UNIVERSIDAD DEL VALLE

SUB-SEDE ACADÉMICA LA PAZ

CULTIVO DE ESPUTO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MATERIA: BACTERIOLOGÍA

CARRERA: BIOQUÍMICA – FARMACIA

PARALELO: “A-1”

INTEGRANTES:

 ALIAGA MONZÓN NOEMI

 ARIAS LARUTA YOSELIN VANIA

 CALLISAYA RAMOS HARLIN LUZ

 COPA GUTIERREZ PAOLA MARION

 SAA VERA ALISON TATIANA

DOCENTE: Dra. Djanira Stephanie Kristeller Antezana

LA PAZ -BOLIVIA
2023
 CULTIVO DE ESPUTO
I. OBJETIVOS
a. OBJETIVO GENERAL
 Procesar y sembrar una muestra de esputo para determinar después
mediante las pruebas bioquímicas que bacteria es la causante si el
paciente presenta una infección en el aparato respiratorio inferior.

b. OBJETIVO ESPECIFICO
 Saber cómo se consigue una muestra de esputo y las indicaciones
para su toma.
 Conocer las diferentes consistencias de la flema para tener ya un
pronóstico de que bacterias podría encontrar.
 Diferenciar la flora normal y patógena del aparato respiratorio.
II. MARCO TEÓRICO
Una infección de las vías respiratorias altas (URI, por sus siglas en inglés) es
una infección bacteriana o viral de la nariz, los senos paranasales o la
garganta. Los síntomas comunes de una URI son goteo o congestión nasal y
tos. Entre los ejemplos de URI se incluyen gripe, resfriado y sinusitis.
El tratamiento para una URI depende de si el médico sospecha que la infección
es causada por una bacteria o por un virus. Si la causa es una infección
bacteriana, se utilizan antibióticos. Si la causa es una infección viral, se utiliza
el tratamiento en el hogar, como descansar más y beber una cantidad
abundante de líquidos
1.-BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA EN EL EXAMEN DE ESPUTO
Las bacterias más frecuentes en las infecciones de vías respiratorias bajas son
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y
Haemophilus influenzae.4,5
El estudio bacteriológico de los esputos es una herramienta importante que
permite hacer una determinación del tratamiento específico que necesita el
paciente. Sin embargo, su efectividad ha sido cuestionada por el uso de la
muestra en sí, que genera una baja sensibilidad y especificidad en
comparación con lavados bronquiales o broncoalveolares, debido a la gran
cantidad de biota bacteriana asociada a la zona nasofaríngea. De ahí, la
importancia de las muestras representativas. Éstas se pueden evaluar con la
presencia de células epiteliales y leucocitos. Con el uso de una muestra de
esputo representativa de la infección, la identificación del patógeno será más
eficaz.
2.-CULTIVO MICROBIANO EN MUESTRA DE ESPUTO
AGAR MAC CONKEY
Fundamento
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir de muestras clínicas,
aguas y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo. Su fórmula cumple con los requerimientos de la
Armonización de Farmacopeas Europea, japonesa y de los Estados Unidos de
Norteamérica (EP, JP y USP respectivamente). En el medio de cultivo, las
peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el
cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte
de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las
colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no
fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
3.- PRUEBAS BIOQUIMICAS
CITRATO
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno
y el citrato de sodio es la única fuente de carbono.
Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales
de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el agente
solidificante.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces
de utilizar citrato como única fuente de carbono usan sales de amonio como
única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico.
El desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos
que al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa. (Britania - Citrato, s.f.)
AGAR TSI (Triple Sugar Iron Agar)

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en

base a la fermentación de los hidratos de carbono glucosa, lactosa y sacarosa
y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fundamento

En el medio de cultivo, el extracto de carne

y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono fermentables. El
tiosulfato de sodio es el sustrato necesario
para la producción de ácido sulfhídrico, el
sulfato de hierro y amonio, es la fuente de
iones Fe3+ , los cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de
hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es
el agente solidificante. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que
se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo
en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro
de color negro.

Interpretación de resultados:

Observar el color del medio de cultivo y la producción de gas.

1. Superficie alcalina/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo): el

microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2. Superficie ácida/Profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo): el
microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3. Superficie alcalina/Profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo): el
microorganismo es no fermentador de azúcares.
4. La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indican que el
microorganismo produce gas.
5. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce
ácido sulfhídrico.

AGAR LIA (Lisina Hierro Agar)

Medio de cultivo utilizado para

diferenciar microorganismos,
especialmente Salmonella spp.,
basado en la descarboxilación y desaminación de la lisina y en la producción
de ácido sulfhídrico.

Fundamento:

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los

nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las
enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato
de sodio son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura
de bromocresol, es el indicador de pH (su color es amarillo a pH igual o menor
a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el agente solidificante.
Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y provocan
el viraje del color púrpura al amarillo. El ambiente ácido favorece la actividad
enzimática decarboxilasa y se metaboliza la lisina a cadaverina elevando el pH
del medio de cultivo y tornándolo al color púrpura o violeta. Los
microorganismos fermentadores de glucosa que no tienen actividad lisina
decarboxilasa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al color
amarillo. A las 24 horas de incubación se observa el fondo del tubo color
amarillo y la superficie de color violeta debido al consumo de las peptonas que
producen alcalinidad. La generación de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las
cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas de Morganella,
desaminan la lisina. Esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual con la
sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la
superficie del medio.

Interpretación de resultados:

● Decarboxilación de la lisina:
○ Resultado Positivo: superficie alcalina / profundidad alcalina (pico
violeta / fondo violeta).
○ Resultado negativo: superficie alcalina /profundidad ácida (pico
violeta / fondo amarillo).
● Desaminación de la lisina:
○ Resultado positivo: superficie rojiza / profundidad ácida. Esto
sucede con cepas del género Proteus, Providencia y algunas de
Morganella spp.
● Producción de SH2 :
○ Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo
(especialmente en el límite entre la superficie y profundidad).
○ Resultado negativo: el medio de cultivo permanece sin cambio de
color.

MEDIO SIM
Medio semisólido destinado a
verificar la movilidad, producción de
indol y de sulfuro de hidrógeno por
los microorganismos. Es útil para
diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Fundamento

Medio de cultivo en el cual la

tripteína y la peptona aportan
nutrientes para el desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido
constituyente de muchas peptonas y particularmente de la tripteína y puede ser
metabolizado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene
un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina
con el aldehido del reactivo de Ehrlich o de Kovac´s, para originar un
compuesto de color rojo. A partir del tiosulfato de sodio los microorganismos
pueden generar ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro presente
formándose un compuesto de color negro. El agar es el agente solidificante y a
esta concentración le otorga al medio la propiedad de ser semisólido, condición
necesaria para detectar movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del
medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de siembra del
microorganismo en estudio.

Interpretación de resultados:

Observar la movilidad y el color del medio de cultivo. Luego realizar la prueba

de indol.

● Movilidad:
○ Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá
de la línea de siembra.
○ Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de
siembra.
● Producción de SH2 :
○ Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo a lo
largo de la línea de siembra o en todo el medio.
○ Resultado negativo: el medio permanece sin cambio de color.
● Prueba del indol: Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de Indol
Reactivo.
○ Resultado positivo: color rojo.
○ Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece
incoloro-amarillento.

CHRISTENSEN MEDIO (Urea Agar

Base)
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad
ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como
Proteus spp. otras enterobacterias y estafilococos.

Fundamento:

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el

desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. El agar es el agente
solidificante. Las bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa y
liberan amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio de
cultivo haciendo virar el indicador rojo de fenol del color amarillo al rojo. Es
recomendado especialmente para la detección de la actividad ureásica en
bacterias que hidrolizan lentamente la urea ya que la fermentación de la
glucosa presente activa la enzima ureasa microbiana. Este es el caso de
Klebsiella spp., Enterobacter spp y Citrobacter spp.

Interpretación de resultados:

● Microorganismos que hidrolizan la urea: el medio de cultivo es de color

rosado-rojizo.
● Microorganismos que no hidrolizan la urea: el medio de cultivo
permanece de color amarillo.

III. PROCEDIMIENTO
Se tomó una muestra de esputo en un frasco estéril, el cual fue trasladado al
laboratorio para el posterior análisis.
- Siembra en el Agar MacConkey
 Tomar un poco de muestra esputo con un hisopo estéril.
 Bajo el mechero abrir la placa con el Agar MC y sembrar la
muestra tomada anteriormente.
 Esterilizar el asa bacteriológica y nuevamente bajo el mechero
estriar la muestra a partir del sembrado realizado con el hisopo.
 Incubar la placa por 24 horas a 35°C en la estufa.
 - Frotis de la muestra:
 Tomar un portaobjetos limpio y sobre el mismo realizar un
extendido delgado de la muestra con el mismo hisopo
previamente utilizado.
 Quemar un poco el hisopo y desecharlo.
 Fijar la muestra al portaobjetos con ayuda del mechero.
 Teñir el portaobjetos con Tinción Gram
 Observar al microscopio e identificar la diferencial.
- Galería:
 Pasado el tiempo de incubación necesario de la placa se toma
una colonia desarrollada y se siembra con el asa en hilo en las
siguientes pruebas bioquímicas:
 Citrato: Sembrar en zigzag (serpenteado)en toda la
superficie.
 TSI: Sembrar en picada y sobre la superficie en zigzag al
salir.
 LIA: Sembrar en picada y sobre la superficie en zigzag al
salir.
 SIM: Sembrar en picada y salir por el mismo lugar por el
cual entro el asa.
 Urea: Sembrar en zigzag en toda la superficie
 Incubar las pruebas en la estufa por 24 horas a 37°C
 Realizar la prueba de Indol en el tubo de SIM colocando 3 gotas
de reactivo Kovacs y observar el color de la reacción: amarillo (+)
o anillo anaranjado (-).
 Realizar también la prueba de sulfuro en el tubo de SIM mediante
la observación de si hay una coloración color negro (+) o si no,
para saber si hay presencia de sulfuro.

IV. RESULTADOS
- RESULTADOS EN AGAR MACCONKEY

Agar MacConkey

Las colonias observadas son grandes,

chiclosas y brillantes, además de
presentar un color rosado, el cual
indica que la bacteria es LACTOSA
POSITIVO (+)

- PRUEBAS BIOQUÍMICAS
 Prueba del Citrato

Observando el medio se pudo notar la

ausencia de desarrollo bacteriano, por
lo que resulta ser CITRATO
NEGATIVO (-)

T.S.I. Agar (Triple Sugar Iron Agar)

Observando el medio podemos decir

que la bacteria es TSI A/A por la
formación de color amarillo tanto en
la base como en el pico, por otro lado,
resulta con producción de gas
positivo (+).

Agar LIA (Lisina Hierro)

Debido a la ausencia de cambios en el

medio podemos decir que se trata de
una bacteria LIA NEGATIVO (-).

Medio SIM (Sulfuro Indol Movilidad)

En el medio SIM los resultados

indican que se trata de una bacteria
SULFURO (-); MOTILIDAD (-) e
INDOL (-).

Medio UREA

Observando el cambio de color del medio

podemos decir que se trata de una bacteria
UREA POSITIVO (+).

- IDENTIFICACIÓN DE LA BACTERIA:
La bacteria causante de la infección se identificó como Klebsiella Pneumoniae:

KLEBSIELLA PNEUMONIAE
 Pruebas AGAR
TSI LIA CITRATO SIM UREA
realizadas MacConkey

A/A Sulfuro (-)

Resultados Lactosa (+) Amarillo LIA (-) Negativo Motilidad Urea
de la
rosado total con (verde) (-) (+)
practica
Gas (+) Indol (-)

Sulfuro (-)
Resultados A/A
de Lactosa (+) LIA Positivo Indol (-) Urea
bibliografí Amarillo (+) (azul) (+)
rosado Motilidad
a total
(-)

V. CONCLUSIÓN
Se llegó a sembrar la muestra de esputo y posteriormente a determinar que
bacteria era la causante de la infección en la muestra. El esputo es la muestra
más utilizada para el diagnóstico de infecciones del aparato respiratorio inferior
y cuando se obtiene una muestra de buena calidad permite el diagnostico
evitando otras técnicas invasivas. La Klebsiella pneumoniae es la especie de
mayor relevancia clínica en el género ‘Klebsiella’ de la familia
Enterobacteriaceae porque es uno de los microorganismos causantes de
infecciones intrahospitalarias con causa de muerte por su resistencia a los
antibióticos, además puede provocar infecciones respiratorias como la
neumonía.

VI. BIBLIOGRAFÍA
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 Ewing. 1986. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae, 4th ed.
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 SciELO - Scientific Electronic Library Online. (s. f.). Recuperado 31 de octubre
de 2022, de [Link]

VII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la interpretación de un esputo cuyo examen microscópico
presenta un recuento de células epiteliales superior a 10 por campo
(objetivo x 10)?
R. Indica contaminación orofaríngea.
2. ¿Qué bacteria alfa-hemolítica aislada de una muestra de esputo en
infecciones del aparato respiratorio inferior es sensible a la
optoquina y soluble en la bilis?
R. Los neumococos