UNIVERSIDAD CATÓLICA “NUESTRA SEÑORA DE LA ASUNCIÓN”
CAMPUS UNIVERSITARIO DEL GUAIRÁ
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD-CARRERA DE MEDICINA
Cá tedra de Microbiología – Parte Prá ctica
PRÁCTICA NRO 5
09/05/2022
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA: ESTAFILOCOCOS Y ESTREPTOCOCOS
OBJETIVOS:
1. Identificar colonias sospechosas de estafilococos y estreptococos por las
características culturales
2. Utilizar la prueba de la catalasa para identificar al género Staphylococcus y
separar del género Streptococcus
3. Sembrar, leer e interpretar pruebas bioquímicas útiles en la identificación de
Staphylococcus spp. y Streptococcus spp.
4. Determinar género y especie de la una cepa incógnita
ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN: lista de cotejo, pruebas escritas sobre la práctica,
entrega, presentación y defensa de los resultados obtenidos al final de la práctica
FUNDAMENTO DEL ENSAYO:
Los cocos grampositivos se pueden clasificar, en primera instancia, en cuanto a sus
requerimientos atmosféricos. Así tenemos los cocos Gram positivos anaerobios
estrictos constituidos por los géneros Peptococcus y Peptoestreptococcus. Por otro
lado tenemos los cocos Gram positivos aerobios y anaerobios facultativos que están
constituidos por la familia Micrococacceae (géneros Staphylococcus, Micrococcus,
Planococcus y Stomatococcus) y los géneros Streptococcus y Enterococcus.
GENERO Staphylococcus. Identificación: El primer paso para la identificación de una
especie bacteriana es el estudio de su morfología microscópica y macroscópica.
Luego se deben estudiar sus requerimientos nutricionales. Por último, se procede a
la realización de pruebas bioquímicas que permitirán llegar a la identificación de
género y especie bacteriana. El género Staphylococcus se caracteriza por ser cocos
Gram positivos que se agrupan en forma de racimo. El género Staphylococcus es
aerobio-anaerobio facultativo, por tanto su crecimiento en tioglicolato será en toda la
extensión del tubo. El género Staphylococcus no es exigente nutricionalmente, por lo
tanto crece en medios de cultivo pobres. Las pruebas bioquímicas son aquellas que
ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos metabólicos determinados:
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1. PRUEBA DE LA CATALASA: permite diferenciar la Flia. Micrococacceae
(catalasa +) de los Géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa -).
Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno
(H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta
manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un
producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.
Procedimiento: Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y
luego se transfiere una porción de colonia sobre el H2O2 realizándose una
emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin
sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los
resultados. Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento en tubo,
simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo. Interpretación
de resultados: El desprendimiento de burbujas se considera una prueba
positiva. Dentro de la Flia. Micrococacceae existen 4 géneros, el de mayor
importancia clínica es el Género Staphylococcus. Dentro del Género
Staphylococcus existen 3 especies de importancia clínica: S.aureus,
S.saprophyticus y S.epidermidis. Estas se diferencian con la prueba de la
coagulasaa.
2. PRUEBA DE LA COAGULASA
Objetivo: Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras
especies de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa
negativos.
Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a. Una
endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la
pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la
formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión
bacteriana con plasma citratado (test en lámina). b. Una exocoagulasa o
coagulasa libre es secretada en forma extracelular y reacciona con una
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sustancia presente en el plasma denominada “factor de reacción con
la coagulasa (CRF)” para formar un complejo que, a su vez, reacciona con
el fibrinógeno para formar fibrina (formación de coágulos), el test se realiza en
tubo.
Test en tubo. Procedimiento: Se emulsionan varias colonias en un tubo con
0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a 35º y se chequea la
formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche
y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas, es
fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las
fibrinolisinas de S.aureus lisen el coágulo luego de 18 horas de incubación y
de esta manera se produzcan un test falso negativo.
Interpretación de resultados: Se observa la formación de un coágulo total o
parcial si el test es positivo.
3. PRUEBA DE LA DESOXIRRIBONUCLEASA (DNAsa)
Objetivo: Permite diferenciar S.aureus que es la única especie dentro del
Género Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies.
Fundamento: Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que
es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA.
Se utiliza un medio sólido que contiene DNA altamente polimerizado. Cuando
la cepa produce la enzima DNAsadigiere al DNA.
Procedimiento: Se siembra una colonia de estafilococo en forma de una raya
en una placa de medio sólido que contiene DNA. Se incuba 18 horas a 35º.
Interpretación de resultados: La formación de un halo transparente alrededor
de la siembra indica por el agregado de una solución de HCl 1N indica la
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presencia de DNAsa, permaneciendo todo turbio alrededor del halo, pues el
HCl precipita a todo el DNA no digerido por la enzima
4. SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Objetivo: Separar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás
estafilococos coagulasa negativos.
Fundamento: Varias especies del Género Staphylococcus son resistentes a la
novobiocina (disco de 5 µg).
Procedimiento: Se siembra una placa de agar sangre con un hisopo embebido
en una suspensión de la cepa a estudiar (también puede realizarse en medio
Agar Mueller-Hinton). Luego se aplica el disco de novobiocina y se incuba a
35º por 18 horas.
Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o
igual a 16mm corresponde a S. saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de
16 mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.
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5. PRUEBA DE MANITOL
Objetivo: Separar S. aureus de otras especies de estafilococos.
Fundamento: El S. aureus es el único que puede utilizar manitol como una
fuente de carbono en un ambiente de alta osmolalidad.
Procedimiento: inocule una colonia de Staphylococcus en Agar manitol salado
e incube por 18-24 hs.
Interpretación: los productos ácidos del metabolismo de la bacteria acidifican
el medio y lo torna amarillo indicando positividad.
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Por otro lado, el género Streptococcus se caracteriza por ser cocos Gram
positivos que se alinean en cadena. El género Streptococcus aerobio-
anaerobio facultativo, por tanto su crecimiento en tioglicolato será en toda la
extensión del tubo. En cuanto a los requerimientos nutricionales el Género
Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos
que le aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo, agar sangre ovina.
Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación, la primera, luego de
determinar que se trata de un coco Gram positivo, es la prueba de la catalasa.
Luego de determinar que se trata de un coco Gram positivo catalasa negativo,
debemos proceder a observar el efecto que tiene la cepa sobre el agar sangre
(hemólisis). Así podemos clasificar este grupo de gérmenes en: ß hemolíticos:
son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos,
observándose como un halo transparente alrededor de las colonias. α
hemolíticos: son aquellos que producen hemólisis parcial, la cual se observa
como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias. Gamma
hemolíticos: son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.
ESTREPTOCOCOS ß HEMOLITICOS
Son los más importantes en la clínica médica: Streptococcus pyogenes y
Streptococcus agalactiae. Siempre se requieren pruebas de confirmación
serológica posterior para realizar un diagnóstico definitivo. Estreptococos
grupo D, ahora Enterococcus spp. es incluido dentro de los ß-hemolíticos, ya
que existen cepas de Enterococcus faecalis que pueden ser ß-hemolíticas.
1. SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA
Objetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos
beta hemolíticos.
Fundamento: Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones
de Bacitracina (discos conteniendo 0,04U).
Procedimiento: Se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con asa
bacteriológica de un cultivo puro, que se estría sobre una placa de agar
sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Luego
se coloca el disco de Bacitracina y se incuba 18- 24 horas a 37º.
Interpretación de resultados: La aparición de cualquier diámetro de halo de
inhibición de crecimiento alrededor del disco se considera prueba positiva.
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2. HIDROLISIS DEL PYR
Objetivo: Separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás
estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus spp. poseen la capacidad de
hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen
la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. La misma se revela por un cambio
de color de amarillo a rosado-rojo.
3.
Objetivo: Separar Streptococcus agalactiae de los demás estreptococos ß-
hemolíticos.
Fundamento: Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un
factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta
la zona de hemólisis producida por un estafilococo productor de ß- lisina.
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Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico
en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina
en agar sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia por la
presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de puntas de
flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías.
ESTREPTOCOCOS ALFA Y GAMMA HEMOLITICOS
Dentro del grupo D se incluyen también Streptococcus penumoniae y
Streptococcus del Grupo viridans. El primero siempre es alfa-hemolítico,
mientras los segundos pueden ser alfa o gamma hemolíticos.
4. BILIS ESCULINA
Objetivo: Separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de
estreptococos.
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Fundamento: Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D de
crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de hidrolizar la
esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que
posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de
bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del Grupo viridans que son
capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.
Procedimiento: Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis
esculina inclinado.
Interpretación de resultados: Una reacción positiva se evidencia como
ennegrecimiento del medio.
5. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL (Caldo salado)
Objetivo: Separar los enterococos, capaces de crecer en caldo salado, de los
demás estreptococos del grupo D.
Fundamento: Se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una
concentración de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que
contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de
bromocresol.
Procedimiento: Se inocula el caldo salado con la cepa de Estreptococos del
grupo D a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35º.
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Interpretación de resultados: Se considera la prueba positiva cuando aparece
turbidez con o sin acidificación del medio, que se observa como un viraje de
color del púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica una prueba
negativa.
6. SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
Objetivo: Diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos α-
hemolíticos. Fundamento: Se basa en la sensibilidad de S.pneumoniae a
una concentración menor o igual a 5µg/ml de hidroxicuprina (optoquina).
Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias
direcciones con una suspensión Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de
optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados: Halos de inhibición mayores de 15mm son
característicos de S.pneumoniae.
7. IDENTIFICACION SEROLOGICA
Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antígenos
específicos de naturaleza polisacárida (polisacárido C o ácidos teicoicos) que
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se encuentran en la pared celular. La extracción del polisacárido C por
diferentes técnicas y su posterior enfrentamiento con antisueros específicos
definen una serie de grupos que se denominan con letras mayúsculas a partir
de la A. La utilidad de la extracción antigénica dependerá del tipo de
hemólisis. En los estreptococos ß-hemolíticos se ha confirmado como el
mejor método para su clasificación. En los no ß-hemolíticos, la extracción
antigénica sólo es útil para la identificación de los grupos D y B. Existen
diferentes métodos para la extracción enzimática que no detallaremos.
Actualmente se
utilizan métodos de extracción rápida por medio de enzimas de extracción.
Luego se procede a la identificación del polisacárido por medio de técnicas de
aglutinación con partículas de látex que tienen absorbido el antisuero
específico. También existen en el mercado kits comerciales que utilizan
técnicas de coaglutinación.
MATERIALES, REACTIVOS E INSTRUMENTALES:
Ansas bacteriológicas
Medios de cultivos con colonias de Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis o Estafilcocos Coagulasa Negativo (ECN) y Staphylococcus
saprophyticus.
Medios de cultivos para diferentes pruebas bioquímicas
Vaso de precipitado
Placas de Petri
Gradillas
Mechero
Autoclave
Alcohol de 70 grados
Cintas de control químico de esterilización
Solución de hipoclorito de sodio
Contenedores de plástico para basuras biológicas
BIOSEGURIDAD:
Se debe tener especial cuidado en los siguientes puntos:
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Utilice tapa boca y guante para este procedimiento.
Los cultivos de las diferentes bacterias son todas infecciosas, por lo que las
precauciones universales deben cumplirse de manera estricta.
Mechero: Si es mechero de Bunsen manipular correctamente la perilla de la
válvula de cierre/apertura del flujo de gas. Si es mechero con alcohol, evitar
los derrames ubicando en un lugar que no esté bajo la manipulación
constante de ansas y placas.
Placas de Petri y otros materiales de vidrio: si son de vidrio manipularlos con
cuidado para evitar roturas
Cultivos bacterianos: sean líquidos o sólidos, para ser eliminados deben ser
previamente autoclavados.
En casos de derrame, primero desinfectar con solución de hipoclorito de sodio
y luego limpiar.
Al terminar la práctica, lavarse bien las manos con agua y jabón. Luego
desinfectarse con alcohol de 70 grados.
PROCEDIMIENTO:
1. Una vez que tenga la presunción de identificación en base a las
características culturales (en especial la betahemólisis y colonias de colora
amarillenta) y la coloración de Gram a partir de la colonia obtenida, realizar en
primer lugar la prueba de la catalasa.
2. Si la prueba de la catalasa es positiva inocule los medios de las pruebas
bioquímica: DNAsa, Agar manitol y la coagulasa. Si la prueba de catalasa es
negativa realice las pruebas de la Bacitracina, Optoquina, PYR y otros según
sospecha en los medios de cultivo (considere beta o alfahemólisis)
3. Lleve los tubos en una gradilla a la incubadora por 18-24 hs a 35°C
4. Interprete los resultados de cada prueba bioquímica y anótelas con cuidado
5. Una vez verificada todas reacciones positivas y negativas junto a otras
características que ayuden a la identificación, utilice el algoritmo para llegar al
género y especie de la bacteria.
6. Realice otras pruebas de acuerdo a los resultados (solo de ser necesario)
para llegar a la identificación plena
7. Si se dispone de reactivos de aglutinación o látex específicos para cepas de
estafilococos, proceda a tomar una pequeña muestra con el ansa
bacteriológica y mézclelo con el reactivo de aglutinación para ver si es
positivo o negativo.
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RESULTADOS CON EVIDENCIAS FOTOGRÁFICAS:
DNAsa: (+). Se observa un halo
Prueba de Manitol en tubo positiva, transparente alrededor de la
propia de la especie colonia desarrollada sobre el
Staphylococcus aureus medio Agar DNA al ser agregado
HCl 1N. El resto se ve turbio por el
precipitado del DNA presente en el
medio con el HCl
Catalasa (+): Se observa la Placa de Agar sangre con
producción de burbujas al desarrollo de colonias
agregarse agua oxigenada a una betahemoliticas de color blanco
colonia de la bacteria sobre una amarillento, circulares y convexas
lámina de vidrio.
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CONCLUSIÓN:
Luego de lo expuesto en la práctica logramos la identificación bacteriana de los
géneros Staphylococcus y Streptococcus. La prueba que divide a dos grandes
géneros en las bacterias es la prueba de la catalasa, siendo positivo en presencia
de Staphylococcus y por el contrario, negativo cuando hay presencia de
Streptococcus. Es importante mencionar el conocimiento previo sobre las
características generales por que estas contribuyen en la identificación de colonias
sospechosas de Staphylococcus y Streptococcus.
El género Staphylococcus no es exigente nutricionalmente, por eso crece en medios
de cultivos pobre, y lo encontramos mayoritariamente en fosas nasales y en la
epidermis. El género Streptococcus habitan en la región oral y en el intestino.
Respecto a la prueba de la Coagulasa, nos permite aislar al S. Aureus que es
coagulasa positiva comparado a las otras especies de este género. Otro método de
aislar al S. Aureus es por la prueba de la desoxirribonucleasa, ya que esta
especie posee tambien la característica de producir DNasa que actúa hidrolizando al
ADN. La prueba de Novobiocina identifica al S. Saprophyticus (-) considerado el
segundo agente causal de infecciones agudas del tracto urinario luego del
Escherichia coli y también identifica al S. Epidermidis (+) que se asocia a
infecciones principalmente en pacientes con catéteres intravenosos debido a que se
encuentran en mucha cantidad en la piel.
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SELLO Y FIRMA DE INSTRUCTOR:
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