscopios ópticos

Microscopio óptico. Es un microscopio basado en lentes ópticos. También se le conoce como

microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de
este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Aumenta el tamaño
de los objetos que son realmente muy pequeños y que no se pueden ver a simple vista, a su
vez puede ser monocular, binocular entre otros.

· Microscopios de fluorescencia

El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que

los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen
observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han
absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar
pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del
condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia
(vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.

· Microscopios multi cabezales con sistema de conservación

El BA400 estándar está equipado con un ángulo de observación ergonómico de 30º, con el
sistema de ajuste interpupilar Siedentopf [55-75mm] para adaptarse a diferentes usuarios.
Aunque el modelo estándar está a 30°, el usuario puede elegir qué tipo de cabezal desea para
el BA400; binocular, trinocular [20/80], y trinocular [0/100], lo que significa que es modulable
desde el principio. Añadiendo funcionalidad y confort, las lentes oculares alto-eyepoint del
BA400 permiten al usuario ajustarlo para el astigmatismo [±5°] mientras alinea una retícula sin
tener que pegar los ojos a las lentes oculares.

ANÁLISIS DE IMAGEN

· Sistema de análisis de imagen Leica Q-500, con microscopio Leica DMLS y cámara de 3
CCD. Este equipo depende de la Unidad de Investigación del Complejo Hospitalario pero es co-
utilizado por el Servicio de Anatomía Patológica.

MACRO Y MICROFOTOGRAFÍA

· Sistema Macropath para macrofotografía.

· Cámaras digitales para macroscopía (Nikon coolpix, 2 Nikon D200) con el software
necesario para la descarga y tratamiento de imágenes.

· Cámaras digitales para macrofotografía.

OTROS MATERIALES Y EQUIPOS

· Procesador Tisular:

Se puede usar como teñidor programado.

· Estación Caliente:

(menos importante) En la mayoría de los hospitales hay montadores automáticos. Se necesitan

campanas extractoras, las estufas (para eliminar principalmente la parafina) frigoríficos,
congelador, centrífugas, citocentrifugas (controlar las células), balanzas, agitador y placa
calefactora y también un peachímetro.

· Peachímetro:

Para las técnicas histológicas suelen ser suficientes con congeladores de hasta 30ºC. Para
bancos de muestras biológicas son necesarios congeladores de -70ºC y -80ºC o dispositivos de
nitrógeno líquido. Siempre estarán conectados a un grupo electrógeno para cuando se valla la
luz.

· Cuchillas de microtomo

· Bisturí: mango y hoja

· Pinzas de disección con dientes de ratón:

Pueden ser rectas o curvas y sus puntas son anchas, tiene una serie de estrías interiores para
retener y no apretar el tejido.

· Tijeras: de punta roma o mixta.

· Agujas histológicas

· Bandejas metálicas: sirven para hacer bloques con cassettes.

· Baño de flotación

· Estación de Tallado.

El estudio anatomopatológico de las piezas de biopsia y quirúrgicas en los laboratorios de

anatomía patológica comienza con la descripción macroscópica y la selección de las áreas
sobre las que se va a realizar el estudio microscópico, proceso conocido como “tallado”. Se
realiza en una mesa de tallado (estación, cabina, banco o campana) que básicamente consiste
en una superficie de trabajo que está acondicionada para evacuar los fluidos desprendidos
durante el proceso.

Bibliografía

· · Complejo hospitalario; Estructura y funcionamiento de la anatomía patológica

(2010), Disponible en:
http://www.chospab.es/publicaciones/protocolosEnfermeria/documentos/
5cad810c4f849a5f3c62e56635f32c01.pdf

· · ALAVA, E; Laboratorio de patología molecular; centro de investigación de cáncer

(2014); Disponible en: https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=15bf8bdf-
7d30-4f73-8a91-277de4e3018c&groupId=10157

· · Teñidor automático; citología e histología; España Especialidades medicas Myr. S.L.

Disponible en: http://myr.com.es/wp-content/uploads/catalogo_hms_70_es.pdf

· · Tecnicas histologivas; (2010); España; Atlas de Biologia; Disponible en:

http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4-mparafina.php

· · PASQUINI, g; Cristato-lobo5; (2013); Disponible en:

http://materias.df.uba.ar/labo5a2014c1/files/2013/02/Cri%C3%B3stato-Labo5.pdf
 LOS FIJADORES

INTRODUCCIÓN

El Laboratorio de Anatomía Patológica es un área donde se trabaja como mucha precaución y

sobre todo sin cometer errores ya que estos conllevarían un resultado que perjudicara al
paciente y en si al mismo profesional.

En el área de anatomía patológica se subdivide en fases que son:

La fase pre analítica-analítica-post analítica.

Dentro de la fase analítica se encuentra la sub área fijación la cual indicaremos cuales son los
tipos de fijadores con o sin formol con sus respectivas características utilizados en distintas
muestras de órganos.

Antes de la fijación tisular debemos de obtener la muestra. La extracción de esta constituye la

primera parte del estudio histológico; es el Anátomo Patólogo el que se pone en contacto con
el órgano que se vaya a estudiar. A ser posible se debe efectuar la extracción tomando un
fragmento de la lesión y una toma de los tejidos subyacentes. Su grosor no debe sobrepasar
los 5 mm.

La fijación tisular consiste en interrumpir los procesos degradativos que a parecen tras la
muerte celular es decir evitar la autolisis, tratando de conservar la morfología y composición
de los tejidos lo más próxima a la normalidad. La fijación debe ser inmediata (dentro del
minuto que sigue a la extracción del tejido).

La fijación proporciona una imagen estática:

Imagen real: es la imagen que tenía el tejido cuando estaba vivo-

Imagen equivalente: es el que se obtiene después de la manipulación y comprende la fijación,

inclusión, corte y coloración.

Se distinguen dos tipos de fijadores:

La fijación inicial o primaria: realizada de forma inmediata sobre el tejido fresco.

La refijacion o fijación secundaria: se realiza con un segundo fijador para algunas estructuras
especiales o simplemente para intensificar la fijación inicial.

LA FIJACIÓN

Los fijadores además de conservar intacta la estructura durante un espacio de tiempo más o
menos largo, paralizan todos los procesos orgánicos.

La fijación ideal se realiza entre 0ºC y 4ºC porque aunque el frío retarda la acción del fijador al
contraer la pieza, también paraliza la autolisis del tejido que será más o menos rápida
dependiendo por ejemplo los tejidos ricos en enzimas digestivas como el páncreas o aquellos
que tienen gran cantidad de gérmenes sufran la autolisis con mayor intensidad.

Las soluciones fijadoras tienen por objeto precipitar las proteínas, aumentar la consistencia de
los tejidos, inactivar las enzimas proteolíticas e inhibir el crecimiento bacteriano y por lo tanto,
preservar la constitución química y la morfología de los componentes titulares.
Cuando las piezas quirúrgicas son pequeñas o las muestras son obtenidas por aspiración —y de
no existir indicaciones de realizar “improntas”, frotis para citología, estudios
inmunohistoquímicos o de microscopía electrónica que requieran fijación especial— se
colocarán inmediatamente en formol buferado al 10% en una relación de 10 a 1
fijador/muestra. Para una mejor fijación las piezas no deben exceder de un espesor de 3 mm y
un tamaño de 3 x 2 cm

Principios generales de la fijación.

 No existe un método universal de fijación, por lo que un agente fijador para un tejido
no tiene por qué ser adecuado para otro.
 No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, porque fijación no equivale
a conservación tisular.
 Un defecto en la fijación nunca puede ser corregido.
 Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con grandes defectos de
fijación.

FIJADOR IDEAL CARACTERÍSTICAS:

 Prevenir la autólisis
 Preparar el tejido para el procesado posterior
 Prevenir el daño osmótico
 Preparar al tejido para la “tinción” posterior
 Endurecer el tejido para facilitar su fácil sección
 Prevenir al tejido de retracción y de rotura
 Hacer que los componentes tisulares resistan la extracción por el agua y los solventes
orgánicos
 Preservar el tejido en un estado similar al “estado vivo”.

CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA FIJACIÓN.

a) Elección del fijador

La solución fijadora a utilizar depende del estudio que se quiere realizar. Para las
preparaciones de tejidos y órganos, en las que interesan un estudio topográfico de los mismos,
deben usarse fijadores con un buen poder de penetración y de difusión. Para estos casos se
recomienda utilizar los líquidos de Zenker, Boüin o Helly: En caso contrario se empleará la
solución de formol al 10% ó 15% que permite obtener resultados satisfactorios. Líquido
considerado como el “fijador universal” pues facilita el empleo posterior de cualquier otro
fijador (postfijación) capaz de complementar su acción. se empleará la solución de formol al
10% ó 15% que permite obtener resultados satisfactorios. Líquido considerado como el
“fijador universal” pues facilita el empleo posterior de cualquier otro fijador (postfijación)
capaz de complementar su acción.

b) Tamaño de las muestras.

El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2 y con un
espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean fijadores con escaso poder de
penetración y de difusión. c) Volumen del fijador. Una proporción que es necesario emplear
será de 1 a 20 (muestra – fijador). Será la más adecuada para garantizar una buena fijación
d) Tiempo de fijación.

El tiempo en la fijación es importante en dos aspectos.

I. El intervalo que media entre la interrupción del aporte sanguíneo y la inmersión de

las muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que las muestras se fijen inmediatamente
después de obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia se efectúe al poco tiempo de
producida la muerte. Mientras más largo es este lapso, los procesos autolíticos que sufran los
tejidos serán más evidentes.

II. Debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecerán las muestras sumergidas en
los fijadores. Este tiempo varía con relación al tipo de fijador que se utiliza; al tamaño y la
naturaleza de la muestra y la temperatura de fijación. Por lo tanto los lapsos de fijación varían
en rangos muy amplios. En cualquier circunstancia, siempre deben respetarse los tiempos
recomendados para cada tipo de fijador para garantizar la conservación de una buena
estructura celular y tisular de los tejidos.

e) Temperatura de la fijación.

Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas ( 4o C.) dentro de un refrigerador y

con la solución fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de
fijación, pero disminuirá de manera notable la autólisis de los tejidos.

f) Almacenamiento de las muestras.

En ciertos casos los tejidos fijados no necesitan ser procesados inmediatamente para
aplicarles otros pasos de la técnica histológica. Por lo tanto es conveniente almacenar y
conservar los tejidos fijados para un uso posterior. Después de eliminar el fijador mediante un
“lavado”, se guardan en una solución de alcohol al 70%. Así los tejidos pueden guardarse por
un tiempo bastante largo sin que sufran modificaciones morfológicas notorias.

g) Lavado de las muestras fijadas.

Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al
lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan
demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e
impidan una adecuada obtención de secciones delgadas o la coloración correcta de sus
componentes celulares.

TIPOS DE FIJADORES

Clases de fijadores según su mecanismo de acción

FÍSICOS:

Congelación: Se utiliza como método para la fijación el enfriamiento por congelación del tejido
es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se
requiere conservar intacta la estructura antígena del tejido o su contenido enzimático. La clave
para una correcta fijación por congelación del tejido es que su realización sea instantánea
porque un enfriamiento lento provoca la formación de micro cristales titulares de hielo que
pueden agregarse con el paso del tiempo produciendo roturas titulares que dificulten el
diagnostico-
El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar ISOPENTANO a
menos de 50ºC como agente de congelación y realizar una fragmentación suficiente de la
muestra que se vaya a congelar.

Normalmente se preparan bloques de no más de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm de

espesor de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera más de 10 segundos.
El mantenimiento continuo de isopentano debe realizarse en un congelador programado a -
70ºC para que quede compensado la subida inmediata de la temperatura que se produce al
extraer el líquido del congelador.

Al enfriar tanto no actúan bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos tejidos
utilizamos el micrótomo de congelación o un aparato más evolucionado o criostato el cual
tiene como ventajas que la temperatura se mantiene más baja y se pueden realizar cortes más
finos entre 2 y 15 micras.

Criodesecación o filiación: Consiste en someter al tejido a dos procesos el primero es la fijación

instantánea por congelación en Nitrógeno líquido y el segundo desecación por sublimación
directa del agua confiada a vapor en una bomba de vacío es un proceso complicado y costoso
pero tiene una ventaja muy importante y es que al eliminar totalmente el agua tisular, paraliza
la autolisis y produce una conservación indefinida, además evita que se produzcan enlaces
químicos entre el tejido y el fijador, conservando asila estructura antigénica tisular.

Criosustitución: es la sustitución lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un

líquido fijador que en ocasiones puede actuar simultáneamente como medio de inclusión. Tras
la congelación instantánea del tejido con nitrógeno liquido o isopentano a -50ºC se coloca el
tejido congelado en el medio de sustitución, este medio está formado por una mezcla de
alcohol etílico, acetona y propilén- glicol. Enfriado a -40ºC, el intercambio del agua tisular por
el líquido de sustitución, se realiza dentro de un congelador y debe procurarse que la
temperatura no disminuya del punto de congelación del líquido de sustitución.

QUÍMICOS

FIJADORES QUE ACTÚAN POR RETICULARIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

El proceso que denominamos reticularización de las proteínas sobreviene cuando la

desnaturalización de éstas moléculas de se produce no por precipitación, sino porque el
agente que provoca el fenómeno induce la rotura masiva de los puentes de Hidrógeno
determinantes de la estructura helicoidal de las moléculas proteicas, con la formación
posterior de una malla reticular polipeptídica por asociación química entre los grupos activos
desenmascarados por el líquido fijador.

Entre los principales fijadores tenemos:

Formaldehído o formol: Es gaseoso en estado puro, se vuelve liquido a 21ºC, es tóxico y con un
olor característico. Se disuelve fácilmente en agua y en éste estado en concentraciones entre
35-40% y estabilizado con metanol se denomina formalina pura o formol con la acción del frío
la formalina pura tiende a precipitar y esta situación suele ser reversible añadiendo unas gotas
de NaOH y concentrando la mezcla. Como agente fijador el formaldehído se emplea a una
concentración del 4% pero como se parte de una solución de formalina ésta concentración se
obtiene diluyendo una parte de ésta de la formalina en 9 de agua en formación salina o
tampón.
Ventajas: Es el fijador más barato que existe por lo tanto es de elección para los trabajos de
rutina en Anatomía patológica.

ü Es un buen fijador único que determina una moderado conversación de la estructura tisular.

ü Por ser buen desinfectante y no endurecer excesivamente los tejidos, es un medio óptimo
para conversar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas.

ü Provoca escasa retracción tisular

ü Posee una velocidad de penetración intermedia entre la de los alcoholes y la del sublimado

ü Tiene aproximadamente una velocidad de un milímetro por hora apenas altera la coloración
tisular, por eso es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas.

ü Es excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general y se emplea como agente
de elección para fijar el tejido nervioso y en general antes de cualquier impregnación
argéntica.

ü El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado sin graves inconvenientes

modificando la temperatura, así a temperatura ambiente se consigue un fijador completa a
partir de las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas. Por este motivo la
formalina es un fijador de elección cuando se emplean hornos de microondas en técnicas de
histotecnología.

ü Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan rutinariamente en

Anatomía patológica.

Inconvenientes:

ü Produce abundantes vapores de carácter irritante sobre la conjuntiva y mucosa nasal.

ü Por acción de la luz y del oxígeno atmosférico se transforma progresivamente en ácido

fórmico y ésta sustancia tiene la propiedad de disolver rápidamente la cromatina nuclear por
eso con el paso del tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto fantasma para evitar este
inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos o emplearse en forma de solución
neutra o tamponado.

ü Posee una relativa capacidad de fijación sobre las proteínas, los pigmentos que contienen
hierro y los derivados de la bilirrubina, a éstos últimos les da una coloración verdosa.

ü Tras la utilización prolongada de formalina debido a que se convierte en ácido fórmico

confiere a las piezas un tinte grisáceo y en tejidos que tienen mucha sangre da origen a un
pigmento formólico que es negro o pardo oscuro que precipita en aglomeraciones irregulares
sobre estructuras preexistentes. Este pigmento se puede eliminar sumergiendo los cortes en
alcohol absoluto saturado con acido pícrico compuesta por 10, 12 gramos de pícrico en alcohol
etílico al 95-100% durante 5 minutos. O bien podemos sumergirlo en alcohol amonacal que es
el de 1 a 5 partes de hidróxido amónico en 95 a 99 de alcohol etílico al 70%. En este caso se
tratan los cortes durante 15 minutos, seguidos de dos baños de agua destilada y después otro
de alcohol al 70% de 5 minutos de duración cada uno.

Soluciones fijadoras simples que contienen formol: hay 4 tipos:

Formol salino: Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de
disoluciones de formaldehído en agua destilada y se prepara disolviendo 9 gramos de cloruro
sódico en 1000 mililitros de formalina al 10%.

Formalina neutra: Se prepara añadiendo a la solución de formalina al 10% una pequeña

cantidad de carbonato cálcico insoluble que queda depositado en el fondo del recipiente
neutraliza esta sal el exceso de acido fórmico que se produce y aunque puede utilizarse
todavía para la formación de tejidos en la práctica ha sido desplazada por las soluciones
tamponadas.

Formol tamponado: Es la solución más empleada hoy en día para prevenir el choque osmótico
que provoca la disolución de formalina en agua destilada y el depósito de pigmento formólico
que ocurre a un pH inferior a 6. Se prepara de la siguiente manera, como amortiguador se
emplea el tapón fosfato calibrado con pH de 7.0 a 7.2 de la siguiente fórmula:

ü FORMALINA PURA…………………………………..100.0 ml.

ü FOSFATO SÓDICO MONOBÁSICO…………………….4.0 gr.

ü FOSFATO SÓDICO DIBÁSICO (ANHIDRO**)……..….6.5 gr.

ü AGUA DESTILADA………………………………...….900.0 gr.

Se emplea fundamentalmente para fijar tejidos nerviosos en la preparación de algunas

técnicas de impregnación argéntica. Y se prepara añadiendo una parte de ácido acético glacial
a 9 partes de formalina al 10% con ello se consigue un pH en torno a 2.

* 4gr: no tiene agua, cogemos 3.5gramos si no pone nada en el bote cogemos 4 gramos.

Formol cálcico o solución de Baker: Se emplea como fijador de elección en algunas técnicas de
histoenzimología y se prepara añadiendo cloruro cálcico al 1% a una solución de formalina
neutra o tamponada al 10%
Fijadores en el laboratorio de anatomía patológica

Es un requisito previo la fijación de los frotis, biopsias o piezas quirúrgicas con el

objetivo de preservar la estructura celular y preservar los detalles, con un mínimo de
distorsiones y artefactos.

Las soluciones que se utilizan para este fin se denominan “fijadores” y su elección
depende del material que será examinado, de lo que se pretende estudiar y de la técnica de
tinción que se utilizará.

a) Para los exámenes citológicos:

• Alcohol absoluto o alcohol al 95 %;

• Solución fijadora líquida a base de polietilenglicol y

alcohol al 95 %, en forma líquida, para uso en “gotas” o

spray.

Se recomienda que:

• La fijación se realice de forma rápida y adecuada, para evitar el secado con distorsión celular
y la pérdida de afinidad del tinte. El tiempo de fijación varía, en promedio, de 10 a 60 minutos.
Sin embargo, la muestra puede permanecer en la solución fijadora durante unos días sin sufrir
daños;

• Los fijadores deben filtrarse y renovarse periódicamente;

• Use, de preferencia, etanol;

• Los frotis deben estar completamente sumergidos en el recipiente que contiene las
soluciones fijadoras.
 Cuando los frotis presentan una fijación defectuosa, por ejemplo, se secan, la
corrección debe realizarse siguiendo las siguientes pautas:

• Coloque la lámina en un recipiente que contenga glicerina y agua destilada durante 3

minutos; luego báñela en alcohol al 95 % y en agua durante 15 minutos

Finalmente,fíjelo en alcohol al 95 % durante 10 minutos. Envíelo para la tinción.

b) Para los exámenes histológicos:

La solución fijadora de rutina para la histopatología, biopsia y pieza quirúrgica es formalina

tamponada (formol tamponado al. 10 %). La muestra debe sumergirse inmediatamente
después de su extracción en un recipiente que contenga el agente fijador. El tiempo medio
ideal de fijación es de 6 a 48 horas, lo que varía según el índice de fijación. En general, se
recomienda que las muestras de 1 mm de espesor permanezcan en el fijador durante 8 horas.

La fijación tiene como objetivo:

1. La preservación de la morfología del tejido;

2. La preservación de los antígenos del tejido.

Para que esto suceda, el mejor fijador es la formalina (formaldehído al 37 % diluido en

una proporción de 9:1). El formaldehído con el tiempo se oxida y se convierte en ácido
fórmico, el que corroe los antígenos de los tejidos, de ahí la necesidad de tamponar el formol,
el que conserva el pH entre 7-7,3 y no daña el tejido.

El tiempo de fijación también influye en el resultado. Para que los antígenos se conserven, la
fijación debe ser de al menos 6 horas y como máximo de 72 horas; menos de ese tiempo no lo
fijará adecuadamente y más que ese tiempo alterará los resultados de la tinción histoquímica,
inmunohistoquímica y posibles estudios genéticos o moleculares.

Los fijadores químicos son los más frecuentemente empleados, bien compuestos por un solo
tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas. Los fijadores se pueden clasificar en
coagulantes y en aquellos que establecen enlaces cruzados. Los primeros, al extraer agua de
los tejidos producen coagulación y desnaturalización de las proteínas, mientras que los
segundos establecen enlaces químicos entre moléculas del tejido. Los fijadores que tienen
como base al alcohol son coagulantes, tales como el Bouin o el Carnoy, mientras que el
formaldehído o el glutaraldehído establecen enlaces cruzados. También se preparan
soluciones mixtas de ambos tipos de fijadores.

Fijadores simples

Etanol

Etanol: CH3-CH2-OH

Etanol, metanol, acetona. Fijan por deshidratación y coagulación de las proteínas, sobre todo
las citosólicas. Extraen los lípidos de los tejidos, pero no afectan a los carbohidratos. En
general, son buenos fijadores de muestras de pequeño tamaño, preservan el glucógeno, los
pigmentosy las proteínas, como las enzimas. Se usan frecuentemente para para fijar las
extensiones citológicas o secciones de criostato obtenidas de tejido no fijado. También como
un conservantes de las muestras. Pueden producir endurecimiento y retracción de los tejidos,
muy evidentes en bloques de tejido muy grandes. Carecen de efecto mordiente.

ácido acético

ácido acético: CH3COOH

Acido acético. Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se
utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos
y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y
mala fijación de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores.
Ejemplos: Bouin, FAA.

ácido pícrico

ácido pícrico: C6H2OH(NO2)3

Acido pícrico. Las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de los tejidos. Preserva bien la
estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo, preserva
bien glucógeno y lípidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que tiene efecto
mordiente y favorece la unión de los colorantes. Se suele usar combinado con otros fijadores.
Ejemplos: Bouin.

Formaldehído. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa
como conservante, produce poca retracción tisular, es compatible con la mayoría de las
tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos
ribonucleicos. El formaldehído preserva bien los lípidos, sobre todo si se añade a la solución
fijadora iones de calcio (reducen la solubilidad de los fosfolípidos), y no reacciona con los
carbohidratos. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica. Se utiliza a
concentraciones próximas al 4 %. Ejemplos: formaldehído tamponado , Bouin, FAA, PLP.

Formaldehído

Formaldehído: CH2=O.

Formaldehído

Enlaces entre proteínas formadas por el formaldehído.

Glutaraldehído

Glutaraldehído.

Glutaraldehído. Es uno de los fijadores más usados. En solución polimeriza formando dímeros
y trímeros. El glutaraldehído tiene poca velocidad de penetración. Forma puentes entre las
moléculas de los tejidos. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular puesto
que es capaz de entrelazar el tejido más fuertemente que otros aldehídos, por lo que es el
fijador de referencia para la observación ultraestructural de las células con el microscopio
electrónico. Sin embargo, no se recomienda para inclusiones en parafina. Se usa en soluciones
tamponadas isotónicas y normalmente en combinación con el formaldehído.

Tetróxido de osmio

Tetróxido de osmio. OsO4.

Tetróxido de osmio

Enlaces producidos por el OsO4 en los enlaces insaturados de los ácidos grasos.

Tetróxido de osmio. Tiene poca penetración en los bloques de tejido, entre 0.5 y 1 mm, y se
puede usar tanto en solución como en vapor. No produce artefactos pero hace a las muestras
de tejido frágiles. Forma puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de ácidos grasos
de los lípidos de las membranas celulares, a las que hace insolubles, oscuras y opacas a los
electrones. Por eso se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio
electrónico, ya que preserva y oscurece las membranas celulares. Pero también en microscopía
óptico se usa para estudiar las grasas insaturadas, para observar los tractos de mielina, y es
necesario para las impregnaciones argénticas como en el método de Golgi.

Mezclas fijadoras

Líquido de Bouin. Está formado por ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Es una
solución muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina (ver
capítulo de inclusión) y a cuyas secciones se les puede aplicar un amplio espectro de tinciones.
Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de
fijaciones por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden conservar en etanol
de 70°.

Solución de Clarke. Está formada por etanol y ácido acético glacial (3:1). Es uno de los primeros
fijadores que se empleó para muestras que se incluían en parafina.

Carnoy. Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las
proteínas fibrosas. Es bueno para observar los ácidos nucleicos, aunque no la morfología
nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares.
Está formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehído. El formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día. Lo más
frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Se suele disolver en
soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende
fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar
soluciones fijadoras que contienen formaldehído y glutaraldehído. La función del formaldehído
es iniciar una fijación rápida, por su mayo capacidad de penetración, mientras que el
glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta, que no afectará a la
estructura tisular puesto que el formaldehído ya ha realizado una fijación previa. Ejemplos:
formaldehído tamponado , Bouin, FAA, PLP.

Glutaraldehído-tetróxido de osmio. Los fijadores en combinación no tienen necesariamente

que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica
sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para
posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada.