Práctica 9: Propiedades químicas y valoración de
proteínas.
Andrea Ramirez Monrroy, Daniela Kiabeth Mauricio Juarez, Andrea Nikol Solís Alvarado,
Camila Pinillla Becerra, Daniela Alejandra Martínez Martínez, Maria Jose Bermudez Silva.
Fecha de desarrollo: Martes 8 de marzo del 2022.
Fecha de entrega: Martes 15 de marzo del 2022.
1. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son biomoléculas, formadas por aminoácidos, que intervienen en diversas
funciones vitales. Constan de 3 a 4 niveles estructurales; la estructura primaria es secuencia
de aminoácidos en la cadena polipeptídica, la estructura secundaria se refiere al plegado de
segmentos de polipéptido cortos (3 a 30 residuos) y contiguos, hacia unidades ordenadas
de manera geométrica (hélice α y la hoja β), la estructura terciaria forma unidades
funcionales de mayor tamaño (polipéptido maduro y sus dominios) y por último la estructura
cuaternaria consta del número, tipos y disposición espacial de proteínas.
Gelatina
Es el resultado de la separación de las cadenas que conforman la triple hélice de colágena,
proteína fibrosa (PI=9), qué ocurre por el rompimiento de los puentes de hidrógeno.
Contiene todos los aminoácidos menos valina, tirosina y triptófano. Está conformada por
proteínas 85%, agua 12% y sales de 1 a 2%. La fuerza de gel, viscosidad y transparencia
se encuentran entre las propiedades de la grenetina que varían con el punto isoeléctrico y el
PH de la solución. Dependiendo del tipo de gelatina A o B cambia el punto isoeléctrico (PI)
siendo de 8-9 o 4.5-5.4 respectivamente.
Existen diversos métodos de cuantificación y cualificación de proteínas, algunas de ellas
usan tintes ya que las proteínas al estar conformadas de aminoácidos pueden contener
grupos R con cargas, lo que permite que diversos iones (tintes) se unan, generando
metacromasia al estabilizarse. Este es el caso del método de bradford cuyo tinte se une
específicamente a la arginina, histidina, fenilalanina, triptófano y residuos de tirosina..
Por otra parte el reactivo de Esbach es usado para detectar proteína en la orina (albúmina)
al provocar un precipitado amarillo, aunque también ocasiona la precipitación de las
proteínas presentes en la gelatina. Debe prepararse mezclando una solución de ácido
pícrico al 1% con otra solución de ácido cítrico al 2% que posteriormente se diluye en agua.
También existe la reacción de Biuret la cual reacciona con los enlaces peptídicos que
forman las proteínas, esta reacción se basa en la formación de un compuesto de color
violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu+2 y los
pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos, esto si la reacción da positiva. Cuando la reacción de biuret dá negativa, queda
de color azul.
OBJETIVO
General: Verificar reacciones características de proteínas, que tienen importancia en
métodos de separación, para comprender de mejor manera dichos métodos y realizar de
manera efectiva una separación de proteínas de manera eficaz en el futuro.
Particulares:
● Llevar a cabo reacciones de desnaturalización y precipitación de proteínas que
tienen importancia en métodos de separación.
● Extraer proteínas considerando sus propiedades de solubilidad en distintos medios.
● Determinar la presencia de aminoácidos fenólicos en una muestra de proteína
mediante reacciones de coloración.
2. METODOLOGÍA
Precipitación de proteínas con etanol.
Colocamos en 3 tubos de ensayo 1ml de diferentes muestras: gelatina, clara diluida y agua
como control, posteriormente agregamos 1 mL de alcohol al 95%. Observamos y
comparamos los resultados de cada muestra.
Precipitación con metales pesados.
Preparamos tres pares de tubos con 1 ml de muestra, dos por muestra, de gelatina, clara
diluida y agua como control. Agregamos a uno de ellos, 5 gotas de AgNO3 al 5% y al otro, 5
gotas de HgCl2 al 5%.
Prueba de Millón
Colocamos en 3 tubos de ensayo 3ml de diferentes muestras: gelatina, clara diluida y agua
como control. Añadimos 5 gotas del reactivo de Millón y dejamos los tubos en baño maría
durante 5 minutos. Observamos y comparamos los resultados de cada muestra.
Precipitación con el reactivo de Esbach
En cuatro tubos de ensayo añadimos 1mL de gelatina, clara de huevo diluida, muestra
problema (la misma que estaba etiquetada para la prueba de Millón) y agua (control).
Seguido añadimos 1 mL del reactivo de Esbach y se observaron los cambios. Finalmente
calentamos a baño maría y anotamos los cambios.
Prueba de Sakaguchi
En cuatro tubos de precipitado añadimos 5 mL de gelatina, clara de huevo diluida, muestra
problema (la misma que estaba etiquetada para la prueba de Millón) y agua (control).
Después adicionamos 1 mL de NaOH 2M y 1 mL de alfa-naftol en etanol y mezclamos.
Dejamos reposar las muestras en hielo durante 3 minutos. Posteriormente añadimos 1 mL
de hipoclorito de sodio y esperamos 30 segundos para finalmente agregar 1 mL de urea y
mezclamos.
Prueba xantoproteica
En cuatro tubos de ensayo añadimos 2 mL de gelatina diluida, clara de huevo diluida,
muestra problema (tomamos la muestra xantoproteica), y agua. añadimos a cada tubo 1mL
de HNO3 concentrado y calentamos a baño maría durante 5 minutos, posteriormente lo
enfriamos con agua corriente y añadimos gota a gota 2 mL de una disolución de NaOH al
40% y analizamos resultados.
Prueba de azufre
En cuatro tubos de ensayo añadimos 2 mL de gelatina diluida, clara de huevo diluida,
muestra problema (tomamos la muestra de azufre), y agua. añadimos a cada tubo 2 mL de
disolución de NaOH al 20% añadimos 10 gotas de disolución de Pb(CH3COO)2 al 5%,
calentamos el tubo hasta ebullición utilizando la flama del mechero y observamos los
cambios
Reacción de Biuret
A cuatro tubos de ensayo se le agrega 2 ml de agua,clara de huevo diluida , gelatina diluida
y una sustancia problema (solución de aminoácidos) .después agregamos 1 ml de NaOH al
40% para hacer cada solución alcalina, mezclamos y adicionamos 1 ml CuSO3 a 1%.
Observamos el cambio de color de las muestras.
3. RESULTADOS
Precipitación con Etanol
Imagen 1.1:Clara con etanol sin Imagen 1.2: Clara con etanol Imagen 2: Muestra de control
agitar, separación por densidad después de agitar etanol con agua.
Resultado: Positivo / leve precipitación Resultado: Negativo
Imagen 3: Muestras con etanol (agua, gelatina y clara de izquierda a derecha respectivamente)
Precipitación con metales pesados (Antes)
Imagen 4.1: Clara Imagen 4.2: Imagen 4.3 :Agua (control
Gelatina negativo)
Precipitación con metales pesados
Imagen 5: Muestras con AgNO3 Imagen 5: Muestras con HgCl2
REACTIVO DE BIURET
Imagen 6: Biuret gelatina, huevo y agua con NaOh 40%
Imagen 7 : Muestra de sustancia problema , agua, huevo y gelatina con CuSO3
El reactivo de Biuret reacciona con los enlaces peptídicos lo cuales están presentes en las
proteínas, conociendo esto vemos que en la imagen 7 la muestra de huevo y gelatina
exponen una coloración violeta confirmando así la presencia de proteínas en específico
ovoalbúmina ( huevo) y colágeno ( gelatina ) en su mayoría. Por otro lado las muestras de
agua y la sustancia problema dan un resultado negativo
REACTIVO DE MILLON
Imagen 8: Exposiciòn de las muestras de Millon Imagen 9: Muestras con reactivo de millon (agua,
(agua, gelatina y sustancia problema) a placa de gelatina, muestra problema y clara de huevo de
calentamiento. izquierda a derecha)
ESBACH
Imágenes 10: Apariencia de las muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, antes del
reactivo de Esbach.
Imágenes 11 : Apariencia de las muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, después de
adicionar el reactivo de Esbach.
Imágenes 12: Apariencia final de las muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, después
de calentar a baño María.
SAKAGUCHI
Imágenes 13: Muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, después de colocar las muestras
y adicionar el NaOH 2M.
Imágenes 14: Muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, después de dejarlas reposar en
el hielo 3 minutos.
Imágenes 15: Apariencia de las muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, una vez
añadido el hipoclorito de sodio.
Imágenes 16: Apariencia final de las muestras de agua, gelatina, huevo y problema, respectivamente, seguido
de adicionar la urea.
Xantoproteica Azufre
Imagen 17.- Reacciones finales de las proteínas en las muestras de azufre y xantoproteica.
4. DISCUSIONES
ENSAYOS DE PRECIPITACIÓN
La muestra de clara diluida fue en la que se observó mayor diferencia entre el antes y
después especialmente en el ensayo con etanol. Sin embargo debido a que el etanol que
usamos tenía una concentración de 70% y no 95% en la muestra de clara agregamos 1 ml
más esto con el fin de hacer más notoria la reacción. La muestra de agua no presentó
precipitación ya que era el control negativo.
PRECIPITACIÓN CON METALES PESADOS.
La precipitación de las proteínas se llama desnaturalización, en ella hay pérdida de la
actividad biológica de la molécula. La desnaturalización puede ser causada por agentes
químicos o físicos. A pH 7 o por encima de èl, las proteìnas estàn cargadas usualmente
negativamente, asì que la adiciòn de metales cargados positivamente neutralizan la carga y
la poteìna precipita, la precipitaciòn por metales pesados es màs efectiva con valores de pH
neutros o ligeramente alcalinos, como lo podemos observar en la imagen 5.
MILLÓN
El reactivo de millon sirve para identificar la presencia de aminoácidos fenólicos, por lo que
la tirosina da positivo al formar complejos con los iones del reactivo, lo que produce una
precipitación con un color anaranjado (albúmina por la clara de huevo). La muestra de clara
presentó una mayor coloración seguida de la muestra problema y por último la muestra de
gelatina, en cuanto a la muestra de agua no presentó cambios al ser el control negativo. Por
lo que podemos deducir que la muestra problema y la gelatina no contienen tirosina. Sin
embargo en ambas pudimos observar un ligero cambio en la coloración de la solución pero
sin precipitación.
XANTOPROTEICA
En todas las reacciones utilizadas se llevaron a cabo para determinar la presencia de
proteínas en las disoluciones preparadas. En el caso de la xantoproteica, dio como
resultado positivo en las proteínas con aminoácidos que tienen grupos aromáticos
(especialmente tirosina). Y en la tabla 3 notamos todos los aminoácidos presentes en la
clara de huevo.
Se prepararon 4 tubos en los cuales determinamos si se activaba o si salia negativa en el
experimento, las positivas fueron el huevo, la gelatina y en la muestra problema tambien
nos debio de haber dado positiva, sin embargo, la concentracion de esta fue muy poca, por
lo tanto no se logro apreciar el cambio de color.
Tuvimos que diluir la gelatina a temperatura ambiente, esto para que no se fueran a romper
la proteína proveniente del colágeno, ya que contiene de un 98-99%. después de ponerle el
HNO3 y ponerla a baño maria, fue asi como se activo y dio positiva y se logro el cambio de
color. El agua era el blanco negativo, por ello, al ser la muestra control, se mantuvo incolora.
Se manejó con mucho cuidado su preparación, ya que al ser exotérmica, cabía el riesgo de
que el HNO3 nos fuera a quemar.
En la prueba de azufre, es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las
proteínas que los contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris o
hasta incluso marrón. En la muestra problema y en el agua, se precipitó. En la clara de
huevo dio positiva.
ESBACH
La prueba de precipitación con el reactivo de Esbach detecta proteínas como la albúmina,
presente en la clara de huevo, y el colágeno, que se encuentra en la gelatina. La prueba dio
postiva para ambas muestras, que es donde se formó un precipitado amarillo, mientras que
la muestra problema y el control dieron negativo, pues no se formó ningún precipitado. Al
calentar las muestras y por lo tanto subir su solubilidad, el precipitado que estaba presente
en el tubo de colágeno se disolvió, por otro lado, aunque el precipitado del tubo de huevo
pareció disolverse, éste se sigue apreciando. Esto no quiere decir que el colágeno ya no
esté presente, sino que, al calentarlo se hidrolizó y se solubilizó.
SAKAGUCHI
La prueba de Sakaguchi es utilizada para identificar proteínas mediante la presencia de
arginina, ya que casi todas poseen a este aminoácido. El color rojo indica un resultado
positivo de guanina, que caracteriza a la arginina. En el control no ocurrió ningún cambio,
pues solo se trata de agua. En la muestra de gelatia el cambio de color no fue tan notorio,
pero se alcanza a ver un rojo transparente. Para el caso de la muestra problema y la
muestra del huevo, el color rojo fue mucho mas intenso y visible, siendo aún mas notorio en
el tubo del huevo. Después de que se agregó el hipoclorito de sodio el color rojo fue menos
intenso, esto es debido a que las proteínas presentes se degradaron ante la presencia del
cloro y, en el caso de la muestra problema, el color es casi totalmente transparente.
Tabla 3
5. CONCLUSIONES
Es importante conocer los distintos reactivos y reacciones que existen para la determinación
y cuantificación de proteínas, así como su funcionamiento, ya que dependiendo de las
características de la proteína a determinar es el proceso que se usa. Por ejemplo en el caso
que se tenga una muestra la cual se quiere determinar si es una solución de aminoácidos
no enlazados o una secuencia de aminoácido(proteína) se usaría biuret ya que esta
determina los enlaces peptídicos presentes en la secuencia de aminoácidos (proteína), en
el caso de que la reacción sea negativa podemos usar el reactivo de bradford ,que éste
reacciona con aminoácidos no enlazados de una solución en específico con arginina,
histidina, fenilalanina, triptófano y residuos de tirosina y no con los enlaces peptídicos
característicos de una proteína.
En esta práctica no nos dio positivo el tubo de ensayo con la muestra problema (muestra
xantoproteica), la cual si nos debió de haber dado positivo ya que reunía características
para tal resultado, se llegó a la conclusión que fue por la falta de concentración de la
muestra problema, por lo cual, nos dimos cuenta que en algunos casos como lo es en la
muestra xantoproteica, es necesario tener una concentración alta de dicha muestra, para
que esta sea suficiente para reaccionar y dar cambios físicos y químicos que se puedan
observar a simple vista.
6. BIBLIOGRAFÍA
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2022, de [Link]
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➔ Apuntes de bioquímica
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