Manual del laboratorio virtual
Clonación molecular
Resumen
La clonación molecular es una de las técnicas que han sentado las bases de la biotecnología
moderna. Se utilizó por primera vez en la década de 1980 y permitió la inserción de un gen
de la insulina humana en bacterias de levadura y E. coli. Esto posibilitó que los microbios
produjeran insulina, el medicamento principal en el tratamiento de la diabetes. Desde
entonces, la clonación molecular y la ingeniería genética se han convertido en técnicas
fundamentales en la producción farmacéutica, la producción de bioetanol y la investigación
básica y médica. En el laboratorio de clonación molecular, aprenderás a ensamblar un vector
de expresión que contiene RAD52 y GFP. El objetivo es controlar el nivel de expresión del
RAD52 con doxiciclina y monitorizarlo mediante la observación de la señal de GFP.
Ensamblaje de vectores
En la primera parte del laboratorio de clonación molecular, aprenderás a extraer ADN de
células de levadura y a limitar el aislamiento de enzimas en el ADN de otro vector. Primero,
prepararás el ADN extraído y medirás su concentración. A continuación, ensamblarás un
vector con el gen de interés (RAD52) y GFP utilizando la ligasa, la solución tampón y la
temperatura de incubación correspondientes.
Transformación
El vector ensamblado se transforma en células de levadura mediante electroporación. La
expresión del gen RAD52 la controla un regulador génico. Al añadir doxiciclina a los medios,
el gen RAD52 se silencia. El GFP se utiliza como gen indicador del RAD52; las células con
RAD52 activo también expresarán GFP y las células con RAD52 silenciado no expresarán GFP.
La señal de GFP se controla exponiendo las células a luz azul.
Daños y sistema de reparación del ADN
Existe la hipótesis de que el RAD52 desempeña un papel importante en la reparación del
ADN. Realizarás un experimento en el que compararás el resultado del daño inducido al ADN
mediante radiación UV en células que expresan RAD52 y células con RAD52 silenciado.
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Si el RAD52 realmente cumple una función importante en la reparación del ADN, las células
con RAD52 silenciado no sobrevivirán al tratamiento de radiación UV. En el laboratorio de
clonación molecular, entenderás los conceptos básicos de las técnicas de clonación
molecular y el gen reportero, y lo aprenderás todo sobre los daños y el sistema de reparación
del ADN.
Objetivos de aprendizaje
Al final de esta simulación, serás capaz de hacer lo siguiente:
● Entender las técnicas de clonación molecular: extracción y preparación de ADN,
ligación, transformación, siembra de placas y selección de antibióticos.
● Comprender la regulación de la expresión génica inducible.
● Entender el uso del GFP como gen reportero.
● Entender los daños y la reparación del ADN.
Técnicas de laboratorio
● Extracción de ADN.
● Transformación.
● Cribado de colonias.
● Clonación.
Teoría
Clonación molecular
La clonación molecular se refiere al ensamblaje de moléculas de ADN en un vector y la
posterior transformación de un organismo (normalmente bacterias o levaduras). Los métodos
de clonación molecular son fundamentales para la biología y la medicina. El término
«clonación molecular» comprende muchas técnicas diferentes. Generalmente, el proceso de
clonación molecular incluye los siguientes pasos:
1. Aislamiento del gen de interés.
2. Clonación del gen en un vector.
3. Transformación del organismo huésped con la construcción del vector.
4. Selección de antibióticos de las células transformadas.
5. Aislamiento de clones con el mismo origen genético.
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La confirmación del ensamblaje del plásmido se puede realizar mediante la secuenciación
del ADN. Es importante confirmar que los insertos se han ligado correctamente a un vector
plasmídico y que la conformación y el marco de lectura son correctos. El cambio de marco
puede causar mutaciones sin sentido o de sentido erróneo que conducen a la expresión de
proteínas no funcionales.
PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
La PCR es un método que se utiliza para preparar miles de millones de copias de secuencias
de ADN específicas, es decir, para amplificar una muestra de ADN. A menudo es necesario
tener un número de copias de una secuencia de ADN específica mayor al de una muestra
habitual para realizar análisis de ADN adicionales (como la identificación de huellas dactilares
o la genotipificación).
La reacción de la PCR es muy específica: solo produce copias de una secuencia a partir del
ADN molde (muestra). Esta especificidad está asegurada por los cebadores, que están
diseñados para ser complementarios y flanquear la región del ADN de interés (región
objetivo).
Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es un método utilizado para separar macromoléculas cargadas (ADN,
ARN o proteínas) de diferentes tamaños para calcular su longitud.
Como los ácidos nucleicos son iones con carga negativa en pH neutros o básicos en un
ambiente acuoso, esta técnica se suele usar para separar moléculas de ADN o ARN. Esto es
necesario, por ejemplo, en el caso de la elaboración de perfiles de ADN o para estudiar la
integridad del ARN.
A menudo, la electroforesis en gel se utiliza para separar fragmentos de ADN amplificados
por PCR. Este proceso también es útil para aislar y extraer fragmentos de ADN de un tamaño
específico.
En el laboratorio virtual, usaremos una máquina para llevar a cabo la electroforesis en gel
(consulta la imagen a continuación).
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Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción dividen la columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN
bicatenario. Estas reconocen un sitio específico del ADN bicatenario y lo parten dentro de su
sitio de reconocimiento (o adyacente a este). Las enzimas de restricción son una herramienta
muy importante en la biología molecular. Nos permiten cortar cadenas de ADN de manera
muy predecible.
Los extremos resultantes se dividen en:
● Extremos cohesivos: una cadena es más larga que la otra, lo que genera extremos 3’
o 5’ voladizos.
● Extremos romos: las dos cadenas se cortan por el mismo par de bases, lo que genera
extremos no voladizos.
●
A continuación tienes dos ejemplos de enzimas de restricción:
XbaI (pronunciado Xba-uno): produce extremos cohesivos. Reconoce este sitio de restricción:
5'---T CTAGA---3'
3'---AGATC T---5'
I-SceI (pronunciado Sce-uno): tiene un sitio de restricción muy singular, que no se da de
manera natural el genoma de los ratones ni en el de las personas. Por eso, es muy útil para
las restricciones altamente específicas. El Scel reconoce este sitio de restricción:
5'...TAGGGATAA CAGGGTAAT...3'
3'...ATCCC TATTGTCCCATTA...5'
Ligación del ADN
La ligación es un proceso que une covalentemente la columna vertebral del fosfato del ADN
bicatenario. Lo lleva a cabo una enzima llamada ADN ligasa.
Generalmente, la reacción de ligación consiste en dos pasos:
● Los extremos del ADN colisionan. Esta colisión se da por casualidad y su frecuencia
es menor a baja temperatura. Las bajas temperaturas estabilizan los enlaces de
hidrógeno entre los nucleótidos complementarios. La ADN ligasa alcanza su actividad
óptima a los 25 °C. La regla general es que, cuanto menor sea la temperatura, mayor
será el período de incubación.
● Reacción enzimática. La ADN ligasa cataliza la unión entre el hidroxilo del extremo 3’
y el fosfato del extremo 5’.
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Figura 1: El nucleótido de AMP se transfiere al fosfato del extremo 5’. A continuación, el OH
del extremo 3’ ataca el enlace AMP-fosfato, formando un enlace covalente a la vez que se
libera AMP.
Daños en el ADN
El ADN puede sufrir daños por radiación, luz ultravioleta, agentes alquilantes, iones de
hidrógeno y radicales hidroxilo. Una dieta inadecuada también puede provocar daños en el
ADN.
Los daños en el ADN provocan un cambio en su estructura molecular que, a su vez, puede
resultar en un cambio en la información genética. A continuación tienes algunos ejemplos de
daños en el ADN:
● Desaminación, depurinación y despirimidinación de bases.
● Daño oxidativo.
● Alquilación de bases.
● Roturas en la cadena sencilla o en la cadena doble.
Las roturas en la cadena doble son las más peligrosas, pues afectan a ambas hebras del ADN
y pueden provocar la pérdida de material genético.
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