METODOLOGÍA
PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE LA MUESTRA
1. Establecer y definir las responsabilidades del personal involucrado.
Supervisor: Se encargará de observar que los laboratoristas cumplan con
su función y que lo realicen correctamente.
Laboratorista/as: Realizaran las tomas de muestras del suelo contaminado.
2. Se definirá la ubicación y el número de puntos del muestreo, la profundidad
y el volumen.
La ubicación será en un terreno agrícola o en donde existe vegetación.
Serán 4 muestras del suelo por cada 160m², cada muestra será de 1 kg. El
área contaminada es de aproximadamente 500m²
La profundidad es de 60cm
El volumen será determinado observando si fue una fuga de un acueducto,
tubo etc., o si solo se derramo de una pipa
3. Se describe la técnica de muestreo, el equipo de muestreo y medidas de
seguridad.
Se realizarán muestras simples y al mismo tiempo serán aleatorias.
4. Especificar recipientes, la preservación y el transporte
El recipiente será un frasco de boca ancha con contra tapa o sello de PTFE
que asegure la integridad de la muestra.
Tendrá una temperatura de 4°C y tendrá como máximo 14 días de
conservación de la muestra.
Si el laboratorio está cerca del área contaminada se podrá transportar en
una hielera, si se encuentra retirada será en hielera en un automóvil de tipo
refrigerador.
5. El procedimiento para extraer las muestras superficiales se realiza haciendo
una pequeña excavación en forma de cono con el pico y la pala a la
profundidad deseada, tomando la parte central de la excavación que se
coloca en una bolsa de plástico limpia. Si el suelo está endurecido se puede
hacer con barrena, pero el volumen extraído es menor.
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS
Ya contando con la muestra en el laboratorio se procederá a realizar el análisis de
microorganismos que se encuentran en el suelo.
3.1 Preparar agares
Poner 40g de agar soya tripticaseina en un matraz Erlenmeyer en 1 litro de
agua destilada.
Sellar el matraz y colocarle etiqueta con el nombre del agar.
Colocarlos dentro del autoclave a 15 libras a una temperatura de 121°C
aproximadamente por 15 o 20 minutos.
Esterilizar el área de trabajo con un mechero
Abrir las cajas Petri y dejarlas dentro del área estéril
Colocar el agar dentro de la caja Petri
3.2 Colocación de la muestra del suelo en el agar
Diluir una muestra de suelo en agua destilada
Con la ayuda de un isopo colocarlo dentro de la muestra diluida y frotar durante
al menos 30 segundo dentro
Colocar el isopo en la caja Petri con en agar, la muestra será colocada en
forma de espiral
Meter las muestras a la estufa bacteriológica a 36.5 °C, boca abajo y durante
72 horas.
3.3 Preparación de tinción de gram, observación e identificación de bacterias
Transcurridos los 3 días (72hrs) sacar de la incubadora las cajas Petri que
estuvieron en la incubadora y ponerlas sobre la mesa de trabajo previamente
esterilizada con jabón y agua y tener prendido el mechero bunsen.
Colocar en orden las soluciones de cristal violeta, el lugol, alcohol y safranina,
respectivamente.
Esterilizar un asa bacteriológica, para no quemar a las bacterias después de
esterilizar el asa bacteriológica, esta colocarla en alguna parte de los costados
y ya estando a temperatura ambiente tomar una colonia de bacteria, y colocar
una gota de agua destilada en el portaobjetos, y sobre él, la colonia de
bacterias (el agua es para que la colonia de bacterias sea mejor para desplazar
la colonia), sobre el mechero pasar el portaobjetos para que el agua se
evapore.
Agregar unas gotas de cristal violeta por 1 minuto, después lugol por 1 minuto,
después solo 3 gotas de alcohol por 30 segundos y al final unas gotas de
safranina por 1 minuto.
Observar al microscopio empezando por 10x, si no se enfoca pasa a 40x y si
aún no se logra distinguir nada, pasar a 100x, pero al usar este último se le
tendrá que agregar aceite de inmersión. Nota: Al hacer el enfoque en 100x ya
no se podrá regresar el lente a una menor, ya que si se regresa el lente se
descompone.
Identificar con la teoría que tipo de bacterias se tratan
MICORREMEDIACIÓN
Las condiciones de cultivo fueron establecidas de acuerdo a lo descrito por
(Olanipekun, 2014) y modificado de la siguiente manera: se pesaron 400g de
suelo y 40g de sustrato lignocelulósico (aserrín y cascarilla de arroz esterilizados
en una relación 1:1) en cajas Petri de 20 cm de diámetro y luego se mezclaron a
fondo con aceite sucio de motor al 0%, 4.6%, 9.8%, 15.5%, 21.8%, 29.1%, y
37.2% p/p respectivamente y finalmente se esterilizaron a 121°C y 15 psi por 15
minutos. A continuación, cada tratamiento así establecido en cajas Petri fue
inoculado con 6 tacos de 0.5cm de micelio fúngico, distribuidas de forme
equidistante. El control positivo del experimento consistió en suelo con sustrato
lignocelulósico e inoculado con micelio fúngico, de la manera descrita
anteriormente. Como controles negativos se emplearon suelos adicionados con
sustrato lignocelulósico y la respectiva concentración de aceite sucio de motor.
Todos los tratamientos establecidos por duplicado, de este diseño experimental de
tipo aleatorio, fueron incubados a 30°C con 60% de humedad, en condiciones de
oscuridad durante 3 meses. Al cabo de ese tiempo, los micelios residuales fueron
removidos de los suelos y se determinaron los parámetros fisicoquímicos de los
suelos tratados biológicamente.
BIBLIOGRAFÍA
Galán D., Metodología para la Toma de Muestra de Microorganismos
Altamente Patógenos en Las Matrices Ambientales Aire, Agua y
Suelo/Sedimento, Instituto de Salud Carlos III, 2018.
NOM-138-SEMARNAT-SSA1-2012
NOM-021-RECNAT-2000
