PCR

1 INTRODUCCIÓN

El patógeno SARS-CoV-2, al igual que MERS-CoV, SARS-like bat CoV y SARS-CoV, pertenece
al clado betacoronavirus, y el análisis del genoma encontró que el SARS-CoV-2 es el más cercano
al SARS- como murciélago CoV. La prueba de ácido nucleico viral es el método principal para
diagnosticar COVID-19, y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa
inversa es la tecnología más utilizada en la clínica. También se han desarrollado algunas otras
técnicas para la detección del ARN del SARS-CoV-2, incluida la PCR digital, la amplificación
isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa y la amplificación mediada por
transcripción. dPCR es una tecnología emergente de amplificación de ácidos nucleicos que permite
la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos.

Aquí presentamos el principio y las ventajas de la dPCR, revisamos las aplicaciones de la dPCR en
la pandemia de COVID-19 y analizamos los desafíos de la dPCR en la pandemia de COVID-19 y
las aplicaciones clínicas relevantes.

Principio de PCR digital

La PCR es una técnica molecular para la amplificación exponencial de un segmento específico de

ADN, que fue desarrollada por Kary Mullis en la década de 1980. El concepto de «dPCR» fue
mencionado por primera vez por Vogelstein y Kinzler en 1999. El principio de dPCR es dividir la
mezcla de reacción de PCR tradicional en muchas subreacciones independientes antes de la
amplificación y determinar el número original de moléculas diana contando las particiones que
muestran resultados positivos. y resultados de PCR negativos y análisis con la distribución de
Poisson después de la amplificación. La dPCR basada en gotas divide la mezcla de reacción de PCR
mediante la técnica de gotas microfluídicas.

La dPCR basada en chip logra la partición utilizando una placa base que está equipada con decenas
de miles de micropocillos mediante técnicas de micro/nanofabricación. Tomando como ejemplo la
detección de SARS-CoV-2 basada en dPCR basada en gotas, mostramos el flujo de trabajo de
dPCR en la Figura 1. Por lo general, la técnica Taqman se usa en la detección de SARS-CoV-2, y el
gen de la nucleocápside y el gen orf1ab son elegidos como objetivos. Posteriormente, las gotitas se
calientan mediante un termociclador para su amplificación.

A continuación, las gotas son controladas por un sistema de detección fotoeléctrico compuesto por
láseres y tubos fotomultiplicadores. La Figura 1F ilustra los resultados del análisis de una reacción
de dPCR de doble objetivo, donde los grupos en la vista 2D tienen diferentes combinaciones de
objetivos.

Ventajas de la PCR digital

El número de copias de las moléculas objetivo se cuantifica mapeando la relación entre el umbral
del ciclo de la curva de amplificación de fluorescencia con una curva estándar generada a partir de
un material de referencia. Las curvas de amplificación suelen ser vulnerables a una eficiencia de
amplificación y calidad de la muestra inadecuadas, inhibidores y errores del sistema. Por el
contrario, la dPCR divide la mezcla de reacción de la PCR en decenas de miles o incluso millones
de unidades de reacción y la fluorescencia de cada unidad se detecta al final de la amplificación. El
número de copias de las moléculas diana se calcula por la fracción de las unidades de reacción que
contienen las moléculas diana, según la distribución de Poisson.

En consecuencia, la dPCR es menos sensible a los inhibidores que la qPCR y el cálculo del número
de copias no se basa en materiales de referencia. Por lo tanto, dPCR es elegible para proporcionar
resultados de cuantificación más confiables y precisos que qPCR. comparó la capacidad de dPCR y
qPCR para cuantificar los miRNA, y los resultados indicaron que dPCR de hecho ofrecía resultados
más precisos. En la detección del citomegalovirus humano, la dPCR mostró una mejor tolerancia a
los inhibidores que la qPCR.

Además, aunque los inhibidores pueden influir en la amplificación de la PCR en un ensayo de

dPCR, las subreacciones afectadas aún pueden identificarse correctamente porque su intensidad de
fluorescencia sigue siendo significativamente mayor que la fluorescencia de fondo.

Evaluación de la carga viral en diferentes tipos de muestras clínicas

Como la dPCR permite la cuantificación absoluta, juega un papel importante en la cuantificación de

cargas virales en muestras clínicas de pacientes con COVID-19. usó dPCR para cuantificar la carga
viral en frotis nasales, frotis de garganta, esputo, sangre y orina.

La evaluación de los métodos de preparación de muestras

utilizó dPCR para cuantificar la carga viral en muestras antes y después de tres métodos de
inactivación. Los resultados indicaron que el tratamiento de inactivación redujo la cantidad de ARN
viral detectable, lo que puede dar lugar a resultados falsos negativos. Los autores encontraron que la
carga viral en la muestra inactivada por calor se redujo considerablemente, y el uso del reactivo
TRIzol tuvo el menor efecto sobre la cantidad de ARN viral. Este estudio muestra que la dPCR es
una poderosa herramienta para evaluar la influencia del pretratamiento en muestras de ácido
nucleico.

El control dinámico de la progresión de la enfermedad

utilizó dPCR para cuantificar la carga viral en muestras de pacientes en diferentes momentos a lo
largo del curso de la enfermedad. Descubrieron que la carga viral en las etapas temprana y
progresiva era significativamente más alta que en la etapa de recuperación, lo que sugiere que el
control dinámico de la carga viral ayuda a evaluar la progresión de la enfermedad.

Preparación de materiales de referencia de ácidos nucleicos

Los materiales de referencia de ácidos nucleicos se utilizan para evaluar el rendimiento de los
métodos de detección y construir curvas estándar para RT-qPCR. Los materiales de referencia
también sirven como control positivo para la detección del ácido nucleico del SARS-CoV-2. La
dPCR permite la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos, por lo que se ha utilizado para
caracterizar materiales de referencia de ácidos nucleicos. utilizó dPCR para cuantificar el número de
copias de SARS-CoV-2 para la preparación de materiales de referencia.
Además, utilizaron diluciones en serie de ARN viral para evaluar el rendimiento analítico de
diferentes kits de RT-qPCR.

Monitoreo de la concentración de virus en el medio ambiente.

Se necesita un método de detección con alta sensibilidad y alta tolerancia a los inhibidores para
analizar con precisión las muestras recolectadas en diversos entornos. usó dPCR para medir el ARN
viral en aerosoles en diferentes áreas de dos hospitales en Wuhan durante el brote de COVID-
19. Descubrieron que el ARN del SARS-CoV-2 en el aire era indetectable en la mayoría de las
áreas públicas. La concentración de ARN viral en los aerosoles era baja en las salas de aislamiento
y ventiladas, pero era alta en los baños de los pacientes y en ciertas áreas del personal médico.

Según estos resultados, sugirieron que el SARS-CoV-2 puede tener el potencial de propagarse a
través de aerosoles. Todas las muestras resultaron negativas por RT-qPCR, mientras que 13 de 61
muestras fueron consideradas positivas por dPCR. Las áreas con la mayor densidad de ARN del
SARS-CoV-2 fueron los guantes exteriores del personal de laboratorio que manipula muestras
virales.