UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
INFORME DE GENÉTICA Y EMBRIOLOGÍA: SEMANA 9
NRC: 8106
DOCENTE:
Peña Piscoya Hugo Heriberto
GRUPO 2:
Espejo Zavaleta Jeniffer Pamela
Fernández Castillo, Fabiana Valeria
García García Santiago Ricardo
Gonzales Miranda Ariana Nicole
Graus Morillo Sharon Nickole
Heredia Pereyra Luis Angel
TRUJILLO – PERÚ
2022
INTRODUCCIÓN
La citogenética es la rama de la genética que se ocupa del estudio de los cromosomas, así
como de sus efectos potenciales sobre la vida humana, pero para que esto sea posible ha
tenido que intervenir el desarrollo tecnológico que ayude al diagnóstico, podemos crear un
mapa genético que sirva de guía en un tratamiento en concreto, entonces podemos decir que
la FISH proporciona a los investigadores una manera de visualizar y mapear el material
genético en las células de una persona en cuestión, fusionado con un gen específico o parte
del gen.
La FISH es una técnica para detectar secuencias de ADN en células o tejidos preservados
utilizando una sonda marcada con fluorocromo, dirigida a un sitio específico en los
cromosomas y que emite una fluorescencia observable a través del microscopio.
También podemos añadir 3 tipos diferentes de sondas de FISH, que tienen distintas
aplicaciones: Sondas site-specific, se incorporan a una región concreta del cromosoma. Esta
clase de sondas es efectiva cuando los científicos aíslan una pequeña porción de un gen. Las
sondas alfoides o sondas centroméricas de repetición, se generan a partir de la secuencia
repetida ubicada en el medio de cada cromosoma. Por último, las sondas de cromosomas
completos son un grupo de sondas más pequeñas, todas unidas a una secuencia diferente en
un cromosoma en particular.
Después de revisar varios conceptos, el objetivo de este trabajo es estudiar la hibridación in
situ fluorescente como una prueba molecular para ayudar al diagnóstico y al análisis
citológico, respectivamente, para lograr una interpretación efectiva de FISH.
PRÁCTICA DE GENÉTICA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
PRUEBA DE CITOGENÉTICA MOLECULARES DE APOYO AL
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS: HIBRIDACIÓN
FLUORESCENTE IN SITU (FISH) EN LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA.
CASO CLÍNICO:
Un niño de 2 años de edad sin antecedentes patológicos de importancia presentó, 2 meses
antes del diagnóstico, astenia, dolor óseo generalizado y pérdida de apetito; al examen físico,
presentó palidez y aumento de las dimensiones del bazo. El hemograma reportó anemia
microcítica (hemoglobina de 11,7 g/dl), hiperleucocitosis (80,8 x109/L) y trombocitosis
(721x109/L). El frotis de la sangre periférica evidenció eritrocitos maduros microcíticos e
hipocrómicos, neutrofilia asociada a basofilia y blastos (1%). El estudio de biopsia
osteomedular reflejó una marcada hiperplasia mieloide (100% de celularidad);
megacariocitos aumentados en número con frecuentes formas pequeñas monolobuladas y
blastos menos del 3% de la población total. El estudio de FISH (Fluorescent In Situ
Hybridization) reportó 46, XY, t(9;22) (q34;q11.2) con el gen de fusión BCRABL1. El test de
RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) para BCR-ABL1 fue positivo.
Todos los datos obtenidos confirmaron el diagnóstico de Leucemia Mieloide Crónica en fase
crónica. El paciente inició tratamiento ambulatorio con mesilato de imatinib 200 mg/día en
agosto de 2010; posteriormente, los estudios de enfermedad mínima residual por RT-PCR
para BCR-ABL1 fueron negativos desde el enero 2012 hasta marzo del 2015.
Amaru Calzada A, et. al. Leucemia mieloide crónica en niño de 2 años. reporte de caso. Rev
Med La Paz.2016,22(1).
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué es la citogenética molecular?
La citogenética molecular, disciplina que se puede definir como una combinación de la
citogenética clásica y la biología molecular. En conjunto, reúne una variedad de técnicas
para aplicar varios métodos de biología molecular directamente a preparaciones celulares
como tejidos, células, cromosomas y cadenas de ADN. El estudio de los cambios
cromosómicos bajo el microscopio es un foco importante de investigación, lo que nos
permite proporcionar datos importantes sobre la base genética de los trastornos neurológicos
y cognitivos de las enfermedades genéticas. Los métodos analíticos utilizados han pasado de
la microscopía óptica a la citogenética molecular, utilizando herramientas como la
"hibridación in situ" (FISH), la PCR y la MS-PCR, aumentando considerablemente la
precisión y detectando diferencias en la estructura cromosómica. , que es responsable de una
amplia gama de fenotipos variables e inmutables.
2. Defina la técnica FISH
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica de laboratorio que se usa
para detectar y localizar una secuencia de ADN
específica en un cromosoma. Un tinte
fluorescente se une a una pieza de ADN
purificada, posteriormente ese mismo ADN es
incubado con el conjunto completo de
cromosomas del genoma de origen, el cual ha
sido adherido a un portaobjetos de vidrio para el
microscopio. El ADN marcado con
fluorescencia encuentra su segmento
correspondiente en uno de los cromosomas
donde se pega. Realizando la observación de los
cromosomas en un microscopio, un investigador puede encontrar la región donde el
fragmento se ha unido al ADN debido al tinte fluorescente que llevaba. Esta
información revela la ubicación de ese pedazo de ADN en el genoma de partida.
3. Pasos para la técnica de FISH
Un protocolo típico para FISH incluye 4 pasos:
1. Fijación y permeabilización
Previo a la permeabilización, las muestras deben ser puestas en láminas de vidrio, y
con el fin de mantener una adherencia adecuada y que no se desprendan durante el
procesamiento, se recomienda cubrir la superficie con ciertos compuestos como
gelatina, Poly-L.lisina o hidruro de silicio. Cuando se trabaja con suspensión de
células microbianas, una vez fijadas y colocadas en la lámina de vidrio, se dejan secar
al ambiente y luego son deshidratadas en soluciones crecientes de alcohol
(50-70-96%) lo cual ayuda a permeabilizar las células. Estos son necesarios para
facilitar la penetración de la sonda fluorescente dentro de la célula y para proteger al
ARN de la degradación por ribonucleasas endógenas.
2. Hibridación
Proceso en el que a la muestra desnaturalizada se le añade la sonda de interés que se
unirá a la secuencia escogida del ARNr. Se realiza en la oscuridad en una cámara
húmeda, con temperaturas entre 37°C a 50°C y con tiempos que oscilan entre 30
minutos y varias horas. La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones
astringentes para obtener un óptimo anillamiento, en este caso, el tampón de
hibridación es precalentado y luego es aplicado a la muestra que contiene la sonda
marcada. El nivel de astringencia se puede ajustar variando tanto la concentración de
formamida o la temperatura de hibridación.
3. Lavado
Pasado el tiempo de hibridación, las láminas son lavadas con agua destilada para
remover la sonda que no se unió. Si se requiere se puede realizar un lavado
post-hibridación en condiciones astringentes, en este caso el tampón de lavado se
debe preparar variando la concentración de sales que de manera estándar contiene
NaCl 5 M, Tris / HCl 1 M, EDTA 0.5 M, agua destilada y SDS al 10%47.
4. Detección de las células marcadas
El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó
con las células. Se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con
diferentes filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en
cuenta el tipo de fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera
emplear la longitud de onda adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la
fluorescencia
4. ¿La técnica FISH permite el estudio de la expresión de ARN?¿Por qué?
La técnica de FISH, si permite el estudio de la expresión de ARN, debido a que es una
técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células (ADN o
ARN) gracias a la hibridación fluorescente in situ. La importancia de esta técnica
radica en la capacidad que tiene la sonda de ADN en detectar una región específica de
ácido nucleico de la célula microbiana y ser visualizada por microscopía de
epifluorescencia, también nos proporciona información relevante sobre la regulación
de la expresión génica.
Asimismo, su aplicación permite la observación de la estructura genómica
intranuclear y la dinámica transcripcional subcelular de muchos genes, incluso
revelaron sus funciones en varios procesos biológicos.
5. ¿La técnica FISH solo nos permite analizar cromosomas en metafase?
De hecho la técnica de FISH también nos permite analizar e identificar cromosomas en la
interfase. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es la principal técnica de
citogenética molecular, que se puede utilizar con muchas finalidades tales como: determinar
lesiones en la metafase, y también para detectar anomalías numéricas de cromosomas
estudiando núcleos en interfase sin que haya metafase o traslocaciones en interfase o el
conteo del número de copias en núcleos en interfase. Pero esto va a depender de la longitud
del daño que exista en el ADN.
6. ¿Cuál es la diferencia entre la hibridación cromogénica in situ (CISH) y FISH?
En la actualidad hacemos uso de 2 formas diferentes para la visualización de objetivos de
ARN y ADN: la detección cromogénica in situ CISH (Chromogenic in situ hybridisation) y la
fluorescencia FISH (Fluorescence in situ hybridization). La técnica de hibridación es similar
tanto en FISH como CISH, siendo la principal diferencia la amplificación de la señal
(inmunohistoquímica), la mayor cantidad de información que se obtiene de la visualización
de los resultados en el tejido. Comparando FISH y CISH: FISH, debido a que se trata de una
técnica citogenética de tipo molecular, puede detectar simultáneamente cambios
cromosómicos numéricos y estructurales en un locus específico, sin embargo cuenta con un
costo más elevado, mayor tiempo de proceso, su evaluación morfológica es limitada a pesar
de que su sensibilidad y especificidad es mejor. Por su parte, CISH cuenta con un menor
costo y tiempo de proceso además tiene mejor correlación con morfología, permite identificar
mejor el componente neoplásico y no neoplásico del tejido, produce un marcaje permanente y
no necesita microscopio de fluorescencia.
7. Interprete la figura 1
La Figura 1 nos presenta un estudio de Fluorescente in situ hybridization (FISH), este estudio
es una técnica de laboratorio que se usa para identificar y localizar secuencias específicas de
ADN en un cromosoma. La técnica consiste en exponer los cromosomas a una pequeña
secuencia de ADN (sonda) a la que se une una molécula fluorescente. La secuencia de la
sonda se adhiere con su secuencia correspondiente en el cromosoma.
En esta imagen se observa anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide
crónica, en la que se produce una activación oncogénica por translocación del oncogén ABL
(verde) ubicado en el cromosoma 9 con el BCR (rojo) del cromosoma 22, formando una
fusión híbrida genética de BCR-ABL, este gen de fusión híbrida codifica una proteína que
aumenta la actividad de la tirosina quinasa con potencial neoplásico.
La ubicación exacta del punto de ruptura en el gen BCR y en el gen ABL, así como la
proteína de producto BCR-ABL nos ayudarán a determinar el fenotipo de la enfermedad para
así poder determinar el tratamiento del cáncer y los cuidados que se deben seguir.
CONCLUSIONES:
● La citogenética es la rama encargada del estudio de los efectos genéticos de la
estructura y el comportamiento de los cromosomas. Hoy en día, gracias a los
asombrosos avances en citogenética molecular de alta resolución, existe un amplio
arsenal de herramientas para estudiar la estructura y función del genoma.
● Actualmente, la principal técnica de citogenética molecular es la hibridación in situ
fluorescente o FISH (fluorescent in situ hybridization). Esta técnica es rápida,
presenta una gran especificidad y sensibilidad, incluso en células pequeñas.
● Un protocolo típico de FISH consta de 4 pasos: Fijación y permeabilización,
hibridación, lavado y detección de las células marcadas.
● Gracias a la FISH podemos diagnosticar enfermedades basadas en aneuploidías y
poliploidías.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
● Thompson y Thompson. Genética en Medicina, Séptima edición. Elsevier Masson.
San Francisco, California.
● Jorde Carey Bamshar. Genética Médica. Cuarta edición. Elsevier España, S. L.
Barcelona, España. 2012.
● RIMOIN D. L., PYERITZ R.E., KORF B.R. (2013) Emery and Rimoin’s Essential
Medical Genetics. Elsevier Ltd.
● HAROLD CHEN, MD, FAAP, FACMG (2006) Atlas of Genetic Diagnosis and
Counseling. Humana Press.
● ELDER K., DALE B. (2000) In Vitro Fertilization. Cambridge University Press.
● HARPER J. C., DELHANTY J. D.A., HANDYSIDE A.H. (2001) Preimplantation
Genetic Diagnosis. John Wiley & Son, Ltd.
● SCHNEIDER K. (2002) Counseling About Cancer Strategies For Genetic
Counseling. Wiley-Liss
● Rodríguez Martínez R. Empleo de la técnica hibridación in situ fluorescente para
visualizar microorganismos. Rev Univ Ind Santander Salud [Internet]. 2011 [citado el
22 de mayo de 2022];43(3):307–16. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-080720110003000
12
● Raúl Rodríguez Martínez, Gina Suescún Otero. Aplicaciones e inconvenientes de la
técnica Hibridación in situ Fluorescente (FISH) en la identificación de
microorganismos.Rev Salud Unid [Internet]. 2013[citado el 22 de mayo de 2022].
Disponible en:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-555220130002000
17#:~:text=Un%20protocolo%20de%20la%20t%C3%A9cnica,epifluorescencia%20o
%20confocal%20(6)
