UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
“AÑO DEL FORTALECIMIENTO DE LA SOBERANÍA NACIONAL”
TEMA:
INFORME 9: TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR: MÉTODO DE LA PCR
(Polymerase Chain Reaction).
CURSO:
ESTRUCTURA, FUNCIÓN CELULAR Y TISULAR I
DOCENTES ASESORES:
Dra. Morín Garrido Julia Violeta.
Dra. Lujan castillo Elva .
Dr. Rodríguez Sisniegas Guillermo Enrique.
ESTUDIANTE:
BRAVO HEREDIA YIARA AMNELI
2022
PRACTICA N° 9
INTRODUCCION
Diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos antes
imprevisibles, es una moderna realidad que se lleva a cabo gracias a una técnica
desarrollada en 1985, técnica que revolucionó los conceptos moleculares de la
biología y medicina.
La PCR es una técnica de Landeo de identificación de segmentos de ADN que
generalmente una máquina computadora de entre miles de segmentos reconoce a
estos como muy propios de esa especie, o muy propios de esa molécula, ese
segmento de ADN caracteriza a esa especie ya sea por paternidad responsable, por
reconocer una especie y por reconocer hasta incluso el ingreso de un clon para una
rectificación genética. Esta técnica es capaz de ampliar una molécula miles y
millones de veces, es una técnica también que se está usando con muy alta
sensibilidad para el reconocimiento, ya que pretende bajar de lo que antes era radio
isotopía a manejar con biotina marcada y ser usada para el laboratorio clínico. La
PCR tiene diversas aplicaciones como lo es el caso de los diagnósticos genéticos,
estudios forenses, diagnóstico de enfermedades infecciosas (COVID - 19) o estudios
de filogenia que muestran la relación evolutiva entre distintos organismos incluso
extinguidos.
I. MARCO TEORICO
CONCEPTO
La Reacción en Cadena de la polimerasa o prueba PCR es una técnica de
laboratorio que consiste en ampliar el ADN, mediante secuencias cortas del
mismo conocidas como cenadores, con el objetivo de elegir una parte del
genoma y amplificarla. El proceso implica variaciones repetidas de temperatura
que ayudan a la enzima de replicación de ADN a duplicar la secuencia del ADN
que se desea copiar. Esta técnica durante un par de horas es capaz de generar un
billón de copias de la secuencia.
ELEMENTOS NECESARIOS PARA HACER LA PCR
1. ADN molde: Contiene la región de ADN que se va a amplificar. El molde puede
ser también ARN previamente transformado en ADNc mediante transcripción
reversa.
2. ADN Polimerasa: Una enzima capaz de generar una copia de ADN desde un
ADN molde. Este proceso se realiza en un tampón apropiado para el
funcionamiento de la enzima polimerasa, con cofactores como cationes
divalentes, generalmente cloruro de magnesio (MgCl2).
3. Nucleótidos: Son moléculas orgánicas con mucha energía acumulada en los
enlaces de los grupos fosfato, que suelen ser utilizadas para la transferencia de
energía en los procesos metabólicos.
4. Desoxinucleótidos trifosfato (DNTP): Nucleótidos que se utilizan para generar
las nuevas cadenas de ADN.
5. Oligonucleótidos: Secuencia corta de ADN o ARN, alrededor de 50 pares de
bases o menos. Dentro de sus funciones están ser usados como cebadores en
reacciones de amplificación.
6. Ion Mg ++: Los iones divalentes actúan como cofactores de la enzima, por tanto,
el ión magnesio tienen una función crítica en la reacción. Afecta al anillamiento,
la temperatura de denaturación y a la actividad enzimática. (Concentración: 0.5 -
2.5 mM).
7. Iniciadores o primers: Son secuencias cortas, normalmente de 18 a 22
nucleótidos y contenido en GC entre 40-75%. Se diseñan para ser
complementarios al molde de ADN. (Concentración: 0.1 - 0.5 uM).
8. Termociclador: Permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una
reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN o para reacciones
de secuencia con el método de Sanger.
9. Cabina UV: Permite la esterilización del material evitando posibles
contaminaciones cruzadas entre muestras de ADN o ARN, que pueden dar lugar
a falsos positivos.
10. Tubos Fijadores: Tubos delgados de polipropileno transmiten el calor a la
prueba de forma homogénea y eficaz
11. Buffer: Una mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido y su
base conjugada.
12. El agua: es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de
nucleasas, enzimas que degradan a los ácidos nucleicos. Suelen incluir Tris-HCl,
gelatina o albúmina sérica bovina y detergentes no iónicos.
OBJETIVOS:
1. Demostración secuencial de la bondad de la valiosa herramienta que permite
amplificar un segmento problema de ADN.
2. Evidenciar los múltiples usos en Medicina, como diagnóstico preciso de
enfermedades infecciosas y no infecciosas, así como también en el campo
antropológico, en Medicina Forense, criminalística, Medicina Legal,
Arqueología, Paleontología, Análisis de alimentos, Filogenia, Biodiversidad,
en Genética para clonación, determinar mutaciones, delección de genes y
otros.
II. MARCO PRACTICO
MATERIALES
Termociclador Cabina UV
Primers Enzimas de restricción
Equipo para Corridas electroforéticas (Horizontal o vertical)
Fuente de Poder Tubos colectores
ADN ADN polimerasa
Desoxinucleótidos tri fosfato (dNTP) ION Mg ++
Reactivos e insumos: Proteinasa K, etanol,
Buffers: Al, AW1, AW2, AE (de Elusión) Agua
PROCEDIMIENTO
Dado el costo de materiales, la práctica se efectuará demostrativamente, para lo cual se
mostrará la utilidad y el uso de cada equipo, así como la secuencia de pasos a efectuarse.
Se desarrollará una sesión presencial, así como ayudas audiovisuales en ppt. Se generará una
corriente de preguntas y se informará sobre otras aplicaciones posibles.
Las Etapas del PCR se resumen a continuación:
I. CICLO DE AMPLIFICACION:
1. DENATURACIÓN INICIAL: Se determina la zona que se amplificará para el
uso de Primers o Iniciadores adecuados.
2. DENATURACIÓN: Para la separación de hebras antiparalelas de ADN 95° C
3. HIBRIDACIÓN o ANILLAMIENTO: con ayuda de los Primers a 50° C
4. EXTENSIÓN: Actividad de la enzima ADN polimerasa a 72 ° C
II. CICLO de AMPLIFICACIÓN:
1. DENATURACIÓN
2. ALINEAMIENTO
3. EXTENSIÓN
III. CICLO DE AMPLIFICACIÓN:
DATOS NUMÉRICOS DESPUÉS DE LA PCR.
1. En este CICLO se dan los PRODUCTOS nunca antes
IV. IV. EXTENSIÓN FINAL
1. HASTA, después del CICLO 35 se han producido cerca de 34, 359,
740,000 moles de ADN.
2. De ellos se generan 60 copias de productos inespecíficos.
TIPOS DE PCR
1. RT-PCR
2. NESTED y HEMINESTED PCR
3. PCR MULTIPLEX
4. PCR – RFLP
5. LONG – PCR
6. INMUNOPCR
7. PCR EN TIEMPO REAL
CUESTIONARIO:
1. ¿En qué se basa la exactitud de resultados en la técnica del PCR?
La exactitud de los resultados de la técnica del PCR se informa mediante la
Sensibilidad y la Especificidad. La sensibilidad es la proporción de personas con
cierta enfermedad correctamente detectada por la prueba; mientras que la
especificidad es la proporción de personas que no cuentan con cierta enfermedad
que se sospecha que tienen, detectadas correctamente por la prueba. Cuanto más
se acerquen a la sensibilidad y especificidad al 100% mejor será la prueba. Una
persona que requiere ser priorizada para el tratamiento requeriría una
sensibilidad del más del 80%.
2. Mencione al menos tres aplicaciones de utilidad, Tenga cuidado de que es su grupo
no se toque el mismo caso, cada grupo será diferente.
a) Citopatología respiratoria
La aplicación más frecuente es la demostración de gérmenes que afectan a
pacientes inmunodeprimidos que precisan de una terapéutica rápida. Las
muestras pueden ser recogidas de torundas de algodón, desde líquido pleural,
cepillado bronquial, esputo, BAL (lavado broncoalveolar), PAAF (Biopsia o
punción con aguja fina) o de material incluido en parafina.
b) Enigmas históricos
Por su mejor comportamiento en muestras degradadas el ADNmt es esencial
para muchos casos de identificación a partir de restos óseos. Se han obtenido
secuencias de ADNmt en muestras de miles de años y la prueba ha servido
para solucionar numerosos enigmas históricos como la identificación, antes
indicada, de los restos de la familia Romanov, el corazón de piedra que se
conservaba en la Iglesia de Saint Denis en París como hijo de María
Antonieta, y ya en España ha sido utilizado para la identificación de un buen
número de restos óseos no identificados por otras técnicas (Programa Fénix)
y para la resolución de problemas históricos como la verificación de los
restos del arzobispo Irurita como pertenecientes al mismo, lo que fue
esencial en su proceso de beatificación.
c) En criminalística biológica
En el análisis de manchas de esperma, de pelos y cabellos, saliva, o manchas
minúsculas de sangre. Hoy a partir de un único cabello o de un mínimo
número de espermatozoides recogidos en cavidad bucal o una mancha
envejecida y minúscula de sangre se puede, en muchas ocasiones, aportar
datos de gran valor sobre la individualidad de ese vestigio.
Está siendo especialmente importante en los delitos contra la libertad sexual.
El esperma es un vestigio idóneo para el análisis de ADN. Finalmente,
algunos grupos forenses están estudiando también marcadores físicos para
predecir características individuales de las personas que puedan ser
utilizados en la fase de investigación policial de un delito. El sexo es
evidentemente fácil (se suele utilizar como hemos indicado el gen de la
amelogenina) y sobre todo con marcadores 14 de cromosoma Y y ADNmt se
pueden deducir datos sobre el origen geográfico del individuo que cometió el
delito. Entre otros marcadores de características físicas a través del análisis
de SNps podemos definir el color de la piel, del color del pelo o el color de
los ojos. Además, otras características como el carácter de lóbulo de la oreja
pegado o libre están en estudio.
3. ¿Cree que en nuestro medio ya se requiere esta técnica, o considera que aún puede
esperarse su implementación? ¿Por qué?
El Perú desde 2014 cuenta con un moderno laboratorio de microbiología y
biomedicina, de nivel de bioseguridad III, capaz de realizar la prueba de
diagnóstico molecular del ébola con absoluta seguridad, en un plazo de 24 horas
usando el PCR.
Además, diversos proyectos peruanos que datan de años anteriores han usado
esta técnica, que si bien es cierto ha estado presente y ha generado resultados, el
empleo de estos ha permanecido de manera no trascendente.
Ahora debido a la condición de pandemia en la que nos vemos inmiscuidos es
imprescindible que el país cuente con métodos de diagnóstico confiables como
la RT-PCR e incremente su implementación para hacer más accesible la
determinación de esta infección viral, lo que contribuye a su diagnóstico
oportuno, y además reduce la posibilidad de clasificar a individuos como falsos
negativos, quienes podrían propagar la enfermedad del COVID-19.
CUADRO SOBRE EL PODER DE AMPLIFICACION DE LA PCR
CICLO DE LA PCR NUMERO DE COPIAS
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
10 1,024
20 1, 048, 576
30 1, 073, 741, 764
35 34, 359, 740, 000
CONCLUSIONES.
1. Gracias a El desarrollo de la técnica de PCR actualmente es llevada a cabo en equipos
conocidos como termocicladores que se programan para que produzcan los ciclos de
temperatura, por ello el tratamiento de la muestra solo es manual para preparar la
solución y en la verificación de resultados o la aplicación de nuevas técnicas a partir de
estas.
2. Actualmente, el proceso más reconocido de la PCR en el contexto actual es el de
diagnóstico temprano y acertado de COVID - 19, pues estas técnicas, si bien tardan un
poco más y requieren de equipos especializados, tienen alta especificidad y alta
sensibilidad, permitiendo detectar la presencia del virus en las primeras fases de la
infección para así tener un diagnóstico precoz
3. La PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos sociales de gran relevancia,
que van desde procesos médicos o biológicos, hasta legales con trascendencia histórica.
4. El avance tecnológico y la búsqueda constante de soluciones a problemas de diversa
índole, han logrado la evolución de técnicas que facilitan diversos procesos antes
realizados de forma rudimentaria, lenta y sin tanta fiabilidad.
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