Práctica No.
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“Determinación de azúcares reductores
método DNS (método Miller)”
Objetivos:
Conocer y aplicar los principios de la curva patrón aplicada a la cuantificación de azúcares
reductores con el reactivo 3,5-dinitrosalicílico (3,5 DNS).
Cuantificar los azúcares reductores presentes en una muestra problema
FUNDAMENTO TEÓRICO:
Hoy en día la industria licorera y alimenticia utiliza varios tipos de métodos analíticos para
la determinación de azúcar y alcohol en los licores y/o bebidas a utilizar como medio de
venta. Uno de los métodos más acordes y con mejor resultados en la determinación de los
azúcares con carácter reductor, es el método 3,5 dinitro salicílico (DNS), método que ha
sufrido varias modificaciones a través de los años para adecuarse al análisis de diferentes
materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que
es un método espectrofotométrico; el procedimiento se basa en una reacción redox que
ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra, sin embargo a nivel
industrial no es recomendable utilizarlo cuando dicha trata sustancias tales como mieles y
caldos de fermentación que lo contengan, esto debido a según estudios realizados en la
materia, a los altos niveles de dispersión.
El método DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5
dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. Determina las
absorbancias por medio de un espectrofotómetro a una absorbancia en la zona de 540-575
nm. Esta técnica sirve para cuantificar los azúcares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La curva de
calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas, de la Absorbancia (eje
de ordenadas: Y) frente a la Concentración (eje de abscisas: X). Se ensayan varias
soluciones de concentración conocida y se determinan sus absorbancias, construyéndose
la curva de calibrado, que es una recta. La concentración de una solución problema
(desconocida), se averigua por interpolación de la Abs de la solución en la curva de
calibración, o a través de la ecuación de la recta (y = mx + b) donde: Absorbancia (y) =
constante (m) x concentración + absorbancia del blanco. El DNS (color amarillo) reacciona
únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor, pero
tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y
reaccionan con el DNS generando un producto coloreado (rojo ladrillo) (Figura 1). La
intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional
a la concentración de sacarosa.
Material y Reactivos:
Material:
1. Vortex
2. 2 gradillas
3. 12 tubos de ensayo
4. Micropipetas de 100-1000μl
5. Espectrofotómetro
6. Celdas para espectrofotómetro
7. Baño María con agua caliente a 100°C
8. Baño con agua fría
9. Agua destilada
Reactivos:
1. Solución de glucosa 1g/L
2. Reactivo DNS
Procedimiento:
Colocar en cada tubo, 500μl de las soluciones de la curva patrón (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 g/L)
y de la muestra problema, como se indica en la siguiente tabla:
Para preparar la muestra problema, llevar a cabo diluciones diferentes (1:10 y 1:100), a fin
de encontrar aquella dilución adecuada, que conlleve a obtener la concentración precisa de
glucosa en la solución problema.
Tomar 500ml de la muestra sin diluir y de las muestras diluidas (1:10 y 1:100), colocar en
tubos y continuar con el procedimiento que se describe a continuación:
*Adicionar 500ml del reactivo DNS a cada tubo
*Agitar todos los tubos en vortex
*Llevar los tubos al baño María (BM) con agua caliente a 100°C por 5 minutos
*Retirar los tubos del BM y colocar en agua fría
*Adicionar a cada tubo 4ml de agua destilada (volumen final =5ml) y agitar en vortex
*Leer absorbancia en espectrofotómetro a 575nm
Anotar los valores en la siguiente tabla:
No. De tubo 1 2 3 4 5 6
Glucosa 0 200 400 600 800 1000
(mg/L)
Absorbancia 0 0.028 0.055 0.09 0.129 0.1667
Resultados y cálculos:
Y= 0.0002x – 0.0056
Y=mx+b
𝑌−𝑏
𝑋=
𝑚
(0.047)−(0.0056)
𝑋= (0.0002)
= 207
(0.052)−(0.0056)
𝑋= (0.0002)
= 232
Diagrama de flujo:
Cuestionario:
