PRESENTACION

La guía de Practicas de Curso de Microbiología General para los alumnos de la Escuela Profesional de

Biología, pretende servir como orientación, para que el estudiante ejecute sus trabajos de laboratorio son

cierta autonomía, tomando en consideración que ya tiene los conocimientos elementales y la experiencia

necesaria para trabajar en un laboratorio de Microbiología.

La guía esta diseñada para ser utilizada en un curso sementral. La modalidad es de tipo secuencial y

guarda relación con las clases Teóricas, Seminario y Práctica.

Destacamos como importante, la preparación de los recursos necesarios por el propio estudiante, el

aislamiento de los bacterias sus fuentes naturales, su identificación morfológica, fisiológica y los

procedimientos que se emplean para el diagnostico etiológico.

Al finalizar las prácticas el alumno estará capacitado para ejecutar con conocimientos y destreza,

trabajos elementales como bacterias de interés médico

La autora
 NORMAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LAS PRÁCTICAS

1. La asistencia para las prácticas es obligatoria, si no asiste a una Práctica no tendrá oportunidad de
repetirla.

2. Cada estudiante ingresará a la práctica llevando obligatoriamente: mandil blanco y el manual de

prácticas del curso.

3. El material de vidrio, plástico u otro que se encuentre contaminado deberá depositarse en los
recipientes que se colocarán con este fin. Los materiales de deshecho contaminado, tales como
trozos de algodón, papel, etc., no deben votarse al suelo sino al depósito mencionado.

4. En el laboratorio queda terminantemente prohibido, beber o fumar, no colocar los dedos, lápices
u otros instrumentos en la boca. En caso de contaminación personal o de ambiente debe avisar
inmediatamente a su Jefe de Práctica.

5. Las mesas de trabajo deben mantenerse limpias y despejadas de prendas de vestir u otros objetos.

6. Ningún estudiante deberá sacar un cultivo bacteriano fuera del salón de prácticas.

7. Revise la teoría de manejo del microscopio antes de usarlo.

8. Debe tenerse especial cuidado en el manejo del asa de alambre para no ocasionar accidentes de
contaminación. El asa debe esterilizarse a la llama antes y después de cada contacto con cultivos o
material contaminante. Al calentar el alambre iniciese por el extremo proximal al mango para evitar
se proyecten partículas de gérmenes sobre la mesa.

9. Los tubos de cultivo recientes o ya utilizados no deben dejarse sobre la mesa, siempre colóquelos en
el cestillo o en la gradilla para tubos.

10. Terminada su .práctica, cierre la llave del gas y deje ordenadamente todo el material que se le ha
proporcionado presentando especial atención al microscopio, instrumento delicado y costoso que el
estudiante está obligado a cuidar.

11. Etiquete todo el material trabajado para que pueda ser fácilmente identificado al día siguiente.

12. No use el alcohol yodado como desinfectante de las manos.

13. El alumno no ingresara al salón de prácticas sin el manual de practicas del curso
 PRÁCTICA Nº 01

BIODEGURIDAD

I. INTRODUCCIÓN:

Bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas, dirigidas a proteger la salud del personal de

riesgos laborales procedentes de agentes físicos, químicos y ergonómicos que pueden constituir
accidentes de trabajo o enfermedades profesionales. En su expresión general involucra el no hacer
daño al medio ambiente con sus productos de desecho o residuos que alteren el equilibrio
biológico de la biosfera.

II. OBJETIVO:

 Conocer y aplicar las reglas básicas de seguridad e higiene para los

laboratorios de microbiología y parasitología.

 Analizar la importancia que tiene cada una de estas reglas, tanto en las actividades
académicas de aprendizaje, como en el ejercicio profesional.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

El personal de laboratorio diariamente realiza muchas actividades que puedan causar

enfermedad o daño en el o en las personas que trabajan en ambientes cercanos, o incluso en sus
familiares y en la comunidad.

Estas enfermedades pueden ser causadas por:

- Agentes físicos y mecánicos: Con las temperaturas extremas, radiaciones ionizantes,

contactos eléctricos o conexiones defetuosas y vidrios requebradizos de recipientes
dañados o tubos rotos.

- Agentes químicos:

Corrosivos : Que causan detracción o alteración de los tejidos. Tóxicos :

Cuyos efectos se manifiestan según la vía de exposición

 Inhalación formol, benceno etc.

Carcinógenos: Soluciones como el mercurio, alfa y beta naftilamina.

Inflamables: Como el acido acético, clorhídrico etc.

Explosivos : Azida de sodio, acido pícrico.

RECOMENDACIONES PARA IMPLEMENTAR LA ESTRATEGIA DE

BIOSEGURIDAD.

- Buena estrategia de bioseguridad reconoce el factor humano como el mas importante.

- Las normas de bioseguridad deben ser aplicadas en su totalidad y en todo momento.

- Cada plan de bioseguridad debe tener objetivos específicos y responsabilidades claramente

definida en el personal de laboratorio.

- Debe implementarse un manual de normas de bioseguridad en el ambiente de trabajo, el

cual debe ser revisado y comentado periódicamente entre los miembros del laboratorio.

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO.

La peligrosidad de un agente esta directamente relacionado con el tipo de

microorganismo y la manipulación a que es sometida.poe ello es básico:

1. Conocer las sustancias y productos peligrosos que existen el el laboratorio.

2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.

3. Conocer el equipamiento del laboratorio.

4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.

5. Conocer las leyes relacionadas con seguridad biológica.

6. Respaldar y hacer cumplir todo lo enunciado.

MEDIDAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

1. El acceso al laboratorio será limitado al personal de laboratorio.

2. Todas las áreas serán debidamente marcadas con señal de riesgo biológico y su nivel de
contención.

3. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención
biológica.

4. Todas las superficies de trabajo se limpiaran y desinfectaran diariamente y siempre que se

produzca un derrame.

5. Los residuos y sustancias peligrosas que deben ser incinerados fuera del laboratorio.

6. Deben ser transportados los contendores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las
normas especificas para cada tipo de residuo.

7. La ropa protectora debe ser fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas etc.

8. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales
potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o
cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir
del área de trabajo.

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

 METODOLOGIA

- Discutir las normas generales de seguridad e higiene para cualquier laboratorio y

aquellas que se aplican especialmente en el área microbiológica. Hacer especial
hincapié en su importancia.

- Ubicar las zonas de seguridad y controles maestros de suministro de servicios.

- Establecer la utilidad de los desinfectantes, antisépticos y sanitizantes en el

laboratorio de Microbiología.

- Simular los procedimientos a seguir en caso de accidentes, temblores, derrames y

sobre la disposición de desechos en el laboratorio.

- Proponer otras guías de observación para verificar el cumplimiento de los

reglamentos vigentes en los laboratorios.

Llenar la siguiente guía de observación:

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

Guía de observación para evaluar el cumplimiento de los Reglamentos de Seguridad e

Higiene.

Fecha:

Mesa:

Nombre de quien evalúa:

Bata limpia

Uso de gorro

Uso de cubrebocas

Uso de lentes de seguridad

Calzado cerrado

Cabello recogido

Sin joyería

Uñas cortas y sin esmalte

Limpieza del área de trabajo al iniciar sesión experimental

Orden de las áreas de trabajo:

a. mesa

b. gaveta

Depósito adecuado de los desechos

Esterilización de material contaminado

Entrega oportuna del material empleado en los ejercicios anteriores

Respeta las instrucciones dadas para el ejercicio

Limpieza del área de trabajo al finalizar sesión experimental

Observaciones

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 8

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

- Marcar cuando no se cumpla la acción

- Marcar cuando se cumpla la acción

- Marcar además con * cuando exista un comentario especial con respecto a

la acción evaluada

- Anotar el comentario en la parte de observaciones, en caso de ser insuficiente el espacio anotarlo

al reverso con la fecha de la evaluación.

V. RESULTADOS, DISCUCIONES, CONCLUSIONES Y REFERENCIAS:

VI. TRABAJO ENCARGADO:

1. ¿Por qué debemos seguir el reglamento de seguridad e higiene dentro del laboratorio
de microbiología y parasitología?

2. Realice un esquema aplicando las medidas de bioseguridad en un laboratorio de

microbiología

3. ¿Cuál crees que sea la importancia a nivel personal de cumplir con las reglas
de seguridad e higiene?

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 9

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

4. ¿Cuáles son los implementos de seguridad que los estudiantes deben cumplir?

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 1

0
PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

PRÁCTICA Nº 02

RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO-

MICROSCOPÍA

VII. INTRODUCCIÓN:

Es importante que el estudiante se familiarice con diferentes materiales y equipos del

laboratorio e identifique el uso correcto del material a utilizarse en el desarrollo de las
diferentes prácticas.

La microscopía tiene un papel fundamental en microbiología y es un primer paso importante

para el examen de todas las muestras. Los microorganismos muestran una amplia gama de
tamaños, son demasiado pequeños para verlos individualmente a simple vista y por tanto el
microscopio constituye un instrumento esencial en microbiología. El microscopio óptico
amplia los objetos y por tanto mejora la
capacidad, de resolución del ojo desnudo desde 20 m hasta aproximadamente
0.2 m

VIII. OBJETIVO:

 Conocer los distintos materiales y equipos utilizados en el laboratorio de

microbiología y describirlos.

 Descripción del manejo del microscopio compuesto, sus partes y funciones.

IX. FUNDAMENTO TEÓRICO:

 Autoclave a vapor saturado a presión:

Es un aparato que sirve para esterilizar material y medios de cultivo, utilizan vapor de
agua a presión.

Consiste esencialmente en una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado
libre de aire y se mantiene a una temperatura indicada y a una presión establecida por
un periodo determinado. Al manejar un autoclave es absolutamente necesario que el
aire que llena la cámara sea totalmente
reemplazado por vapor saturado. No es la presión la que mata los

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 10

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

microorganismos sino la elevada temperatura del vapor de agua. El auto

clavado se realiza a121º C o 200º F y a una presión de 151lbs / pul2 que es
igual a 775 mm Hg durante 15 min.

 Horno o esterilizador:

Son aparatos metálicos en forma de cajones o cubos rectangulares con doble puerta.
Sus paredes pueden ser de doble o triple capa con o sin asbesto. Posee resistencia para
emitir el calor, equipo de reóstato para graduar la temperatura deseada, sistema de
llaves y relojería para graduar el tiempo que serán esterilizados los materiales de
vidrio o metal. El tiempo depende del tamaño del equipo una a dos horas y la
temperatura de 150º C a 200º C es importante resaltar el tipo de esterilización a calor
seco.

 Estufa bacteriológica:

Aparato que se utiliza para realizar el crecimiento bacteriano, posee un sistema de

graduación de temperatura y de tiempo.

 Microscopio:

Constituye un instrumento esencial en microbiología, existen diversos tipos de

microscopios y nosotros utilizaremos microscopía óptica de campo claro o brillante
mediante la cual examinaremos muestras y cultivos en preparaciones húmedas o
teñidas. Las preparaciones húmedas se emplean para demostrar células sanguíneas y
microorganismos en muestras líquidas como orina, heces, líquido cefalorraquídeo,
hongos en la piel, protozoarios de sangre y tejidos. Es posible detectar la movilidad de
algunos organismos vivos.

 Baño maría:

 Centrífuga:

 Refrigerador :

 Balanza:

EQUIPOS MENORES.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 11

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

 Mechero Bunsen ( a gas propano):

Sirve para esterilizar asas de siembra que se coloca en posición casi vertical, haciendo
que se ponga casi al rojo vivo desde la punta hacia la base y luego se retira de
inmediato impidiendo rocen con algún objeto si se desea tomar alguna muestra.

 Asas de siembra: o asa de Kolle:

consiste en alambre de de Nichrone o platino que van insertado a un mango cilíndrico

para un uso sencillo. Existen dos tipos:

a) asa cerrada.- Presenta un arco bastante cerrado en su extremo, es utilizada para la

inoculación por estrías en medios sólidos muchas de ellas son calibradas
correspondiendo a un volumen determinado de siembra.

b) Asa en Punta.- Son similares a los anteriores con la diferencia que no presentan
aros en su extremo, son rectas. Se utiliza para la siembra por picadura en medios
líquidos.

 Materiales de vidrio:

Utilizaremos placas Petri, pipetas graduadas, matraz de Erlenmeyer, tubos de ensayo

simple o con tapa rosca , probetas graduadas, láminas portaobjetos, láminas
cubreobjetos.

X. PARTE EXPERIMENTAL:

1.- MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO:

A. Practique el manejo adecuado del microscopio compuesto utilizando

muestras fijadas de menor a mayor aumento.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 12

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

Haga círculos dibuje y esquematice las observaciones.

40 x Inmersión 100 x

B. Observación en fresco de las bacterias.

 Observe al microscopio en forma y movimiento. Diferencia el movimiento

microbiano y flagelar.

Procedimiento:

Colocar sobre la lámina una gota de cultivo bacteriano y dejar caer la laminilla.

Materiales:

 cultivo bacteriano

 laminas portaobjetos.

 laminillas cubre objetos.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 13

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

40 x Inmersión 100 x

XI. RESULTADOS, DISCUCIONES, CONCLUSIONES Y REFERENCIAS:

XII. TRABAJO ENCARGADO:

1. Microscopia: clases de microscopios, fundamento.

2. Dibujar microscopio compuesto, partes y manejo.

3. Cuál es el fundamento del uso del aceite de inmersión

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 14

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 15

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 16

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 17

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 18

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 19

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 20

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

PRÁCTICA Nº 3

ESTERILIZACIÓN

I: INTRODUCCIÓN:

Esterilización es el procedimiento físico químico mediante el cual el material determinado

queda exento de microorganismos sean o no patógenos que se encuentran en el interior o en
la superficie de objetos y superficies.

II: OBJETIVOS:

1. Conocer los distintos métodos de esterilización físicos y químicos

2. Descripción y uso correcto de los materiales: limpieza y esterilización.

3. Esterilizar todo material usado en microbiología

III: FUNDAMENTO TEÓRICO:

Los procesos de esterilización se clasifican en métodos de esterilización se clasifican en:

Métodos físicos y métodos químicos.

Métodos físicos

1. Esterilización por el calor

2. Esterilización por filtración

3. Esterilización por radiación

4. Esterilización por centrifugación

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 21

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

Métodos químicos

1. Esterilización por agentes químicos

MÉTODOS FÍSICOS

1. Esterilización por el calor

La acción esterilizante del calor depende más que nada de las condiciones en que
actúa: intensidad, tiempo, humedad y sobre todo susceptibilidad especial de cada
microorganismo.

Esterilización por la llama directa: produce la

carbonización de los microorganismos y sus esporas se le usa
para esterilizar el asa del platino (asa de kolle), boca de tubos,
matraces, pipetas, etc., utilizando la llama de gas producida por
un mechero.
Esterilización
Esterilización por aire caliente: (estufa de esterilización).
por calor
El calor actúa como aire caliente a la temperatura de 165 –
seco 170ºC por el tiempo de media hora. Sirve para esterilizar objetos
por el tiempo de media hora sirve para esterilizar objetos
resistentes y sólidos como cristalería, porcelana, instrumentos
etc., Aplicando la conocida estufa de esterilización; cuyo
esquema se encuentra se encuentra a continuación

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 22

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

Esterilización por ebullición: utilizando agua en ebullición.

No elimina las esporas. Se aplica en la esterilización limitada de
jeringas, agujas, pinzas, etc.,(NO CORRESPONDE)

Esterilización por vapor fluente: Thyndalización) consiste

en un calentamiento por vapor de agua discontinuo a 80 –
100ºC, refrigerado después, por tres veces con intervalos de 24
hs. Elimina gérmenes y esporas sirve para esterilizar medios
que se descomponen por el calor a a 80 – 100ºC, como
carbohidratos, gelatina, leche, suero, etc., suprime la hidrólisis
por calentamiento.

Esterilización Esterilización por vapor de agua a presión: (Autoclave)

es el método ideal para el campo bacteriológico. Se basa en el
que el vapor de agua a presión es más caliente que el agua en
ebullición o el vapor libre. Cuanta más alta es la presión del
vapor mayor es la temperatura resultante. El vapor penetra por
por calor
ósmosis provocando la coagulación del protoplasma en las
bacterias y esporas.

Las condiciones de esterilización son: 121ºC a 15 lb., de presión

por pulgada cuadrada por el tiempo de 15 min. , utilizando el
aparato llamado “Autoclave” cuyo esquema se encuentra a
continuación. En el se esteriliza objetos y

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 23

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

sustancias que resisten temperaturas mayores a 100ºC, tales

como: medios de cultivo en general, solución salina, agua
destilada. Sirve también para esterilizar material desechable
húmedo como: Cultivos usados, medios contaminados, etc.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 24

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

2. Esterilización por filtración: Este método se basa en fenómeno fisicoquímicos,

entre los microorganismos en suspensión y en un cuerpo poroso (filtro)
semipermeable; así se separan gérmenes y micelas orgánicas de los líquidos que las
contienen. Se emplea para eliminación de bacterias de sueros, líquidos que las
contienen. Se emplea para eliminación de bacterias de sueros, líquido ascético,
extractos de hígado, etc.

La filtración bacteriológica se efectúa en aparatos llamados “filtros” cuya parte

principal es un elemento poroso (porcelana, tierra de infusorios, asbestos, etc.) Los
líquidos filtrados deben de atravesar por presión o aspiración porosidades de diverso
diámetro. Al tratar de pasar los gérmenes son retenidos por adsorción.

Los filtros usados son aquellos cuyo elemento poroso tiene la forma de bujía de
disco: Bujías de Chamberland, Bekerfield, Mandler y discos filtros de Seitz.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 25

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

3. Esterilización por radiación: los rayos ultravioletas del espectro de una longitud
de onda comprendida entre 200 y 254 nm. Poseen un alto poder germicida, sin
embargo escaso poder de penetración; su acción se ejerce sobre la superficie de los
cuerpos expuestos a la radiación, por ello se usan poco en la esterilización de
laboratorio. Su empleo es mayor en el campo de la medicina e higiene para
esterilizar instrumental, aire, suelo, paredes, etc. Destrucción de gérmenes y virus en
las gotitas de Flungge, etc.

4. Esterilización por centrifugación: Este método separa los gérmenes del líquido
en que se encuentran suspendidos, no es seguro y solo se le emplea como
procedimiento previo de clarificación en la esterilización y la ultracentrifugación
para purificación y concentración de virus.

Métodos químicos

I. Esterilización por agentes químicos.- en este procedimiento la muerte de los

gérmenes se consigue por substancias químicas que actúan coagulando el
protoplasma o interfiriendo el metabolismo bacteriano

Algunos desinfectantes y antisepticos de mayor uso: desde el punto de vista practico se les
agrupa en:

 Halógenos y compuestos halogenados: F,Cl,Br,I.

 Sales de metales pesados: nitrato de plata, bicloruro de mercurio, sulfato de

cobre.

 Fenol y derivados.

 Alcoholes.

 Colorantes: violeta de genciana, azul de metileno, verde de malaquita.

 Compuestos amonicos cuaternarios.

 Gases microbicidas

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 26

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

IV: PARTE EXPERIMENTAL:

1.- PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO PARA SU ESTERILIZACIÓN:

Este paso se refiere a la preparación del material lavado y secado para su esterilización ya
sea en autoclave o en horno.

 Los tubos de prueba:

Primero se deben preparar tapones de algodón adecuado, con dobleces al interior

para que no se abran, no deben de ser apretados ni flojos, ni cortos ni largos, así los
tubos taponados de tamaños iguales con empaquetados con papel Kraft y armados
con hilo pabilo, luego anótese sobre el papel el tamaño de los tubos y la fecha de
esterilización.

 Las placas Petri:

Se colocan los dos juegos de placas homólogas sobre un papel tamaño carta, se
empaqueta como si se tratara de paquetito de regalo con dobleces hacia el centro, y
los dos extremos se doblan en triángulo y todo se envuelve hacia atrás.

 Erlemayer y otros frascos:

Se les coloca tapones de algodón protegidos con gasa, amarrada en parte de la

cabeza y se protege con papel kraft el cual se amarra firmemente con pabilo.

La esterilización en horno se realiza entre 150º a 200º C por espacio de una a dos
horas.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 27

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 28

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

V: RESULTADOS, DISCUCIÓN, CONCLUSIÓN, REFERENCIAS:

VI: TRABAJO ENCARGADO

1. Cual es el fundamento de esterilización a calor húmedo y que aparato se usa

2. Investigar sobre métodos de esterilización químicos: fundamentos.

3. Diferencia entre sustancias bactericidas y bacteriostáticas.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 29

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

PRÁCTICA Nº 4

MORFOLOGÍA BACTERIANA Y MÉTODOS DE COLORACIÓN.

I: INTRODUCCIÓN:

Conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo índice de refracción que el agua, es
indispensable emplear procedimientos de tinción que permitan visualizarlo.

En ésta práctica empezaremos recién a tener contacto con las bacterias, se hace pues necesario
utilizar colorantes a fin de hacerlas más visibles y que permitan estudiar su morfología, cuya
información constituye a la caracterización, identificación y diagnóstico de géneros
bacterianos.

II: OBJETIVOS:

1. Conocer la morfología bacteriana y los métodos de coloración.

2. Realizar coloraciones de Gram y diferenciar los microorganismos Gram positivos y

Gram negativos.

III: FUNDAMENTO TEÓRICO:

Las bacterias son difíciles de observarse al microscopio, por eso es indispensable emplear
procedimientos de coloraciones o tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente y
demostrar los detalles finos de su estructura, tales como: flagelos, esporas, cápsula, gránulos
meta cromáticos, etc.; sin embargo los colorantes deben emplearse en solución
generalmente acuosa; los cuales previamente han sido disueltos empleando alcohol.
También es necesario el empleo de mordientes, los cuales son sustancias que actúan entre el
tejido y el colorante formando sales, permitiendo que la coloración quede fuertemente
fijada. El mordiente puede ser colocado sobre el preparado antes o después de la acción del
colorante principal: como fenol, oxalato de amonio, se mezclan con el cristal de violeta en el
método Gram, las estructuras bacterianas se colorean por diversos procedimientos con
colorantes propios para cada componente celular.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 30

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras:

1. Observando los microorganismos vivos en suspensión: Coloración simple.

Este tipo de montaje hace posible la observación de microorganismos vivos. Es la

llamada observación vital, este examen se realiza con la finalidad de observar
características de movilidad, morfología.

2. Observando las células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes

procedimientos de coloración: Coloración Compleja.

IV: PARTE EXPERIMENTAL:

A. EXPERIMENTO 1: COLORACIÓN SIMPLE (FROTIS SECO).

Procedimiento:

a) Tome una lámina porta objetos limpia, coloque tres gotas de agua destilada para
hacer tres frotices, con tres gérmenes diferentes.

b) Con el asa tome una pequeña porción de cultivo en medio sólido y disuelva en la
gota de agua (cuando el cultivo es medio líquido no necesita de agua) los frotices
que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.

c) Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama muy suavemente para
obtener la fijación del frotis.

d) Cubra la preparación, con dos o tres gotas de azul de metileno de Loeffler´s,

dejando que el colorante actúe por un minuto, luego lave la preparación con agua
corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis.

e) Seque y observe al microscopio usando el lente de inmersión (100X con aceite

de inmersión).

f) Observación, interpretación y conclusiones.

Material

 Set colorante Azul de metileno (solución acuosa 1%)

 Tubo de caldo de cultivo del microorganismo elegido-

B. EXPERIMENTO 2: PREPARACIONES HÚMEDAS (EXAMEN EN FRESCO)

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 31

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

Las muestras como sedimento urinario, esputo o exudados pueden utilizar directamente
mientras que si el material es demasiado espeso puede diluirse con solución salina.

a) Colocar la muestra de orina en un tubo de ensayo de 13 x 100 y centrifugar por

5’ a 3000 r.p.m.

b) Eliminar el sobrenadante.

c) Colocar el sedimento en un portaobjetos y colocar un cubreobjeto.

d) Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

e) Observación: células epiteliales, leucocitos, microorganismos (bacterias,

hongos).

f) Interpretación y conclusiones.

C. EXPERIMENTO 3: COLORACIÓN COMPLEJA.

a) Coloración de Gram.

Fundamento:

El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared

celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de yodo
(mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes
celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aun luego del
tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Gram positivas. Las bacterias Gram
negativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la
coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante.
El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias
Gram negativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas al
microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes
celulares.

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del

colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras
como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente
diferenciables.

Procedimiento:

a. Prepara el frotis, coloque una asada de caldo cultivo que contienen una
mezcla de bacterias gram positivas y gram negativas sobre una
lámina portaobjetos limpia.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 32

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

b. Fijar a la llama.

c. Colorear: colocando una gota suficiente del colorante cristal de violeta o

violeta de genciana sobre la muestra dejándola actuar por 1 minuto.

d. Lavar con agua corriente.

e. Cubrir el portaobjetos con lugol por 30 a 60 segundos.

f. Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lámina con alcohol-acetona hasta

observar que ya no sale más colorante.

g. Lavar la lámina con agua corriente.

h. Coloración de contraste: colocar unas gotas de safranina por 30 a 60

segundos.

i. Lavar la lámina; luego observar al microscopio con la lente de inmersión.

j. Observación, interpretación y conclusiones.

Material:

 Microscopio.

 Láminas portaobjetos.

 Set de coloración de Gram (sol. de cristal violeta, lugol,

alcohol-acetona, safranina).

 Tubo de caldo cultivo de la mezcla de E.

coli, Staphylococcus, Streptococcus.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 33

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

FROTIS

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 34

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 35

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

FUNDAMENTO

OBSERVADO EN EL MICROSCOPIO

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 36

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 37

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 38

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 39

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

V: RESULTADOS, DISCUCIÓN, CONCLUSIÓN, REFERENCIAS:

VI: TRABAJO ENCARGADO:

CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.

2. Indique que función cumple el Lugol en la coloración Gram.

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 40

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

3. Mencione tres microorganismos (género) que sean Cocos Gram positivos, Bacilos Gram
positivos, Cocos Gram negativos, y Bacilos Gram negativos.

4. Porque las bacterias toman de manera diferencial la coloración de Gram

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 41

PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA FCSB- UNSA

M.Sc. María del Carmen Valdez Ortiz 42