OBTENCIÓN DE UNA BEBIDA FERMENTADA A PARTIR DE
SUERO DE QUESO UTILIZANDO CÉLULAS INMOVILIZADAS DE
KLUYVEROMYCES MARXIANUS
Rocío Cóndor G.1, Víctor Meza C.2 y Fanny Ludeña U.3
RESUMEN
El presente estudio tuvo como objetivo principal optimizar la
tecnología de producción de una bebida fermentada de suero
de queso, utilizando Kluyveromyces marxianus e
inmovilización de células.
En el biorreactor de lecho empacado, se obtuvo el mayor
rendimiento (11,46±0,81 oGL) con un flujo de 140-150 mL.
h-1, una biomasa inmovilizada de 10% (v/v), una relación de
columna de 1:12 (diámetro: longitud), tamaño de perlas de 3
mm de diámetro, adición de metabisulfito de sodio (100 pg.
mL-1) y células inmovilizadas con 2% (p/v) de alginato.
Luego de optimizado todos los parámetros de fermentación
en el biorreactor, la bebida alcohólica fue sometida a
inactivación a 70 oC por 5 minutos (tratamiento térmico) y
clarificación con tierra de diatomeas (11 kg. M-2).
Finalmente, la bebida alcohólica fue evaluada en
almacenamiento por 6 meses, durante este período se le
hicieron evaluaciones fisicoquímicas, microbiológicas y
sensoriales. Se determinó por Escala Hedónica y Ranking que
la bebida alcohólica de suero tiene aceptabilidad.
Palabras clave: Suero de queso, biorreactor, inmovilización,
Kluyveromyces marxianus
ABSTRACT
This study has as its main objective the optimization of a
technology for the production of a fermented beverage from
cheese whey, using Kluyveromyces matxianus and cell
immobilization.
In a bed packed reactor, the best yield was obtained
(11,46±0,81 'GQ with a flux of 140-150 mL.h-1, an
immobilized biomass of 10% (v), a column rate of 1/12, a
size of pearl of 3 mm of diameter, an addition of sodium
metabisulphide (100 pg.mL-1) and immobilized cells with 2%
(w/v) of alginate.
After the fermentation parameters were optimized in the
bioreactor, the alcoholic beverage was inactivated at 70 oC
for 5 minutes (thermal treatment) and clarified with "tierra
de diatomeas" (1 kg. M-2) . Finally, the alcoholic beverage
was evaluated in storage for 6 months, during this period
physicochemical, microbiological and sensorial tests were
made. Hedonic Scale and Ranking tests showed that the
alcoholic beverage had acceptability
Key words: Cheese whey, bioreactor, immobilization,
Kluyveromyces marxianus
INTRODUCCIÓN
En el Perú, actualmente, en el campo de las industrias productoras
de queso, se tiene un problema latente sin resolver, el cual se
genera debido a la gran producción de suero compuesto que se
desecha a través del alcantarillado municipal generando problemas
de contaminación ambiental. Para tener una idea de la cantidad de
suero que se produce sólo en la Universidad Nacional Agraria La
Molina (UNALM), se sabe que la Planta Piloto de Leche destina entre
270 a 750 litros de leche para la producción de quesos, por lo que
se obtienen entre 235,17 a 653,25 litros de suero, diariamente.
Alrededor de 45 kilos de leche cruda darán 4,5 kilos de Demanda
Bioquímica de Oxígeno-DBO (Braile, 1993). Con el fin de controlar y
reducir las descargas de desechos líquidos de las industrias
productoras de queso, se podría mejorar el proceso de producción
de la planta, tratar los desechos líquidos o aprovecharlos.
En el presente trabajo, se buscó aprovechar el suero de que sería de
la Planta Piloto de Leche de la UNALM, utilizando la tecnología de
inmovilización de células para la producción de una bebida
fermentada. Se establecen también los parámetros necesarios para
que se pueda optimizar su producción. Resaltando la importancia de
la Biotecnología en la optimización de procesos para el
mejoramiento del aprovechamiento del suero.
En la actualidad, el consumo de bebidas lácteas a partir de suero,
está muy difundida por su valor nutritivo y menor costo (Kriel,
1980; Sabaa-Srur et al., 1995). Industrialmente el suero sirve como
ingrediente en la elaboración del kefir (Garibay et al., 1993),
kourniss (Garibay et al., 1993) y bebidas lácteas con frutas (Fresnel
y Moore, 1978). Otra línea de producción creciente son las bebidas
lácteas fermentadas con bacterias o mezclas de éstas con levaduras,
las cuales generalmente se mezclan con jugos u hortalizas u otros
saborizantes (Garibay et al., 1993).
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología
"Marino Tabusso" de la Facultad de Ciencias y en la Planta Piloto de
Leche de la UNALM. Se trabajó con suero de queso fresco,
Kluyveromyces marxianus (Kluyveromyces fragilis NRRL Y-2415) y
alginato de sodio (SIGMA).
INMOVILIZACIÓN DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS
La levadura fue repicada de un tubo que contenía la cepa madre a
un medio de cultivo en placa; se incubó a 30oC durante 5 días.
Después se tomaron 20 asadas y se llevó a 200 mL de suero
acondicionado (pH 4,5 y desproteinizado), contenidos en un
erlenmeyer de un litro. Se incubó a 30oC durante 10 horas. Para la
recuperación de las levaduras, el cultivo se centrifugó a 5 000 rpm
durante 10 minutos; las células sedimentadas fueron suspendidas y
lavadas dos veces con una solución de peptona al 0,85% y se
almacenaron a 4oC hasta su utilización.
Para el proceso de inmovilización, se autoclavó 2,0 g de alginato de
sodio con 30 mL de agua destilada; a esta mezcla se le agregó una
suspensión de levaduras (se evaluaron diferentes concentraciones:
10, 20, 30% v/v) y finalmente, se completó con la cantidad de agua
destilada necesaria para llegar a 100 mL (concentraciones final: 10,
20 ó 30% de blomasa). La mezcla se dejo caer sobre una solución
de cloruro de calcio 0,lM y se dejó polimerizar durante 1 hora.
Posteriormente se trasladó las perlas formadas a una solución de
cloruro de calcio 0,05M y se refrigeró 24 horas. Finalmente se
trasladó a una solución de cloruro, de calcio 0,025M donde se
mantuvieron basta su uso en refrigeración (Marwaha et al., 1988).
Antes de ser utilizadas, fueron lavadas con una solución salina para
remover los iones de calcio que estuvieran en exceso (Chibata et al.,
1987; Marwaha et al., 1988; Mc Ghee et al., 1982). Para conocer el
número de células en cada perla, se dejó gotear 1 mL de la mezcla
sobre agua. Luego se hizo el conteo de las células con la cámara de
Neubauer, expresando resultados en número de células.mL-1 de gel.
DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE METABISULFITO DE SODIO
SOBRE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN CON DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE LEVADURA
Se evaluaron tres concentraciones de levadura: 10, 20 y 30% (v/v);
en sistemas sin metabisulfito y con 100 mg.mL-1 de metabisulfito.
Se trabajó con 50 µL de sustrato (21o Brix) y 100 perlas con las
diferentes concentraciones de células. Se incubó a 30oC por 7 días
(Fresnel y Moore, 1978; Gawel y Kosikowski,1978; Yang et al.,
1979), evaluándose la cinética de fermentación con la lectura de
grados Brix y pH (Núñez y Lema, 1987).
DETERMINACIÓN DEL FLUJO ÓPTIMO EN EL BIORREACTOR DE
LECHO EMPACADO
En una relación de columna diámetro: longitud de 1:12 (2,2:26,4
cm), se empacó 70% de su capacidad (3000 perlas); el contenido
de biomasa de las perlas fue de 10% (v/v), lo que representó un
rango de 5,3 x 10 8 a 1,2 x 10 9 células. mL-1 de gel. El suero
acondicionado (pH 4,5 y 21oBrix) se colocó en el depósito superior
del lecho. Se evaluaron 4 rangos de flujo: 50-60; 90-100; 140-150
y 240-250 mL. h-1 (Marwaha et al., 1988). Se trabajó todo el
proceso de fermentación a 30 oC, evaluándose diariamente los
grados Brix y el pH (Ough, 1996). Se determinó el flujo óptimo,
mediante el rendimiento medido en grados alcohólicos al final de la
fermentación.
DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA ÓPTIMA PARA EL PROCESO
FERMENTATIVO
Determinado el flujo óptimo, se probó tres concentraciones de
biomasa: 10, 20 y 30% (v/v), conteniendo un rango de 5,3 x 10 8 a
1,2 x 10 9 1,1 x 10 9 a 1,3 x 10 9 y 2,0 x 10 9 a 3,0 x l0 9 células.
ML-1 de gel, respectivamente. Se empacó perlas hasta un 70% de la
capacidad de la columna (1:12). Se evaluó diariamente la
concentración de azúcares (oBrix) y el pH. El grado alcohólico se
evaluó después de 7 días de fermentación.
DETERMINACIÓN DE LA DIMENSIÓN ÓPTIMA DE LA COLUMNA
Después de determinar el flujo y concentración de biomasa óptimos,
se evaluó tres relaciones de columna 1:12; 1:15 y 1:17 (diámetro:
longitud) que correspondían con las dimensiones de 2,2:26,4 cm;
2,2:33,0 cm y 2,2:37,4 cm, respectivamente. Se empacó perlas
hasta un 70% de la capacidad de la dimensión de la columna. Se
evaluó diariamente la fermentación con el control del grado Brix, pH
y -después de 7 días- el grado alcohólico.
INACTIVACIÓN Y CLARIFICACIÓN DE LA BEBIDA FERMENTADA
La inactivación de la bebida fermentada se hizo a 70 oC durante 5
minutos (Cóndor et al., 2000). Para realizar la clarificación, se
empleó tierra de diatomeas en una cantidad de 1 kg.m-2 (Molina,
1992). Se realizó la desinfección y clarificación por procedimientos
descritos anteriormente (Cóndor et al., 2000). Finalmente, se
agregó 50 µg.mL-1 de metabisulfito de sodio a la bebida, para su
conservación.
CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y MICROBIOLÓGICA DE LA
BEBIDA FERMENTADA DE SUERO DE QUESO
Evaluaciones fisicoquímicas: humedad (Pearson, 1976); cenizas
(Amerine y Ough, 1976); pH (Amerine y Ough, 1976); acidez total,
volátil y fija (Amerine y Ough, 1976); sólidos solubles totales
(Amerine y Ough, 1976); azúcares totales y reductores (AOAC,
1995); sulfuroso total y libre (Amerine y Ough, 1976); grado
alcohólico (Amerine y Ough, 1976); proteínas (AOAC, 1990).
Se realizaron las siguientes evaluaciones microbiológicas: recuento
de mesófilos aerobios viables; numeración de coliformes totales y
recuento de mohos y levaduras. Se tomó como referencia la Norma
Técnica Peruana 202.083 (1988).
EVALUACIÓN SENSORIAL DE LA BEBIDA FERMENTADA
La caracterización organoléptica se efectuó tomando en
consideración la Norma ISO 4121-1987.
La evaluación sensorial se llevó a cabo con 24 panelistas
semientrenados (Laboratorio de Análisis Sensorial-Programa de
Nutrición Humana, UNALM). Se determinó la aceptación del producto
con dos métodos: Escala Hedónica no estructurada (Amerine, 1965;
Pedrero y Pangborn, 1989) y el método de Ranking (Pedrero y
Pangborn, 1989). Como referencia se utilizó tres vinos de
características similares. Los resultados fueron evaluados
estadísticamente (Pedrero y Pangbom, 1989).
EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA DURANTE EL ALMACENAMIENTO
La bebida alcohólica envasada en botellas de 400 mL de capacidad
fue almacenada durante cinco meses bajo dos condiciones:
temperatura ambiente (botella transparente y oscura) y en
refrigeración (botella transparente). Durante este período se
evaluaron la acidez total y el pH.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
EFECTO DEL METABISULFITO DE SODIO SOBRE LA CINÉTICA DE
FERMENTACIÓN CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
LEVADURA
Se determinó que la cinética de fermentación con células
inmovilizadas (diferentes concentraciones de biomasa: 10, 20 y
30%), en sistemas sin y con adición de metabisulfito de sodio (100
µg.mL-1) es diferente. Se puede observar en la Fig. 1 que en
sistemas sin adición de metabisulfito, existe una relación directa
entre la biomasa inmovilizada y la cantidad de azúcares totales
(oBrix) que se consume. La mayor disminución de azúcares, se
obtiene con 30% (v/v) de levaduras inmovilizadas. Sin embargo, en
sistemas con metabisulfito se produce una relación inversa; se
obtuvo una mayor disminución de azúcares con 10% (v/v) de
levaduras.
Fig 1 Variación de la concentración
de azúcar (°Brix) durante la
fermentación con diferentes
concentraciones de levadura, en
sistemas sin y con adición de
metabisulfito de sodio.
Los resultados demuestran que K. marxiauns se ve afectada por la
adición del metabisulfito, y si a esto se suma la inmovilización de
células, el efecto es mayor, debido a que la inmovilización limita la
difusión de nutrientes. Además, las perlas están en un cultivo en
lote sin ningún tipo de agitación, por eso tienen una menor
transferencia de masa, lo cual se acentúa con el aumento de la
concentración de biomasa inmovilizada. Por otro lado, se sabe que
existe una relación física entre las perlas, las cuales se ven
modificadas en superficie e interfase por la acumulación de CO2 (Mc
Ghee et al., 1988).
FLUJO ÓPTIMO PARA OBTENCIÓN DE LA BEBIDA FERMENTADA
Se determinó que el mayor rendimiento (11,46 ± 0,81 oGL) para la
producción de la bebida fermentada de suero se obtiene con un flujo
de 140?150 mL.h-1 (ver Fig. 2). De manera similar, se ha reportado
un flujo de 142 mL.h-1 como óptimo para la producción de alcohol a
partir de suero en un biorreactor de lecho empacado (Marwaha et
al., 1988). El valor obtenido puede deberse a que en estas
condiciones la levadura K. marxianus logra una mejor transferencia
de masa, transformando los azúcares presentes en el medio.
Además, debe generarse la suficiente turbulencia como para
permitir la remoción de catabolitos que pueden inhibir la actividad
de las levaduras, en biorreactores con células inmovilizadas (Dale et
al., 1994; Núñez y Lema, 1987; Parascandola et al., 1997). Al ser
comparados los rendimientos entre células inmovilizadas y libres de
K. marxianus, se observa un mayor rendimiento para las primeras,
con valores de grado alcohólico de 11,46 ±0,81 y 9,83 ± 0,55 oGL,
respectivamente. Se ha reportado que la mayor concentración de
etanol se obtiene con células inmovilizadas que con células libres en
fermentaciones con K marxianus IMB3 y sacarosa (Ferguson et al.,
1998).
Fig. 2 Valoración de la
concentración de azúcar (°Brix)
durante la fermentación con
diferentes flujos de inmovilización
BIOMASA ÓPTIMA PARA LA OBTENCIÓN DE LA BEBIDA ALCOHÓLICA
Se determinó que el mayor rendimiento 0 1,46 ± 0,81oGL) para ]a
producción de ]a bebida fermentada de suero se obtiene con una
biomasa de 10% (v/v) (ver Fig. 3), con respecto a las
concentraciones de 20 y 30% respectivamente. Esto se debe a que
las altas concentraciones de levaduras ocasionan una tasa de
consumo de sustrato superior a la tasa de transferencia de producto
al exterior de la perla, lo cual puede inhibir a las levaduras
inmovilizadas. Se señala que una mayor concentración de levaduras
inmovilizadas por unidad de gel en las perlas de alginato disminuye
el coeficiente de difusión del sustrato y productos (Divies et al.,
1994). Además, el sustrato, para ser utilizado por las células
inmovilizadas y empacadas en una columna, tiene que pasar por
varias barreras; primero atraviesa la interfase perla y medio líquido,
luego habrá limitaciones disfusionales dentro de la perla y
finalmente el sustrato atravesará la pared celular (Wiseman, 1991).
Fig. 3 Variación de la concentración
de azúcar (°Brix) durante la
fermentación con diferentes
concentraciones de levadura (%v/v)
Tabla 1. Evaluación fisoquímica de la bebida fermentada
Análisis Bebida Alcohólica
Humedad (%) 92,87 ± 0,84
Cenizas (g.l-1) 4,46 0,58
pH 3,8 0,90
Acidez total, expresada en g.l-1
3,25 0,05
ácido sulfúrico
Acidez volátil, expresada en g.l-1
0,48 0,33
ácido ascético
Acidez fijada (g.l-1 H2SO4) 2,62 0,35
Sólidos solubles (°Brix) 10,77 0,87
Azúcar total 5,50 0,10
Azúcar reductor 5,14 1,17
Sulfurosos total (mg.mL-1) 64,00 1,20
Sulfuroso libre (mg.mL-1) 16,00 2,40
Sulfuroso combinado (mg.mL-1) 48,00 1,40
Grado alcohólico (°GL) 11,47 0,81
Proteína (%) 0,10
El empleo de altas concentraciones de células entrampadas en
alginato acorta el tiempo requerido para la producción del máximo
rendimiento de alcohol; sin embargo, el porcentaje de células que
sobreviven decrece con el aumento de la concentración inicial de
células (Yousef et at., 1989). Las levaduras inmovilizadas se pueden
ver afectadas en su rendimiento por efectos de la gran producción
de CO2 por unidad de perla. La producción de CO2 es 2,5 veces
mayor en células inmovilizadas en alginato que en células libres a 5
y 10% de etanol (Ciesarova et al., 1998). Con respecto a la adición
de metabisulfito y diferentes concentraciones de levadura
inmovilizada, se obtiene un perfil muy parecido de disminución de
azúcares al obtenido en cultivos en lote. Una mayor disminución de
azúcares totales con la menor concentración de biomasa, 10%
(v/v).
RELACIÓN ÓPTIMA DE LA COLUMNA PARA LA OBTENCIÓN DE LA
BEBIDA ALCOHÓLICA
Se determinó que el mayor rendimiento de grados alcohólicos
(11,46 ± 0,81 oGL) en la producción de la bebida fermentada se
obtiene con una relaci6n de columna de 1: 12 (ver Fig. 4). Esto
podría deberse a que se generan dimensiones Intermedias que
permiten una buena transferencia de masa y una eficiente liberación
de CO2 Experimentos realizados con células inmovilizadas en
alginato y en lecho empacado determinaron que las dimensiones del
biorreactor afectan la productividad y eficiencia de la fermentación
debido al CO2 y efectos de la transferencia de masa (Buzas et al.,
1990; Yadav et al., 1996).
Fig 4 Variación de la concentración
de azúcar (°Brix) durante la
fermentación con diferentes
dimensiones de la columna.
Por otro lado, la relación de columna 1:12 permite dimensiones que
hacen que se mantengan condiciones equivalentes en cada parte de
la columna, de tal manera que las perlas que están ubicadas en la
base de la columna presentan igual conversión de azúcares que las
perlas ubicadas en la parte superior. Probablemente, las otras
relaciones de columna (1:15 y 1:17) no presentan condiciones
similares a lo largo de la columna, pudiéndose afectar las perlas que
están en la base de la columna, porque soportan una mayor presión
física.
CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA BEBIDA ALCOHÓLICA DE
SUERO
Los resultados se presentan en el Tabla 1. Los valores determinados
están dentro de los rangos permitidos para bebidas alcohólicas
similares (NTP, 1995; Ough, 1996; Peynaud, 1989; Asaba-Srur et
al., 1995).
CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA
Después del almacenamiento de la bebida, se ha obtenido un
recuento menor a 10 de mesófilos aerobios viables (UFC.mL-1); un
recuento menor a 10 de mohos y levaduras (UFC.mL-1) y una
numeración menor a 3,0 de coliformes totales (NMPmL-1). Esto
indica que la bebida es microbiológicamente aceptable y que los
métodos de inactivación y estabilización efectuados son los
adecuados.
COMPORTAMIENTO EN ALMACENAMIENTO
Después de terminada la fermentación, se eliminaron las levaduras
mediante clarificación con tierra de diatomeas (1 kg.m-1). Luego se
evaluó el comportamiento en almacenamiento a temperatura
ambiente y refrigeración, con pH iniciales de 3,4 y acidez total de
3,6 g/l H2SO4.
Se tuvo en el primer mes un descenso en acidez total y un aumento
del pH. Esta pérdida de acidez total inicial se puede deber a la
precipitación de sales, proteínas y ciertos compuestos que son
insolubles a bajas temperaturas, y pueden modificar las
características microbiológicas y organolépticas de la bebida.
Además, a bajas temperaturas se facilita la solubilidad de los gases
disueltos (Peynaud, 1989).
A partir del segundo mes, hasta los cinco meses que duró la
evaluación, se observó un perfil variable del pH y acidez total. En
general a temperatura ambiente (22 oC) y en refrigeración (4 oC)
las características evaluadas de la bebida fermentada presentaron
un comportamiento similar. Se obtuvieron valores finales a
temperatura ambiente y refrigeración, pH 3,7 y 3,9 y acidez total de
3,2 y 3,3 g/l H2SO4, respectivamente.
Luego, se evaluó la bebida fermentada en botellas transparentes y
oscuras, y se determinó que éstas últimas mantienen sus
características organolépticas.
EVALUACIÓN SENSORIAL DE LA BEBIDA FERMENTADA
La caracterización organoléptica realizada en un Laboratorio
Certificado indica que la bebida alcohólica de suero tiene un olor y
sabor característicos de un vino semiseco.
La evaluación de aceptación realizada con la prueba de Ranking,
concluyó que las tres muestras evaluadas comparadas con el control
(bebida alcohólica de suero) son inferiores. Con Escala Hedónica, se
evaluó el atributo olor, color y sabor, y se obtuvo 77 ±2,83; 59 ±
14,85 y 68,5 ±12,02% de aceptación, respectivamente, lo que
indica solo discrepancia con el atributo color y sabor.
CONCLUSIONES
1. En un sistema sin metabisulfito de sodio, la concentración óptima
de células inmovilizadas es de 30% (v/v), y para un sistema con
metabisulfito de sodio la concentración óptima es de 10% (v/v).
2. El mayor rendimiento (11,46 ± 0,81 oGL) en un biorreactor de
lecho empacado se obtiene con las siguientes condiciones; un flujo
de 140-150 mL.h-1, una biomasa inmovilizada de 10% (v/v), una
relación de columna (diámetro: longitud) de 1:12, tamaño de perlas
de 3 min, adición de metabisulfito de sodio (100 mg.mL-1) y células
inmovilizadas con 2% (p/v) de alginato.
3. Optimizados los parámetros de producción de la bebida
fermentada en un biorreactor de lecho empacado, se obtuvo una
bebida con: 11,47 ± 0,81 oGL; 0,48 ± 0,33 g.1-1 de acidez,
expresado en ácido acético; 64 ± 1,2 mg.mL-1 de sulfuroso total;
0,46 % de cenizas y 0,1% de proteínas en 7 días de fermentación.
4. La calidad microbiológica de la bebida fermentada es aceptable.
5. Las botellas oscuras permitieron mantener las características
organolépticas de la bebida fermentada.
6. La evaluación sensorial de la bebida alcohólica, tanto por Escala
Hedónica como por Ranking, demuestra que la bebida tiene
aceptación.
Ver referencias
____________________________________________
1. Investigadora del Laboratorio de Microbiología "Marino Tabusso", Departamento de
Biología, UNALM.
2. Profesor Auxiliar. Departamento de Biología, UNALM.
3. Profesora Asociada, Departamentos de Tecnología de Alimentos y planta piloto de Leche,
UNALM
