UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
INFORME DE PRÁCTICA N° 02
BIOQUÍMICA Y NUTRIC. HUMANA
Alumno:
Flores Jimenez, Josué Israel
ID: 000251890
Grupo: 03
NRC: 7929
Asignatura: Bioquímica y nutrición
humana practica
Docente de Práctica: Cabos Sanchez, Jeisson
David
Piura – Perú
2022
Fecha de práctica: 27/04/2022
Presentación del Trabajo: 2/05/2022
SEMANA N°3
LABORATORIO N°3
EFECTOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS
BIOENERGÉTICOS (COBAYOS)
EXPERIMENTO 1. CADENA RESPIRATORIA EN MÚSCULO DE
COBAYO
A. Obtención del cofactor NAD+
1. Ponga a hervir 20 ml de agua destilada en un vaso de
precipitación
2. Sacrificar un cobayo
3. Extraer enseguida los músculos de las patas y colóquelo
en el vaso 5 a 10 minutos.
4. Enfríe y vacíe el contenido a un mortero con 2 gramos de
arena y triturar hasta obtener una masa fina.
5. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos.
6. Separar el sobrenadante que contiene los cofactores y
colóquelo en un recipiente con hielo.
B. Obtención de enzima Lactato Deshidrogenasa y
componentes de la cadena respiratoria
1. Extraer el hígado del cobayo sacrificado y homogenizarlo
en un
mortero con aproximadamente 2 gramos de arena
2. Añadir 6 ml de suero fisiológico (NaCl 0.9 %) y obtenga una
pasta fina
3. Añadir otros 6 ml de suero fisiológico diluyendo la pasta
4. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos
5. Separar el sobrenadante que contiene la enzima en un tubo
y dejarlo incubando a temperatura ambiente por 15 minutos
6. Conserve la preparación en un recipiente con hielo. Marque
el tubo con E
7. Para utilizar la enzima E dilúyala con buffer fosfato pH 7.2 a
razón de 1 ml de E por 4 ml de buffer
8. Con 2 ml, sin diluir de E, realice una centrifugación
diferencial a
fin de obtener núcleo y mitocondrias
9. Armar el siguiente sistema:
10. Observar los cambios en las coloraciones.
Resultados:
Tubo 1: Hubo decoloración (azul claro o celeste).
Tubo 2: Hubo coloración azul intenso.
Tubo 3: Hubo decoloración (azul claro o celeste).
Tubo 4: Hubo decoloración (azul claro o celeste).
Tubo 5: Hubo coloración azul intenso.
Tubo 6: Hubo decoloración (azul claro o celeste).
Interpretación:
Tubo 1: En el tubo se añadió enzima y sustrato, además el cofactor
que usa la enzima para poder convertir este sustrato en producto, por
lo que hubo reacción de óxido-reducción en la que el azul de metileno
captó los electrones, y por ende en este tubo se observó decoloración
a celeste.
Tubo 2: En el tubo, se añadió el cofactor y sustrato, pero al no haber
la enzima que reaccione con el sustrato, no hubo reacción, entonces
el azul de metileno no se reduce y la coloración permanece azul
intenso.
Tubo 3: Esta vez sí se añadió la enzima, además de sustrato, pero
no el cofactor. A pesar de ello sí hubo reacción dado que en el hígado
ya había cofactor. Por lo que hubo decoloración a celeste.
Tubo 4: En este se añadió la enzima y el cofactor, pero no el sustrato.
A pesar de ello sí hubo reacción, dado que en el hígado ya había el
sustrato lactato. Por lo que hubo reacción de oxido-reducción y
decoloración a celeste.
Tubo 5: En el tubo solo se añadió cofactor, sustrato y núcleo, pero
nuevamente al no haber presencia de la enzima, entonces no hay
reacción. Por lo que el tubo permanece de color azul.
Tubo 6: En este se añadió el cofactor, sustrato y no la enzima; sin
embargo, se ingresó la mitocondria, organelo en el que hay sustrato
y se lleva a cabo la cadena transportadora de electrones, por lo que
el azul de metileno captará electrones y decolorará a celeste.
EXPERIMENTO 2. ACCIÓN DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN
LA RESPIRACIÓN CELULAR
1. Separe el corazón de un cobayo y córtelo en pequeños
trozos y colóquelos en un mortero.
2. Agregue aproximadamente 2 gramos de arena y 5 ml de
buffer fosfato pH 7.0 y homogenícelo hasta obtener una
pasta fina y agregue otros 5 ml de buffer fosfato pH 7.0
3. Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 15
minutos, removiéndola con un agitador cada 2 a 3 minutos
4. Separe el sobrenadante por centrifugación a 3000 rpm
por 2 minutos y consérvelo en un tubo sumergido en hielo.
Rotular como PC (preparado de corazón)
5. Armar el siguiente sistema:
6. Mezclar los tubos. Añadir 1 ml de aceite mineral, suavemente
por las paredes
7. Incubar a 37 °C por 30 minutos.
8. Observar los cambios de color.
Resultados:
Tubo 1: Parcialmente decolorada.
Tubo 2: Decoloración menor al tubo 1.
Tubo 3: Decoloración leve.
Tubo 4: Decoloración.
Tubo 5: No decolora.
Interpretación:
Tubo 1: En este tubo hubo una decoloración parcial, ya que en el
corazón ya se encuentra la enzima, y el sustrato solo lo añadimos,
entonces habrá una reacción de óxido-reducción, por lo que el azul
de metileno de reducirá.
Tubo 2: En este se añadió el sustrato, y la enzima ya se encuentra
en el corazón, sin embargo, se le añadió malonato de sodio, un
inhibidor enzimático competitivo del succinato, por lo que habrá
reacciones, pero serán en menor cantidad, y por ende el azul de
metileno se reducirá, pero en menor cantidad, en consecuencia,
habrá decoloración, pero menor al tubo 1.
Tubo 3: En este tubo se añadió únicamente azul de metileno,
además de la preparación de corazón. En el corazón ya hay sustrato
y enzima, por lo que habrá reacción y por lo tanto una decoloración.
Tubo 4: En este se añadió preparación de corazón, succinato de
sodio y cianuro de potasio. El cianuro de potasio inhibe al complejo
IV de la cadena transportadora de electrones; sin embargo, hay
reacción porque los complejos 1, 2 y 3 siguen activos, por lo que
seguirá habiendo bombeo de protones. En consecuencia, hay
decoloración.
Tubo 5: En este tubo se añadió preparación de corazón, succinato
de sodio, y bicloruro de mercurio. En esta no hubo reacción dado que
el metal Hg hace que la enzima se desnaturalice. Por lo cual no hay
decoloración.
Cuestionario:
1. Haga un esquema de la cadena respiratoria con todos los
complejos
2. ¿Cómo explica los resultados en el núcleo y en las
mitocondrias?
-En el caso del tubo con núcleo, si bien se le añadió el cofactor, el
cual hará que la reacción se pueda dar; así como el sustrato; con
el cual la enzima debe reaccionar. Sin embargo, no hay enzima,
por lo cual, a falta del biocatalizador, entonces la reacción no se
podrá dar, ello a pesar de que se ha ingresado núcleo, dado que
en el núcleo no hay sustrato, mucho menos algún proceso de
cadena respiratoria, por lo que el azul de metileno hará captación
de electrones y quedará en tono azul intenso.
-En el de la mitocondria, se añadió nuevamente el cofactor, el
sustrato y no la enzima; sin embargo, esta vez sí hay reacción,
dado que en la mitocondria ya hay sustrato, y allí sucede la cadena
transportadora de electrones. Por lo que el azul de metileno
captará electrones y se decolorará.
3. ¿Cómo actúa la coenzima?
- La coenzima NAD+ en el proceso de conversión de lactato en
piruvato a través del lactato deshidrogenasa; actúa de forma en
que esta se reducirá ya que captará los electrones del lactato, de
tal forma que se convertirá en NADH (reducido (4).
4. En el esquema de la cadena respiratoria señale el lugar de
acción de los inhibidores
5. Si se usa el succinato, ¿qué complejo de la cadena
respiratoria está participando?
- El complejo II, llamado succinato deshidrogenasa (2).
6. ¿Cómo actúa el malonato?
- Este actúa como un inhibidor, en este caso sobre el succinato
deshidrogenasa, la cual es el complejo II. Este funciona de forma
que bloqueará la conversión de succinato en malato, por lo que se
detendrá el ciclo de Krebs (2).
7. Explique la acción del bicloruro de mercurio
- Este actúa como un inhibidor enzimático irreversible, estos se
unen de manera covalente a la enzima; en consecuencia, esta ya
no puede volver a biocatalizar jamás. Este suele usarse para
detener reacciones enzimáticas.
8. ¿A qué nivel actúa el cianuro?
-El cianuro inhibe la cadena transportadora de electrones y actúa
a nivel de complejo IV, inhibiendo el citocromo oxidasa, de esta
forma disminuye la generación del gradiente de protones, por lo
cual disminuye la producción de ATP.
9. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?
- Este actúa captando los electrones de la reacción de la
conversión del lactato a piruvato, los electrones del NAD+ que
normalmente son captados por el piruvato, son captados por el
azul de metileno, por lo que este pasa de estar oxidado a estar
reducido (2).
Discusiones:
- En presencia de la mitocondria (Tubo 6-1er experimento) a pesar
de no haber ingresado la enzima, en esta sí hay un cambio de
coloración del azul de metileno dado que en este medio hay sustrato
y se da la cadena transportadora de electrones, por lo que los
electrones en este proceso serán captados por el azul de metileno;
esto a diferencia del tubo 2 del 1er experimento, en el que no se
añadió la enzima y además no se agregó un medio en el que se den
reacciones de oxido-reducción.
- En presencia del malonato de sodio (tubo 2- 2do experimento) las
reacciones se producen en menor cantidad, ya que si bien es un
inhibidor, este es competitivo, por lo que al haber suficiente cantidad
de sustrato, entonces casi todas las moléculas de enzima estarán
ocupadas por el sustrato en vez del inhibidor. A diferencia del tuvo 5,
en el que se añadió bicloruro de mercurio, con el cual se va a
desnaturalizar la enzima.
Conclusiones:
- En presencia de inhibidores, la velocidad de las reacciones
puede disminuir o inhibirse por completo. Por lo cual solo se
realizará la reacción sin interrupciones en ausencia de
inhibidores.
- En la mitocondria se ubican varias enzimas, ya que se llevan a
cabo procesos como la cadena transportadora de electrones,
fosforilación oxidativa y ciclo del ácido cítrico.
Referencias bibliográficas:
1. Khan Academy [Internet]. [Link]. 2022 [citado el 2 de mayo
del 2022]. Disponible en: [Link]
biology/cellular-energetics/environmental-impacts-on-enzyme-
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disminuir%C3%A1%20la%20velocidad,m%C3%A1xima%20de%20reacc
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2. Avila K. Enzimas mitocondriales [Internet]. [Link]. 2014 [citado
el 2 de mayo del 2022]. Disponible en:
[Link]
3. Chávez E, Martínez F, Flores O. Oxidaciones biológicas y bioenergética:
Martinez F, Pardo J, Riveros H. eds. Bioquímica de Laguna y Piña 8 ed, 2018;
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4. Matus-Ortega G, Pablo J, Romero-Aguilar L, Luqueño-Bocardo I,
Hernández-Morfín K, Guerra-Sánchez G, et al. Artículos de revisión Las
funciones metabólicas, endocrinas y reguladoras de la expresión
genética del lactato. 2020;63. Disponible en:
[Link]
