PRACTICA 3. AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE BACTERIAS Y HONGOS.
Aislamiento de bacterias aerobias, anaerobias facultativas y actinomicetos.
OBJETIVOS
El alumno aplicará las técnicas de las diluciones y de estría cruzada para el aislamiento de
bacterias y hongos de muestras de suelo y agua. Empleará las técnicas de dilución y siembra
en estrías para la obtención de cultivos puros. Aplicará técnicas para la conservación de cultivos
puros.
FUNDAMENTO. Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como
poblaciones mixtas. Para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismo, este
debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axénico, que significa que está formado por
microorganismos de la misma especie.
El oxígeno puede ser esencial para algunos
microorganismos, pero tóxico para otros. La
capacidad de los microorganismos para
crecer en presencia o ausencia de oxígeno
está directamente relacionada con su
metabolismo y con la presencia o ausencia de
enzimas que los protegen del efecto tóxico de
los productos del oxígeno. Con base en los
requerimientos de oxígeno, los
microorganismos se han agrupado en
Aeróbico Microaerofílico Facultativo Anaeróbico
aerobios estrictos, anaerobios facultativos,
Figura 1. Clasificación de los microorganismos con base a los requerimientos de
oxígeno. (1)
anaerobios estrictos, anaerobios tolerantes y
microaerofílicos.
Para estudiar a los microorganismos de una muestra es importante considerar la naturaleza
de esta: si es líquida se tendrá que homogenizar para distribuir a los microorganismos y que al tomar
una alícuota, sea representativa de la misma; si es sólida, se debe tratar de tal manera que se separen
sus componentes en un diluyente y obtener una suspensión de los microorganismos presentes.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios métodos, los más usados son el método
de la estría cruzada y el de las diluciones.
El método de las diluciones consiste en hacer una serie de diluciones, generalmente
decimales, de las cuales se toman alícuotas que se siembran en medios de cultivo sólido: esparciendo
la alícuota sobre el medio con un asa acodada o bien mezclando la alícuota con medio de cultivo
fundido en un tubo y enfriado a 45º C, vertiendo inmediatamente en una caja de Petri estéril.
Es importante no confundir los términos dilución y disolución; este último implica la acción de
disolver, es decir, una separación de componentes – lo que no sucede con los microorganismos -
mientras que diluir hace referencia a una disminución de la concentración, en este caso del número
de microorganismos por unidad de volumen.
Figura 2. Método de las diluciones (4)
El asa bacteriológica (o de inoculación) es la herramienta más utilizada en el laboratorio de
Microbiología. Está compuesta por un alambre largo de platino fijado a una varilla metálica. Se puede
utilizar en forma de arillo o de aguja.
Figura 3. Asa bacteriológica (4)
El método de la estría cruzada consiste en depositar en un área de la placa de medio de cultivo sólido
una asada de la muestra o cultivo mixto que sirve de inóculo, el cual se extiende con el asa.
En el caso de la siembra de microorganismos por estría cruzada, se usa el asa con arillo; ésta
debe tomarse de manera similar a como cuando se toma un lápiz para hacer sombreados en papel.
La forma de hacer estría cruzada depende de la densidad de la muestra, cantidad disponible de la
misma, y en parte, de la finalidad del cultivo; los métodos más comunes se muestran en la siguiente
figura.
CUADRANTES (método A)
1. Pon una asada de la muestra sobre el Área 1 cerca del borde de la caja. Extiende con el asa
suavemente en la superficie del medio. Procura no romperlo.
2. Esterilizar el asa, déjala enfriar, toca con el asa un área estéril del medio antes de estriar para
asegurarte de que esté fría y haz 5 - 6 estrías del Área 1 al Área 2.
3. Esteriliza el asa nuevamente, deja enfriar y haz 6 - 7 estrías desde el Área 2 hasta el Área 3.
4. Esteriliza el asa de nuevo y haz tantas estrías como sea posible desde el Área 3 al Área 4, utilizando
el resto de la superficie de la placa. Esteriliza el asa una vez que termines.
CUADRANTES (método B)
1. Extiende con el asa suavemente en la superficie del medio una asada de la muestra sobre el Área
1 comenzando en el punto designado por "s" cerca del borde de la caja en forma de zigzag. Procura
no romperlo.
2. Esteriliza el asa, déjala enfriar, toca con el asa un área estéril del medio antes de estriar para
asegurarte de que esté fría
3. Gira la placa 90 grados manteniéndola cerrada. Estría el área 2 con movimientos de ida y vuelta,
tocando el inóculo original algunas veces.
4. Esteriliza el asa nuevamente. Gire la placa y estría el área tocando el área anterior varias veces.
5. Esteriliza el asa, enfría y gire la placa 90 grados nuevamente. Estría el área 4, tocando el área 3
varias veces y arrastra el cultivo como se ilustra para finalizar. Esteriliza el asa al terminar.
CONTINUA
1. Comienza en el borde de la placa (Área A) con una asada de la muestra, propaga los organismos con
un movimiento continuo hacia el centro de la placa. Usa una ligera presión. Evita romper el medio.
2. Gira la placa 180 grado. Sin esterilizar aún el asa, continúa rayando la otra mitad de la placa comenzando
en el Área B y trabajando hacia el centro. Esteriliza el asa al terminar.
RADIAL
1. Pon una asada de la muestra sobre el Área 1 cerca del borde de la caja. Extiende con el asa
suavemente en la superficie del medio. Procura no romperlo.
2. Esterilizar el asa, déjala enfriar, toca con el asa un área estéril del medio antes de estriar para
asegurarte de que esté fría. Desde el borde final del área 1, haz 7 u 8 estrías rectas hacia el lado
opuesto de la placa.
3. Esteriliza el asa nuevamente, enfría lo suficiente y traza estrías rectas comenzando cerca del borde
final del área 1. Esteriliza el asa al terminar.
Figura 4. Tipos de inoculación con el método de la estría cruzada (1)
Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que cada
grupo filogenético de microorganismos tiene características peculiares que se ven influenciadas por
las condiciones del medio.
Una colonia que se desarrolla en un medio sólido y procede de una sola bacteria, espora o
agrupación de microorganismo de la misma especie se denomina unidad formadora de colonias
(UFC).
Para calcular el número de UFC de una muestra procesada por el método de las diluciones,
se cuenta el número de colonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que tengan entre 30
y 300, se determina el número de UFC contenidas en un ml de la dilución usada para inocular cada
placa y se multiplica por la inversa de la dilución correspondiente.
Los actinomicetos (actinos, proyecciones radiales y mycos, hongo) son un grupo de bacterias
Gram positivas que poseen en su genoma un elevado contenido de guaninas y citosinas.
Su morfología microscópica es muy variable, va
desde organismos en forma de bacilo, cocoide o
corineformes (Actinomyces, Corynebacterium), bacilos que
pueden formar filamentos (Mycobacterium); formas
filamentosas que se ramifican (Streptomyces) y formas
filamentosas que pueden fragmentarse y dar elementos
cocoides (Nocardia). Figura 5. Actinomiceto teñido con tinción de
Gram. (7)
La morfología micelial y la formación de esporas asexuales de algunos actinomicetos es
semejante a la de los hongos, por lo que durante mucho tiempo se confundiera a estos dos grupos de
organismos no relacionados filogenéticamente y que solo constituyen un sorprendente ejemplo de
convergencia evolutiva. El micelio de los actinomicetos tiene un diámetro mucho menor al de los
hongos, por lo que se dice que es microsifonado. Las esporas pueden ser artrosporas, conidisporas o
esporangioesporas y resisten la desecación por largos períodos, aunque no son tan resistentes a la
temperatura como las endoesporas de Bacillus y Clostridium.
Figura 6. Colonias características de actinomyces (5) y (6)
Las colonias de actinomicetos en general son secas, duras, mate, lisas u ornamentadas,
hundidas en el medio de cultivo e hidrofóbicas; algunas producen pigmentos que excretan al medio.
Los actinomicetos se encuentran principalmente en el suelo, algunos son patógenos de
humanos, animales o plantas. La mayoría son saprófitos y quimiorganotróficos y tienen una función
muy importante en la degradación de los residuos orgánicos.
Una característica de este grupo es la producción de metabolitos secundarios que pueden
tener propiedades biológicas como antibacterianos, antifúngicos, inmunomoduladores, antivirales,
antitumorales, etc. Se han encontrado más de 500 antibióticos producidos solamente por miembros
del género Streptomyces.
Los actinomicetos son resistentes a sus propios antibióticos, aunque pueden ser sensibles a
los producidos por otro. Algunas especies del género Frankia, fijan simbióticamente nitrógeno
atmosférico.
DESARROLLO
MATERIAL
• Tubos de 16 mm X 150 mm estériles con tapón de aluminio o plástico;
• Pipetas de 1 ml y 10 ml estériles;
• Propipeta;
• Micropipetas de 1000 µl y 200 µl;
• Puntas para micropipetas estériles;
• Matraz Erlenmeyer con 100 ml de agua destilada estéril;
• 10 Cajas de Petri con agar nutritivo o agar cuenta estándar;
• 8 Cajas de Petri con agar Czapek (50 µg/ml de cicloheximida);
• Etanol comercial y varilla de vidrio acodada;
• Muestra de suelo o agua estancada.
MÉTODOS
Aislamiento por el método de las diluciones.
1. Numere 10 tubos de 16 X 150 mm que contengan 4.5 mL de agua destilada estéril.
2. Mida 0,5 ml de la muestra de agua estancada y adiciónela al tubo 1. Homogenice.
3. Realice una serie de diluciones decimales hasta la dilución 10 -10 (tubo 10), usando 0,5 ml
como volumen de transferencia. Lo ideal es usar una pipeta estéril para cada transferencia y
agitar en un vortex en cada paso. Ver esquema.
4. Marque la base de las cajas Petri con agar nutritivo con las diluciones que se van a sembrar.
5. Coloque 100 µl de las diluciones 10-5 a 10-10 en las superficies de igual número de placas.
6. Extienda las alícuotas en la superficie con una varilla de vidrio acodada (asa de Drigalsky)
estéril. La varilla se esteriliza mojándola en alcohol, escurriendo el exceso y pasándola por la
flama del mechero. Al extinguirse la flama, la varilla estará estéril.
7. Envuelva las cajas con la tapa hacia abajo, marque el paquete e incube a 37º C durante 24 h-
48 h.
8. Cuente las colonias en las cajas que tengan entre 30 y 300. Calcule el número de UFC/ml.
9. Conserve los cultivos en refrigeración para la siguiente práctica.
Esquema de diluciones y transferencia a placas de Petri.
0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
0.5 g de tierra
o 0.5 mL de agua
4.5 mL
0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL
Distribución con varilla de vidrio.
Aislamiento por la técnica de estría cruzada
1. Esterilice el asa, y de las diluciones 10-1, 10-3, 10-5 y 10-7, tome una asada y siembre por el
método de la estría cruzada, usando cualquiera de los esquemas mostrados.
2. Marque las cajas e incúbelas con la tapa hacia abajo a 37ºC durante 48 a 96 h. Revíselas
diariamente.
3. Conserve los cultivos en refrigeración para la práctica siguiente.
Aislamiento de actinomicetos
1. Haga diluciones de 10-1 a 10-3 a partir de una muestra de suelo (siga el mismo procedimiento
que en la parte de aislamiento por el método de las diluciones)
2. Coloque 100 µl de cada una de las diluciones en las cajas de agar Czapek y extienda con una
varilla de vidrio (con el mismo procedimiento de la parte anterior).
3. A partir del tubo original, siembre por estría cruzada una placa de medio de cultivo.
4. Incube a 28º C durante 3 a 5 días.
5. Cuente las colonias en las cajas que tengan entre 30 y 300
6. Calcule el número de UFC/ml.
7. Conserve los cultivos en refrigeración para la segunda parte de la práctica.
RESULTADOS
Aislamiento de bacterias aerobias y anaerobias facultativas
1. Anote el número de colonias de bacterias aerobias y anaerobias facultativas aisladas en medio
de gelosa nutritiva o gelosa cuenta estándar para cada dilución y calcule el número de UFC/ml
de agua estancada.
Dilución No. de colonias/0.1ml No. de colonias/ml UFC/mL
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
2. Indique cuantas formas coloniales se observan en cada una de las placas utilizadas ¿Tiene
eso algún significado?
3. Anote el número de actinomicetos (UFC/g) que se obtuvieron en cada una de las diluciones.
Dilución No. de colonias/0.1ml No. de colonias/ml UFC/mL
10-1
10-2
10-3
4. Realice observaciones al microscopio (tinción simple) de 3 colonias aisladas y haga
esquemas. Recuerde que los datos necesarios para validar los resultados de los
esquemas y requisito para todas las muestras que se analicen en este laboratorio son:
indicar el aumento microscópico utilizado (en este caso 100X), nombre del microorganismo
utilizando el esquema binomial Género especie, en caso de tratarse de una muestra
desconocida nombre las estructuras que reconoce, tipo de tinción (o si es sin teñir).
Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
CUESTIONARIO
Investigue las respuestas para las preguntas siguientes y con la información obtenida redacte un
texto a manera de discusión. No olvide escribir la bibliografía consultada.
1. ¿Por qué el método de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?
2. ¿Por qué es importante el método de la estría cruzada para verificar la pureza de un cultivo?
3. Mencione dos técnicas de enriquecimiento físicas y dos químicas para microorganismos que
estén en baja concentración en una muestra.
4. Si como se menciona en el fundamento, el oxígeno molecular es un agente oxidante muy
tóxico, ¿Cómo es que los organismos aerotolerantes lo soportan a concentraciones tan altas
como al atmosférica del 21%?
5. ¿A que dominio de Woese pertenecen los actinomicetos?
6. ¿Cuáles son las características sobresalientes de morfología colonial y microscópica que
permiten distinguir a los actinomicetos de otros grupos microbianos?
7. Mencione con ejemplos tres campos del conocimiento en donde los actinomicetos sean
importantes.
8. Mencione cinco ejemplos de actinomicetos (género y especie) productores de antibióticos.
OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
El mechero Bunsen,
produce una flama La esterilización del asa de
con dos conos. La inoculación se hace pasando
esterilización de el filamento por la punta del
instrumentos de cono interior de la llama,
inoculación se realiza comenzando por la base del
en la parte más mismo y continuando hasta el
caliente de la llama final asegurándose de que
(punta del cono toda esta pieza se caliente
interior). La fijación hasta un color naranja
con calor de los frotis uniforme. El asa debe enfriarse
bacterianos y la antes de tocarla o colocarla en
esterilización de las un cultivo, ya que lo primero
bocas de artículos de puede provocar quemaduras y
cristalería abiertos se lo último provoca aerosoles de
puede hacer en el microrganismos.
cono exterior de la
flama.
Para la técnica de extensión en placa se requiere de un mechero
Bunsen, un vaso de precipitado con alcohol, una varilla acodada Para esterilizar la varilla de vidrio, dentro del área de
de vidrio y la placa. Estos componentes deben estar dispuestos esterilidad proporcionada por el mechero, sumérjala en el
en el área de trabajo en el orden que se muestra (alcohol, alcohol, retírela y pásela a través de la llama para encender
mechero y placa) ya que de esta manera se reduce la posibilidad el alcohol. Dejar que el alcohol de la varilla se consuma
de prender fuego al alcohol. completamente. NO debe dejar la varilla en la llama; el
alcohol y el breve flameado son suficiente para esterilizarla.
Tenga cuidado de no dejar caer alcohol en llamas en la
superficie de trabajo o de regreso al vaso de precipitado que
contiene el alcohol.
Extensión del inóculo en la placa. Después de que la llama de la
varilla se haya, levante la tapa de la placa y úsela como escudo para
evitar la contaminación del aire. Luego, toque el agar con la varilla
en una superficie lejos del inóculo para enfriarla. Para difundir el
inóculo, sujete la tapa de la placa con la base del pulgar y el dedo
índice, y use la punta del pulgar y el dedo medio para girar la base.
Al mismo tiempo, mueva la varilla en sentido de ida y vuelta a través
de la superficie del agar. Después de un par de vueltas, haga una Una plataforma giratoria hace más fácil de girar
última vuelta con la varilla junto al borde de la placa. la placa durante la técnica de extensión.
BIBLIOGRAFÍA
1. Benson H. (2002). Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology.
Boston Mass: McGraw-Hill.
2. Leboffe M. J. & Pierce B. E. (2010). Microbiology Laboratory Theory & Application. United
States of America: Morton Publishing Company.
3. Reyna L. G. (2008). Manual de Prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología
Generales. México: Universidad de Guanajuato.
4. Naavena V, J. (2014). Microbiology Laboratory Manual. KERALA AGRICULTURAL
UNIVERSITY.
5. [Link]
y-del-molde-en-medios-selectivos-las-muestras-suelo-para-el-estudio-image143255253
6. [Link]
y-del-molde-en-medios-selectivos-las-muestras-suelo-para-el-estudio-image143255345
7. [Link]
1-10/
8. [Link]
9. [Link]
