Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Química e Ingeniería Química
Curso de Bioquímica
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Diana Brigithe Sevilla Huarancca
[email protected] Christian Guillermo Zambrano Nuñez
[email protected] Gabriela del Carmen Allende Mantilla
[email protected] Juan Guido Conque Araujo
[email protected] Nicole Armandina Moya Vasquez
[email protected] Piero Matías Herrera Suarez
[email protected] Sebastian Alonso Orellana Cuenca
[email protected] UNMSM, FQIQ, DAFQ., EAP QUIMICA / ING. QUIMICA C.U. Lima 1, Perú
Resumen
Con el objetivo de estudiar la separación de componentes de mezclas complejas a través de la
cromatografía, se prepararon tres soluciones: la primera al 1% de Triptófano, una solución
eluyente 7:3 y otra reveladora. Se hizo uso de una placa cromatográfica de sílica-gel, previamente
medida y marcada, en la que se añadieron tres toques sucesivos de la solución con el aminoácido
con la ayuda de una pipeta Pasteur; posteriormente, esta se colocó en la solución eluyente. Se
dejó secar la placa y se le aplicó la solución reveladora para introducirla en la estufa a 90°C.
Finalmente, se realizaron las mediciones de la distancia recorrida por el eluyente y la distancia
recorrida por el aminoácido, con estos datos se calculó el Rf (factor de retardo) dando un valor
de 0.5686 (%E=18.7%).
Palabras clave: aminoácido, cromatografía, Triptófano, eluyente, reveladora, factor de retardo.
1. Introducción ser el primero en utilizar este término y
establecer sus ventajas. Asimismo, consta de
Un aspecto importante de la cromatografía es
2 fases y existen diferentes técnicas
que es una técnica cromatográfica que utiliza
cromatográficas como la cromatografía de
una placa inmersa verticalmente en una fase
papel, de capa fina, de líquidos, de gases y de
móvil, además, permite el análisis de una
fluidos supercríticos. A continuación, se
mezcla de componentes y es utilizada para
explicará de manera detallada la
separar componentes y/o analitos presentes en
cromatografía, así como su aplicabilidad y
mezclas complejas. Fue descubierta por el
los resultados obtenidos.
botánico Mikhail Tswett en 1906, considerado
como el padre de la cromatografía, así como
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2. Principios Teóricos Donde:
• Tiempo de retención (tR): tiempo
2.1 Aminoácido
transcurrido desde la inyección de la
2.1.1 Triptófano: Es un aminoácido esencial, muestra hasta que uno de los
necesario para el mantenimiento y la componentes llega al detector.
producción de las proteínas, músculos, • Tiempo muerto (tM ): tiempo
enzimas y neurotransmisores del cuerpo. requerido para que una especie no
Debido a ello, el cuerpo no lo puede producir, retenida alcance el detector.
por lo que se debe obtener de la alimentación.
2.4 Factor de retardo (RF)
2.2 Cromatografía de capa fina
Se define como la relación entre la velocidad
Es una técnica de separación que utiliza una de desplazamiento del soluto y la velocidad
placa inmersa verticalmente en una fase móvil de desplazamiento de la fase móvil. En ese
(eluyente) y como soporte se puede tener a sentido, en un determinado instante, el factor
cualquier sustancia que pueda dividirse en de retardo puede definirse como una relación
partículas finas para distribuirse de distancias:
uniformemente en forma de láminas. Esto
incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝐹 =
óxido de aluminio, etc.) y orgánicas (celulosa, 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑣𝑖𝑙
polietileno, etc.). En conclusión, en la CCF, la 3. Detalles Experimentales
fase estacionaria es una lámina extendida de
forma uniforme sobre la superficie de una Para la identificación de aminoácidos por la
placa en los que la fase móvil se desplaza por técnica de cromatografía en capa fina, se
la fase estacionaria por acción capilar. seleccionó inicialmente una placa de silica
gel de 20 x 20 cm y se le realizaron trazos que
2.3 Factor de retención demarcaron los límites y las líneas de corte,
Al factor de retención también se le conoce ya que posteriormente se dividió en 5
como el factor de capacidad (k) y subplacas de 6,5 x 2,5 cm, de tal forma que
mide la relación entre el tiempo que las se pudiera identificar para cada aminoácido,
moléculas del analito están en la fase los cuales fueron tirosina, metionina,
estacionaria y el que están en la fase móvil. Se histidina, cisteína y triptófano. Cabe
define como: mencionar que en esta práctica se trabajó con
triptófano, para lo cual se preparó una
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑛 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎 solución al 1% de este aminoácido, para ello
𝑘=
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 se llevó a pesar 1 g de este en la balanza
analítica, luego en una probeta se midieron
El factor de retención de un componente 10 mL de n-propanol y se completó el enrace
también se puede determinar a partir de: a 100 mL con agua destilada. Tanto la
𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 solución como el aminoácido se trasvasaron
𝑘= y diluyeron en un frasco. En consiguiente, se
𝑡𝑀
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preparó la solución eluyente, para lo cual se (triptófano) se realizó óptimamente,
necesitó de medir 90 ml de hidróxido amónico generando una solución homogénea sin
al 34% en probeta, previamente preparado con turbidez, debido a la afinidad del triptófano
34 g del hidróxido con 100 ml de agua con agua destilada y el propanol.
destilada, y de 210 ml de etanol, los cuales se
En el caso de la cromatografía de capa fina,
mezclaron y trasvasaron a un vaso. Asimismo,
la solución eluyente (solución hidróxido
se preparó la solución reveladora con 0,2 g de
amónico 34% y etanol, en una relación 7:3)
ninhidrina pesados en balanza analítica y se
preparada por otro grupo fue colocado en el
midió 100 ml de agua destilada en probeta,
matraz junto a la placa con el aminoácido
para finalmente mezclarse en un vaso.
colocado, resultando en que la solución fue
Sucesivamente, a esto iniciamos el proceso
escalando hasta el límite superior de la placa.
cromatográfico, para ello con una pipeta
La reacción de la ninhidrina contenida en la
pasteur se colocó 3 gotas de la solución de
solución reveladora (0.2g de nihidrina en
aminoácido sobre el límite inferior de la capa
100mL de agua destilada) con el aminoácido
fina y se colocó esta capa sobre el vaso que
(figura 1) resultó en la aparición del púrpura
contenía la solución eluyente. Se tapó el vaso
de Ruhemann, el cual da un color
para evitar que se evapore el etanol del
característico azul – violáceo a la solución,
eluyente y se dejó reposar aproximadamente
sin embargo, en este caso, la concentración
30 minutos hasta que completó el ascenso
de este es muy ínfimo, por lo que la
capilar máximo del eluyente. Posteriormente,
coloración se notó muy poco. Esta reacción
se llevó a secar la placa en una estufa a 50°C
con la ninhidrina resulto en un nivel de altura
por 5 minutos, se retiró la placa con una pinza
del aminoácido en 2.9cm.
y se realizó el rociado con la solución de
ninhidrina preparada previamente. Finalmente, Teniendo en cuenta referencias de otros
se llevó nuevamente a la estufa para que trabajos, el Rf conseguido es cercano, pero no
caliente a 90°C durante 5 minutos, se retiró con similar, teniendo un valor igual a 0.8644
pinza sobre una luna de reloj, se identificó el respecto a 0.7846 de Medina & Lozano
aminoácido por cromatografía y se realizaron (2016), determinando que es afín a la fase
las mediciones del recorrido de la solución de móvil.
aminoácido y la recorrida por el eluyente.
4.1. Cálculos
Calculamos el factor de retención del
4. Análisis y Discusión de Resultados triptófano:
𝑑
En el presente informe se evaluó la 𝑅𝐹 =
𝑀
cromatografía del triptófano en capa fina, Siendo
siguiendo dos procedimientos generales: la M: la distancia recorrida por el aminoácido
preparación de la solución de triptófano y la desde su punto inicial
cromatografía de capa fina per se. El d: la distancia recorrida del eluyente
procedimiento experimental para la
preparación de la solución del α - aminoácido
De los datos empíricos:
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M= 2.9cm 6. Recomendaciones
d= 5.1cm
• Se debe evitar tocar la parte silica gel
de la placa, puesto que se
Obtenemos un factor de retención de:
contaminaría con aminoácidos que
estén presentes en nuestras manos.
2.9
𝑅𝐹 = ≈ 0.5686
5.1 • Debido a que el eluyente es tóxico, es
importante trabajar en la campana
Teniendo en cuenta la figura 5, tomamos un extractora.
valor verdadero de 0.7, entonces el error
porcentual es de: • Se deben aplicar una mínima cantidad
de gotas, puesto que esto podría
|𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑅𝑒𝑎𝑙 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝐸𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙| retardar el ascenso de los
%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = aminoácidos en la placa.
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑅𝑒𝑎𝑙
⋅ 100%
Hacer uso
7. Referencias bibliográficas
|0.7 − 0.5686|
%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = ⋅ 100% ≈ 18.7% [1] Medina, P., & Lozano, J. (2016).
0.7
Separación de aminoácidos contenidos en
una muestra de yogurt por cromatografía en
Adjuntamos una tabla de los resultados en la
capa fina. Recuperado de
tabla 2:
https://bit.ly/3V7x0Hx
5. Conclusiones
[2] Sanchez S, Flores L, Gurrola C, Heredia
• La coloraciòn púrpura azulada en la P. Manual de prácticas de laboratorio de
placa se debe a la reacción presente del Bioquimica. 3.ª ed. México: McGRAW-
aminoácido con la ninhidrina. HILL; 2014.
• Se determinó el valor del RF de la
ninhidrina. el cual es 0,5686. El valor [3] Rodwell V, Bender D, Botham K,
del RF no debe ser mayor a 1. Kennelly P, Weil A. Harper Bioquímica
ilustrada. 30.ª ed. México: Pearson
• A mayor distancia recorrida por el
compuesto, tendrá mayor afinidad por [4] Berg J, Tymoczko J, Stryer L.
la fase móvil; mientras que a menos Bioquímica. 6.ª ed. Barcelona: Reverte;
distancia recorrida por el compuesto,
2008
tendrá mayor afinidad por la fase
estacionaria.
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Tablas de Resultados
Tabla 1. Resultados de la cromatografía
Distancia Distancia
Factor de
Aminoácido recorrida por el recorrida por el %error
retención
aminoácido eluyente
Triptófano 5.1cm 2.9cm 0.5686 18.7%
Fuente. Elaboración propia.
ANEXOS
Figura 1. Reacción de ninhidrina con aminoácidos
Figura 2: Materiales y reactivos de cromatografía en placa fina.
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Figura 3: Placa de sílica gel
Figura 4: Vaso de precipitado
Figura 5: Agua destilada
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Figura 6: Pipetas pasteur
Figura 7: Hidróxido de amonio
Figura 8: Ninhidrina
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Figura 9: Selección y trazado de bordes de la placa sílica gel
Figura 10: División en subplacas de la placa sílica gel
Figura 11: Bosquejo del proceso cromatográfico
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Figura 12: Montaje del proceso cromatográfico en laboratorio
Figura 13: Secado en estufa de las placas sílica gel.
Figura 14: Rociado de la placa con la solución de ninhidrina
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Figura 15: Calentamiento en estufa de la placa rociada.
Figura 16: Identificación del aminoácido
Tablas de Datos Referenciales
Tabla 2. Factor de retención para cada patrón
Distancia recorrida por
Alfa - aa Rf
el compuesto
Triptofano 3.5 cm 0.7
Tirosina 1.5 cm 0.3
Histidina 2.0 cm 0.4
Cisteina 0.3 cm 0.06
Metionina 3.0 cm 0.6
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Distancia Recorrida por
5.0 cm
el eluyente
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