Fonaments de Nanotecnologia

Tema 4: Técnicas instrumentales de

detección y caracterización
Carlos Rey Castro ([email protected])
17 de diciembre de 2020

Índice
1. Métodos basados en la dispersión de la luz 2
1.1. Dispersión de luz dinámica (Dynamic Light Scattering, DLS) . 2
1.2. Dispersión de luz electroforética (Laser Doppler Electrophore-
sis, LDE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Dispersión de luz estática (Static Light Scattering, SLS) . . . . 12
1.4. Análisis de rastreo de nanopartı́culas
(Nanoparticle tracking analysis, NTA) . . . . . . . . . . . . . . 18
1.5. Técnicas de dispersión de bajo ángulo
(Small angle scattering): SAXS, SANS . . . . . . . . . . . . . 18

2. Métodos basados en la microscopı́a 18

2.1. Microscopı́a electrónica de transmisión
(Transmission Electron Microscopy, TEM) . . . . . . . . . . . 20
2.1.1. Preparación de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1.2. Variantes de la TEM convencional . . . . . . . . . . . . 23
2.2. Microscopı́a electrónica de barrido (Scanning Electron Micros-
copy, SEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.1. Fundamento de la técnica: Generación de la señal . . . 25
2.2.2. Preparación de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3. Microscopı́a de fuerza atómica (AFM) . . . . . . . . . . . . . 30

3. Métodos de determinación del área superficial especı́fica 33

4. Técnicas de fraccionamiento y purificación 33

1
Bibliografı́a 33

Resumen
En este tema estudiaremos algunas de las técnicas más recientes
para la detección, cuantificación (determinación de la concentración),
caracterización de la morfologı́a (tamaño, forma) y las propiedades
más relevantes (composición, potencial zeta, cinética de agregación)
de las nanopartı́culas en dispersión acuosa. El criterio de selección
de las técnicas presentadas se basa en su utilidad para la caracte-
rización de la morfologı́a, estabilidad y comportamiento de las NPs
de interés biotecnológico en fluidos biológicos, seleccionando aquellas
técnicas que no se han abordado en otras asignaturas del Grado. Aquı́
se aplicarán muchos de los conceptos que hemos visto en los temas
anteriores. He intentado simplificar en lo posible la complejidad técni-
ca de este apartado, limitándome a los detalles imprescindibles para
comprender el fundamento de cada técnica y poder interpretar sus
resultados. Se ha profundizado un poco más en el nivel de descrip-
ción de las técnicas Dynamic Light Scattering (DLS) y Laser Doppler
Electrophoresis, puesto que son las técnicas que se emplearán en las
prácticas de laboratorio.

1. Métodos basados en la dispersión de la luz

1.1. Dispersión de luz dinámica (Dynamic Light Scat-
tering, DLS)
La dispersión dinámica de la luz (Dynamic Light Scattering, DLS) tam-
bién se denomina espectroscopia de correlación fotónica (Photon Correlation
Spectroscopy, PCS), y es la técnica de elección para la medida de las partı́cu-
las coloidales nanométricas en dispersión lı́quida. Al igual que la medida de
la dispersión de Rayleigh (v. Tema 2), esta técnica se basa en la medida de
la radiación dispersada. Pero, en lugar de cuantificar la intensidad media dis-
persada, la DLS determina cómo varı́a la intensidad dispersada en función del
tiempo, o sea, la medida de sus fluctuaciones. Es una medida dinámica de
la dispersión (como indica su nombre). En la actualidad es una herramienta
imprescindible para la determinación del tamaño de las partı́culas por debajo
de la micra (su alcance va desde 10 nm o menos hasta 3.000 nm).

2
Fundamento de la técnica:
En una solución o en una suspensión, cada partı́cula actúa como un centro
dispersor (scattering center). En una muestra normal puede haber un número
elevado (∼ 1010 − 1012 ) de estos centros. Cuando una radiación incide sobre
la muestra, cada partı́cula esparce la radiación en todos los ángulos, y a un
observador (o al detector) le llegarı́a la suma de los fotones dispersados en
aquella dirección. Como simplificación, se puede suponer que la muestra sólo
presenta unas pocas partı́culas (Figura 1).

From Laser

Most light passes

through unscattered

Average
Detector
intensity

Figura 1: Radiación dispersada por un cierto número de partı́culas y ob-

servada por un detector a un cierto ángulo como un patrón de intensidad
fluctuante. Fuente: Malvern [3].

La intensidad de la radiación que recibe el observador dependerá de la

fase de los fotones dispersados. Si estos llegan en fase, habrá interferencia
constructiva y la intensidad resultante será máxima; si, por el contrario, los
fotones están desfasados, la interferencia será destructiva y el observador
puede no percibir ninguna radiación. Por lo tanto, la radiación que detecta
el observador dependerá de la posición relativa de las partı́culas dispersoras.
Ası́, para pasar de una interferencia destructiva a una interferencia cons-
tructiva es necesario que las trayectorias ópticas hayan experimentado una
variación relativa de λ (siendo λ la longitud de onda de la radiación), y el
tiempo necesario para pasar de una interferencia constructiva a una interfe-
rencia destructiva dependerá del coeficiente de difusión de la partı́cula, que
en el caso de partı́culas esféricas, viene dado por la ec. de Stokes-Einstein
(Tema 2):
kB T
D= (1)
3πµd
Las partı́culas grandes, con radio hidrodinámico grande, presentan un bajo
coeficiente de difusión y deben tardar más que las pequeñas, que se carac-

3
terizan por un coeficiente de difusión más grande. En un sistema real, la
intensidad de la radiación dispersada I(t) es el resultado de las interferencias
existentes entre todas las partı́culas. Si la muestra fuera homogénea a escala
microscópica, el observador recibirı́a idénticas cantidades de radiación, con
las fases correspondientes. Si se combinaran cantidades equivalentes de ra-
diación de cada fase, el resultado global serı́a una interferencia destructiva
y no se observarı́a ningún tipo de radiación dispersada. Sin embargo, esta
homogeneidad microscópica no existe, ya que el sistema está afectado por el
movimiento browniano y se crean zonas de agrupamiento de partı́culas que
dan lugar a interferencias constructivas. El detector observa una alternancia
entre luminosidad y oscuridad, denominada patrón de moteado (Fig.2).
Sample
Celda
Rayo Incidente
Láser Axis

Pantalla Moteada
Pattern

Figura 2: Patrón de moteado de intensidad fluctuante. Fuente: Malvern[3].

El movimiento browniano produce, por otra parte, un efecto Doppler:

la frecuencia de la radiación dispersada no es exactamente igual a la de la
radiación incidente (por ejemplo, para una radiación incidente de 3 × 108 Hz,
la variación tı́pica es de ∼ 0,3 Hz). De ahı́ que la técnica también se denomina
dispersión quasielàstica de la radiación (Casi Elastic Light Scattering, QELS).
En un sistema real, la medida de las fluctuaciones de la radiación disper-
sada en función del tiempo proporciona una representación como la que se
indica en la Fig. 3. Sin embargo, es muy difı́cil extraer información cuantita-
tiva sobre el tamaño de las partı́culas directamente a partir de la señal de la
intensidad dispersada tal y como se muestra.

Análisis de los resultados:

La información cuantitativa acerca del tamaño de partı́cula se puede ob-
tener a partir de la función de autocorrelación, un método matemático
diseñado para deducir los valores de una determinada caracterı́stica fı́sica
que varı́a con el tiempo, a partir de una señal que fluctúa (aparentemente)

4
 Intensity
Intensity

Time Time

Figura 3: Fluctuaciones de la radiación dispersada a partir de un sistema de

partı́culas grandes (izquierda) o pequeñas (derecha). Fuente: Malvern[3].

de manera aleatoria, en presencia de un ruido de fondo elevado. La función

de autocorrelación se define de la siguiente manera:

1 T
Z
G(τ ) = hI(t) × I(t + τ )i = lı́m I(t) × I(t + τ ) dt (2)
T →∞ T 0

En la ecuación anterior, los corchetes indican que es un promedio temporal

del producto entre la intensidad dispersada en un tiempo t y la intensidad
dispersada a otro tiempo t + τ . Los lı́mites de esta función son:

lı́m G(τ ) = hI(t) × I(t)i = hI(t)2 i

τ →0

lı́m G(τ ) = hI(t)i2

τ →∞

El máximo de la función de autocorrelación se obtiene cuando τ = 0; o sea,

una señal tiene su máxima correlación consigo mismo. A medida que pasa
el tiempo, la correlación entre la señal y la misma señal desplazada a un
tiempo posterior τ va disminuyendo, hasta que, a partir de un determinado
valor de τ , no existe ninguna dependencia entre las dos señales y la función
tiene un valor constante hI(t)i2 . El tiempo de decaimiento de la función
de autocorrelación está relacionado con el coeficiente de difusión D. Si D
es grande, la función de autocorrelación decae rápidamente, y a la inversa.
Si se representan los valores de la función de autocorrelación respecto a los
intervalos de tiempo, τ , se obtiene la gráfica de la Fig 4.
Resumiendo, las medidas de intensidad de la radiación dispersada per-
miten obtener la función de autocorrelación. A partir de ésta, se obtiene el
coeficiente de difusión y, mediante la ecuación de Einstein-Stokes (eq. 1), se
obtiene el valor del diámetro hidrodinámico, o sea, el tamaño de la partı́cula.

5
 Perfect Correlation
1.00

Correlation

Large particles
Small particles
0

=0 =
Time

Figura 4: Función de autocorrelación de las fluctuaciones en la radiación dis-

persada por una muestra de partı́culas grandes y pequeñas1 . Fuente: Mal-
vern[3].

Veamos ahora cuál es la relación cuantitativa entre el tiempo de decai-

miento de la función de autocorrelación y el coeficiente de difusión:
En sistemas de partı́culas perfectamente monodispersos, la función
de autocorrelación viene dada por la siguiente ecuación:

G(τ ) = A [1 + B exp(−2Γτ )] (3)

donde:

• A: lı́nea base de la función de autocorrelación (factor de normalización).

• B: ordenada en el origen de la función de autocorrelación (factor ins-

trumental).

• Γ = Dq 2 (s−1 ) es la tasa de decaimiento.

• D (m2 /s) es el coeficiente de difusión (eq. 1).

• q = ( 4πn
λ0
) sen( 2θ ) es el módulo del vector de scattering (m−1 ).

• n es el ı́ndice de refracción.

• λ0 es la longitud de onda de la fuente láser.

• θ es ángulo de scattering.
1
Nota: la función de autocorrelación está normalizada con respecto a los valores máximo
y mı́nimo.

6
 En una muestra relativamente poco polidispersa, en cambio, una ecua-
ción aproximada (que se obtiene por el denominado método de los cumulan-
tes) para describir la función de autocorrelación es:

G(τ ) ≈ A[1 + B exp(−2Γτ + µ2 τ 2 )] (4)

donde:
• Γ = Dq 2 es la tasa media de decaimiento.
• D es el valor medio del coeficiente de difusión, ponderado según la
intensidad. El valor del diámetro calculado a partir de él (mediante la
eq. 1) se denomina tamaño Z-average.
2
• µ2 /Γ = PDI es el ı́ndice de polidispersidad (polydispersity index).
El valor del PDI permite evaluar el grado de polidispersidad de la muestra:
• PDI < 0,05: observado habitualmente en patrones de látex altamente
monodispersos.
• 0,05 < PDI < 0,08: muestras prácticamente monodispersas.
• 0,08 < PDI < 0,7: muestras moderadamente polidispersas, donde suelen
funcionar correctamente los algoritmos de cálculo de las funciones de
distribución de tamaño.
• PDI > 0,7: muestras excesivamente polidispersas. Probablemente la
función de distribución de tamaños calculada no es realmente represen-
tativa.
En una muestra con un elevado grado de polidispersidad como, p.ej.,
en el caso de distribuciones bi (o poli) modales (como las que se obtienen
mezclando 2 o más dispersiones monomodales), la ecuación anterior no es
suficiente para obtener una distribución fiable de tamaños, y es necesario
recurrir a algoritmos más complejos (como el método CONTIN) que están
implementados en el software del Zetasizer, y que no detallaremos aquı́.
Existen varios motivos para observar polidispersidad en la muestra:
1. Existe una distribución de tamaños intrı́nseca en la muestra (polidis-
persidad de tamaño). Es decir: las partı́culas son todas esferas perfectas
y homogéneas pero presentan diámetros diferentes entre ellas.
2. Existe una heterogeneidad de formas (polidispersidad de forma): las
partı́culas se diferencian en su morfologı́a (p.ej., la dispersión puede
estar compuesta por una mezcla de esferas, discos, cilindros, etc.).

7
 3. Existe una heterogeneidad (o anisotropı́a) de los materiales. Es decir,
las partı́culas difieren ligeramente entre ellas en su composición.

4. Ruido instrumental.

5. Combinaciones de los tipos anteriores.

En la teorı́a de análisis de los datos de DLS sólo se contempla el primer

tipo de polidispersidad. Por este motivo, si existe un nivel significativo de
alguna de las otras fuentes, se traducirá en un aumento de la polidispersidad
aparente de la muestra.

Montaje experimental:
Un equipo de dispersión dinámica de la luz consiste, básicamente, (v.
Fig. 5) en una fuente de radiación láser, una celda a temperatura constante,
un detector -que puede medir en un cierto ángulo-, el correlador y el orde-
nador. Cabe destacar la importancia del control de la temperatura, ya que
variaciones de esta afectarı́an en un principio la viscosidad del medio, pero,
lo que es aún más importante, afectarı́an el movimiento browniano de las
partı́culas, lo que distorsionarı́a los resultados obtenidos. El detector es un
fotomultiplicador de alta calidad que va unido a un contador electrónico de
fotones. Muchos sistemas comerciales tienen el detector fijo a 90◦ ; en otras se
puede medir a ángulos diferentes. En particular, el equipo Zetasizer Nano ZS
(Malvern) tiene el detector montado a 175◦ respecto al haz transmitido (una
tecnologı́a denominada Non-Invasive Back-Scatter, NIBS). Finalmente, el
correlador es la parte donde se realiza la determinación de las funciones de
autocorrelación y los tiempos de decaimiento consiguientes.
Puedes consultar las ventajas de la tenologı́a NIBS, ası́ como otros de-
talles prácticos de manejo del equipo Zetasizer en los documentos ’Curso
de DLS Zetasizer Nano Series.pdf’ y ’Malvern-Zetasizer-Training course.pdf’
disponibles en el Campus Virtual.
Esta técnica presenta un gran número de ventajas:

• es muy rápida, la medida puede llevar desde segundos a unos pocos

minutos.

• no requiere pretratamiento de la muestra.

• es una técnica no destructiva.

• no es preciso conocer la concentración de la muestra.

8
 B
6

5 90°

A
175° 2

Figura 5: Representación esquemática de los componentes de un equipo de

DLS: fuente de luz láser (1); celda de la muestra (2); detector (3); atenuador
(4); correlador (5); computadora (6). Fuente: Malvern[3].

• require muy poca cantidad de muestra (p.ej., para un látex de 220

nm, la concentración óptima es de ≈ 0,002 % p/v).

Como desventajas, se podrı́an indicar:

• es poco robusta: señales (funciones de autocorrelación) muy similares

pueden conducir a distribuciones de tamaño muy diferentes, dependien-
do del algoritmo de análisis.

• tiene baja resolución (capacidad para distinguir dos poblaciones de

partı́culas de diferente tamaño).

1.2. Dispersión de luz electroforética (Laser Doppler

Electrophoresis, LDE)
Esta técnica también se denomina velocimetrı́a láser de efecto Doppler,
o Laser Doppler Velocimetry. Su finalidad es la medida experimental del
potencial zeta (ζ). El concepto fisicoquı́mico de potencial ζ se presentó en
el Tema 3.

Fundamento de la técnica:
Esta técnica determina la movilidad electroforética de una nanopartı́cula
cargada en relación al disolvente, bajo la influencia de un campo eléctrico
aplicado a la dispersión. Como hemos visto en el Tema 3, la movilidad elec-
troforética es el cociente entre la velocidad de la partı́cula v (m/s en el SI,

9
aunque de forma habitual se emplean las unidades µm/s) y la intensidad del
campo eléctrico (V/m en el SI, aunque habitualmente se emplea V/cm):
v
µe = (µm · cm/V · s) (5)
E
El potencial ζ se calcula a partir de la movilidad electroforética, mediante
la relación teórica:

2ζ · f (κa)
µe = (6)
3µ
donde f (κa) es una función del cociente entre el radio de la partı́cula a y
la longitud de Debye 1/κ:

• si κa  1 entonces f (κa) → 1, 5 (aproximación de Smoluchowski).

• si κa  1 entonces f (κa) → 1 (aproximación de Hückel).

¿Y cómo se determina la movilidad electroforética? La técnica LDE em-

plea el efecto Doppler2 para deducir la velocidad de la partı́cula en el seno
del campo eléctrico. Según el efecto Doppler, la radiación dispersada por un
centro de scattering en movimiento presenta una frecuencia desplazada hacia
valores mayores o menores, dependiendo del sentido de movimiento (hacia
o desde la fuente de radiación, respectivamente). La magnitud del desplaza-
miento de la frecuencia es proporcional a la velocidad relativa de la partı́cula
(respecto a la fuente de luz). Sin embargo, este desplazamiento de la fre-
cuencia es tan pequeño que es necesario emplear un método interferométrico
para medirla. Esto quiere decir que la radiación dispersada se combina con
un haz de referencia (un haz de la fuente de luz original, que no atraviesa
la muestra). El patrón de interferencia entre ambas señales da lugar a una
señal modulada cuya frecuencia es proporcional a la diferencia de frecuencias
entre los haces combinados (y que es mucho más fácil de medir).
Sin embargo, es necesario tener en cuenta que en la celda capilar que
contiene la muestra se crea un fenómeno de electroósmosis cuando se es-
tablece el campo eléctrico entre los electrodos (v. Fig. 6). Las paredes de la
celda capilar llevan una carga superficial, por lo que la aplicación del campo
necesario para observar la electroforesis hace que el lı́quido adyacente a las
paredes experimente un flujo electroosmótico. Sin embargo, en un sistema
cerrado el flujo a lo largo de las paredes debe ser compensado por un flujo
inverso hacia el centro de el capilar. Las partı́culas coloidales estarán sujetas
a este flujo superpuesto a su propia movilidad electroforética. Por lo tanto,
2
https://ca.wikipedia.org/wiki/Efecte Doppler

10
 - - - - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + + + +
Zero electroosmosis

+
Stationary
Layer -
Zero electroosmosis
+ + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - -

Figura 6: Representación esquemática del flujo de disolvente en el interior

de la celda de electroforesis debido al fenómeno de electroósmosis. Fuente:
Malvern [3].

la velocidad neta de movimiento de la partı́cula dependerá de la posición en

la que se enfoque el haz láser para observar su movimiento.
Para eliminar la influencia del flujo electroosmótico, y obtener valores
de la movilidad electroforética realmente independientes de la posición de
medida dentro de la celda, se lleva a cabo la inversión de la polaridad del
campo eléctrico mediante una determinada frecuencia, de tal forma que se
anula prácticamente el flujo del disolvente (v. Fig. 7).
Insignificant fluid flow
Significant fluid flow

- - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + +

+
Stationary
Layer - +
Stationary
Layer -
+ + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - -

Figura 7: Representación esquemática del flujo electroosmótico de disolvente

en el interior de la celda capilar de electroforesis en ausencia (izquierda) y en
presencia (derecha) de la inversión del campo eléctrico. Fuente: Malvern[3].

Análisis de los resultados:

En primer lugar, el signo del potencial ζ permite averiguar el signo de la
carga superficial de las partı́culas (positivo o negativo). Además, tal y como
hemos visto en el Tema 3, el valor absoluto del potencial ζ está relacionado
con el grado de estabilidad frente a la agregación de una dispersión (según
el modelo DLVO). en la Tabla 1 podemos encontrar una clasificación general
de la estabilidad de las dispersiones en función de los valores del potencial ζ.

Montaje experimental:
(V. sección sobre DLS)

11
 Tabla 1: Valores orientativos del potencial ζ

potencial ζ(mV) Estabilidad

entre 0 y ±10 coagulación rápida
entre ±10 y ±30 pobre
entre ±30 y ±40 moderada
entre ±40 y ±60 buena
por encima de ±60 excelente

1.3. Dispersión de luz estática (Static Light Scatte-

ring, SLS)
La SLS es una técnica no destructiva basada en el fenómeno de dispersión
de la luz, que se emplea especialmente para determinar los valores medios
del peso molecular y el tamaño (radio de giro) de coloides liófilos (macro-
moléculas) como polı́meros sintéticos, polisacáridos y proteı́nas. De forma
similar a la DLS, las partı́culas de la muestra son irradiadas con una fuente
de luz monocromática (láser) y la radiación dispersada es registrada a un
valor fijo del ángulo o bien mediante una colección de detectores posiciona-
dos (de forma simultánea o secuencial) a diferentes ángulos (Multi-angle light
scattering, MALS). Sin embargo, a diferencia de la DLS, en la SLS se regis-
tra el promedio temporal de la intensidad dispersada en lugar de sus
fluctuaciones. De esta forma, la intensidad de la luz dispersada a un ángulo
dado se acumula a lo largo de un intervalo de tiempo (digamos, de 10 a 30
s) a diferentes valores de concentración de la concentración de la muestra. El
promediado temporal elimina las fluctuaciones inherentes de la señal, que es
justamente lo contrario que se pretende en la DLS.

Fundamento de la técnica:
Partimos de la teorı́a de Rayleigh de la radiación dispersada (Tema 2),
que es válida para partı́culas mucho más pequeñas que la longitud de onda λ
de la radiación incidente. La ecuación de Rayleigh, aplicada a moléculas (en
lugar de partı́culas sólidas) conduce a la siguiente expresión:
 
Kc 1
= + 2A2 c P (θ) (7)
R(θ, c) Mw
donde:
• R(θ, c) es el cociente entre la intensidad de radiación dispersada Iθ y
la intensidad incidente I (cociente de Rayleigh).

12
 • Mw (g·mol−1 = Da) es el peso molecular medio (promediado en masa).

• A2 (cm3 ·g−1 ·mol−1 ) es el 2º coeficiente del virial, un parámetro

que describe la intensidad de las interacciones entre las partı́culas y el
disolvente.

• c (g·cm−3 ) es la concentración de macromolécula.

• P (θ) es un factor de corrección que expresa la dependencia angular de

la intensidad de scattering (denominado factor de forma).

• K es la constante óptica de la muestra, que se define como:

2
4π 2

dn
K= 4 n0 (8)
λ0 NA dc
siendo:
NA : constante de Avogadro.
λ0 : longitud de onda del láser.
n0 : ı́ndice de refracción del disolvente.
dn/dc: ı́ndice de refracción diferencial (variación en el ı́ndice de refracción
con la concentración). El valor se encuentra tabulado en la bibliografı́a para
muchas combinaciones de muestra y disolvente. En caso contrario, se debe
medir experimentalmente con un refractómetro diferencial.
Generalmente, el valor del cociente de Rayleigh R(θ, c) se mide tomando
el valor de R(θ) del tolueno puro como patrón de referencia.
El factor de forma P (θ) describe cómo depende la intensidad del scat-
tering con el ángulo de observación. Esta dependencia surge a partir de las
interferencias constructivas y destructivas de la luz dispersada a partir de las
diferentes posiciones de la macromolécula (v. Fig.8).
El factor de forma P (θ) depende, por lo tanto, del tamaño y la forma
de las partı́culas. Si el ángulo de scattering es relativamente pequeño, P (θ)
depende exclusivamente del tamaño (y no de la forma). En estas condiciones,
se puede aproximar la ec.7 como:

q 2 Rg2
 
Kc 1
= 1+ + 2A2 c (9)
R(θ, c) Mw 3
Denominada ec. de Zimm. En esta ecuación, Rg (nm) es el radio de giro
de la macromolécula, que es un promedio de la distancia de todos sus átomos
al centro de masas; y q (cm−1 ) es el módulo del vector de scattering, que
depende del ángulo θ:

13
 Destructive
Interference

Constructive
Interference

Figura 8: Representación esquemática de la dependencia de la intensidad

dispersada por una macromolécula con el ángulo de observación. Fuente:
Malvern[3].

 
4πn0 θ
q= sin (10)
λ0 2
El vector de scattering cumple la función de ’regla’ apropiada para medir
las moléculas. La inversa del vector de scattering, que tiene unidades de
longitud, da una idea de las dimensiones moleculares que se pueden medir.
Ası́, en un experimento en el que el disolvente es NaCl 0,1 mol·L−1 en agua
(n = 1,33), con una fuente láser de He-Ne (λ0 = 633 nm), el valor del vector
de scattering va desde 4,2·104 cm−1 a θ = 20◦ hasta 2,4·105 cm−1 a 150◦ y el
valor de q −1 va desde 242 nm (ángulo más bajo) hasta 40 nm (ángulo más
alto).
Observa que, habitualmente, en Light Scattering se emplean las unidades
en el sistema cgs en lugar del SI.

Análisis de los resultados:

La ec. de Zimm (eq. 9) se emplea para obtener el peso molecular medio
Mw , el segundo coeficiente del virial A2 y el radio de giro Rg de las macro-
moléculas. Si se dispone de un solo detector a un ángulo θ fijo, habitualmente
pequeño, y el tamaño de las partı́culas es suficientemente pequeño (Rg  λ0 ),
entonces el factor de forma P (θ) → 1, por lo que se ’pierde’ la dependencia
angular del scattering, y la ec.9 se puede simplificar a:
Kc 1
= + 2A2 c (11)
R(θ, c) Mw
En estas condiciones, la intensidad (normalizada) del scattering es apro-
ximadamente proporcional al producto de Mw y la concentración de macro-

14
molécula. Habitualmente se realizan medidas en una serie de diluciones de
la muestra (como mı́nimo 4 concentraciones diferentes). La representación
gráfica de Kc/Rθ vs. c (a un valor fijo de θ), denominada Debye plot (v.
Fig.9), da una lı́nea aproximadamente recta, a partir de la cual se obtienen:

• Ordenada en origen = 1/Mw .

• Pendiente = 2A2 .

Standard sample
i.e. pure solvent
kC/Rθ - Intensity of scattered light

Gradient
4

3
2

1 Intercept point

0
2 C - concentration

3
Samples 4
of varying
concentration

Figura 9: Esquema del Debye plot para la obtención del peso molecular y el
2º coeficiente del virial a partir de datos de SLS a diferentes concentraciones
y ángulo θ fijo. Fuente: Malvern[3].

Con esta técnica se pueden determinar (idealmente) valores de Mw desde

1kDa hasta 500kDa (polı́meros lineales) o hasta más allá de los 20.000kDa
(polı́meros esféricos y proteı́nas). En sistemas polidispersos, el valor de Mw
es un promedio ponderado en masa.
El valor del 2º coeficiente del virial A2 nos proporciona información acerca
de las interacciones macromolécula/disolvente y, por lo tanto, es útil para
describir la estabilidad y solubilidad de las dispersiones (p.ej. en el caso de
proteı́nas):

• si A2 > 0 las interacciones polı́mero/disolvente son más favorables que

las interacciones polı́mero/polı́mero. Es decir, las interacciones inter-

15
 moleculares entre polı́meros son repulsivas. Por lo tanto, la dispersión
es estable.
• si A2 < 0 las interacciones polı́mero/disolvente son menos favorables
que las interacciones polı́mero/polı́mero. Es decir, las interacciones in-
termoleculares entre polı́meros son atractivas. Por lo tanto, la disper-
sión tiende a ser inestable.
• si A2 = 0 las interacciones polı́mero/disolvente son equivalentes a las
interacciones polı́mero/polı́mero. Es decir, no existe interacción neta
entre polı́meros. La dispersión se comporta como una disolución ideal.
En este caso, se cumple estrictamente que la intensidad del scattering
es proporcional a la concentración.
Idealmente, se busca disponer de varias medidas a diferentes valores del
ángulo θ. Esto se puede lograr, o bien secuencialmente con un detector
de ángulo variable, o bien mediante varios detectores fijos que actúan si-
multáneamente (v. Fig.12). De esta forma, puede evaluarse el factor de forma
P (θ) y, por lo tanto, la dependencia angular del scattering. Ası́, se obtienen
estimaciones más exactas de Mw , ası́ como los valores del radio de giro Rg .
Esto se puede realizar combinando medidas de la intensidad de scattering a
diferentes ángulos y concentraciones, y resolviendo la ec. de Zimm (9) pa-
ra obtener los parámetros correspondientes. Antiguamente, esto se realizaba
mediante una representación denominada Zimm plot (v. Fig.10), pero hoy
en dı́a el software de los equipos se encarga de realizar los cálculos automáti-
camente.
-6
5.0x10 c4
-6 kc3
4.5x10
c3
-6
4.0x10 c2
2
-6 Rg/(3MW ) c1
3.5x10
Kc/R(q,c)

c=0
-6
3.0x10
q=0
-6
2.5x10
-6
2.0x10
-6
2A2kc
1.5x10
-6
1.0x10 1/MW
11 11 11 11 11
0 1x10 2x10 3x10 4x10 5x10
2 -2
q +kc / cm

Figura 10: Zimm plot de los datos de SLS obtenidos a partir de una disolución
hipotética conteniendo polı́mero de Mw = 9, 5 × 105 g/mol y Rg = 95 nm,
con A2 = 10−4 cm3 /(g · mol) 3 . Fuente: Peter Lang (2017)[2].

16
Montaje experimental:
Las caracterı́sticas instrumentales de un equipo de SLS son semejantes a
las del DLS excepto que en este caso no se necesita un correlador.

Figura 11: Esquema del montaje instrumental para la medida de la dispersión

de luz estática. Fuente: Lars Øgendal (2019)[4].

Figura 12: Detector de dispersión de luz estática multiángulo (MALS). Fuen-

te: Postnova4
.

Comparación entre DLS y SLS:

Ambas técnicas son complementarias entre sı́, y a menudo se utilizan en
combinación. La Tabla 2 recoge una comparativa de sus principales carac-
3
el parámetro k no tiene significado fı́sico, es una constante de valor arbitrario empleada
para obtener un espaciado adecuado entre los puntos experimentales
4
https://www.postnova.com/product/modules/pn3000-detectors/
10-pn3621-mals-detector.html

17
terı́sticas.

Información que proporciona: SLS DLS

Peso molecular Mw si no
Radio de giro Rg si no
Segundo coeficiente del virial A2 si no
Forma si no
Radio hidrodinámico Rh no si
Información que requiere: SLS DLS
Concentración en masa c(g/L) si no
Incremento del ı́ndice de refracción dn/dc si no
Viscosidad del disolvente µ no si
Temperatura no si

Tabla 2: Comparativa entre la información requerida y suministrada por las

técnicas de dispersión dinámica y estática de la luz.

1.4. Análisis de rastreo de nanopartı́culas

(Nanoparticle tracking analysis, NTA)
1.5. Técnicas de dispersión de bajo ángulo
(Small angle scattering ): SAXS, SANS
(A completar)

2. Métodos basados en la microscopı́a

Los principios fundamentales del funcionamiento de un microscopio electróni-
co son similares a los de un microscopio óptico convencional. En ambos casos,
la muestra se ilumina mediante una fuente adecuada. La radiación reflejada,
transmitida o dispersada es enfocada y magnificada mediante lentes adecua-
das para producir una imagen aumentada de la muestra.
En la microscopı́a óptica, la iluminación se realiza mediante luz visible
(poli o monocromática) y la magnificación se lleva a cabo con lentes de vidrio.
En cambio, en la microscopı́a electrónica la iluminación se realiza me-
diante un haz de electrones, y la magnificación y focalización mediante lentes
electromagnéticas de geometrı́a adecuada.

18
 La elevada capacidad de resolución (capacidad de discriminar la distancia
entre dos puntos adyacentes) dela microscopı́a electrónica está relacionada
con la naturaleza ondulatoria del electrón.
Según la relación de De Broglie: λ = h/mv. Por lo tanto, la longitud de
onda de una partı́cula es función de la constante de Planck, h, y el producto
de la masa de la partı́cula, m, por su velocidad, v. En el Ejemplo 1 se calcula
la longitud de onda asociada a un electrón.

Ejemplo 1: Longitud de onda asociada al electrón

Un electrón (con carga e = 1,6 × 10−19 C y masa en reposo m =

9,11×10−31 kg) se acelera bajo un voltaje de 10kV. Calculad la longitud
de onda de De Broglie asociada, despreciando efectos relativistas. Dato:
h = 6, 626 · 10−34 J/s.
Solución: s 
h2
λ= = 0, 01 nm
2meV

Teóricamente, el lı́mite de resolución de este tipo de microscopı́a está

determinado por el valor de λ del electrón, que puede ser unas 100.000 veces
inferior (dependiendo del voltaje) a los valores tı́picos de la longitud de onda
de la radiación visible. Por lo tanto, el microscopio electrónico puede resolver
objetos mucho más pequeños que el microscopio óptico. En la práctica, sin
embargo, no es fácil lograr resoluciones por debajo de 1 nm. En la mayor parte
de los instrumentos la limitación es la actuación de las lentes magnéticas y
el logro de unos campos magnéticos estables.
El haz de electrones (paralelo o convergente) puede ser estático e inciden-
te a lo largo de una dirección fija, o puede escanearse a través de la muestra.
El primer caso es la base de la microscopı́a electrónica de transmi-
sión (TEM), mientras que el segundo forma la base para la microscopı́a
electrónica de barrido (SEM).
En en cualquier caso, para evitar colisiones entre electrones del haz y
las moléculas de gas, se requiere mantener un alto vacı́o en todas las áreas
funcionales del microscopio electrónico (a la presión atmósferica, las colisiones
entre los electrones y el gas casi detendrı́an el haz de electrones tras una
trayectoria del orden de unos pocos milı́metros). Un alto vacı́o de alrededor
de 10−4 torr es adecuado para mantener un camino libre medio (sin colisiones
con las moléculas de gas) de unos 2,5 m, que se considera suficiente para la
mayorı́a de los microscopios electrónicos.
Hoy en dı́a es posible alcanzar grandes aumentos y resoluciones con los
modernos microscopios electrónicos disponibles comercialmente (de hasta 0,2

19
nm). Sin embargo, estas altas resoluciones tienen la contrapartida de unas
áreas de muestreo más estrechas. En otra palabras, cuanto mayor es la re-
solución, más estrecha es la región que se puede observar. Por lo tanto, las
imágenes obtenidas por microscopı́a electrónica pueden no representar es-
tadı́sticamente toda la muestra de interés. Las siguientes secciones presentan
descripciones breves de los componentes y procedimientos esenciales de la
microscopı́a electrónica.

2.1. Microscopı́a electrónica de transmisión

(Transmission Electron Microscopy, TEM)
En la TEM convencional, que emplea un haz estacionario de electrones, la
imágen se produce principalmente debido a fenómenos locales de difracción.
En la Fig.13 se esquematiza un aparato tı́pico. Los componentes principales
de un equipo TEM son:

• un sistema de vacı́o.

• un sistema de iluminación (fuente de electrones).

• un sistema portamuestras (specimen stage).

• un sistema de lentes electromagnéticas.

• un sistema de magnificación.

• un sistema de registro de imágen.

• un sistema de análisis quı́mico.

La muestra a estudiar se sitúa entre la fuente productora de electrones y

el sistema de registro de imágenes.
El sistema de iluminación consiste en un haz de electrones (usualmente
paralelo) que se hace incidir sobre la muestra. Este haz se genera a partir de
un cañón de electrones, que consiste en la emisión termo-iónica de electrones
a partir de un cátodo de tungsteno calentado (C) y que se aceleran hacia
una apertura A situada en el ánodo.
Entonces, la lente electromagnética L1 focaliza el haz y este pasa a través
de la muestra que está situada sobre una parrilla o ’grid ’ G. El grid está
hecho de Cu, Mo, Au o Pt, y tiene unos 3 mm de diámetro y alrededor
de 100 µm de espesor. Parte de los electrones es absorbida o dispersada de
manera proporcional a la densidad electrónica de las diferentes partes de la
muestra, y el resto pasa a través del grid.

20
 Una lente objetivo electromagnética, L2, colecta los electrones transmi-
tidos y magnifica la imagen del espécimen de diez a veinte veces en el plano
objeto de un sistema proyector de lentes magnéticas (L3), que produce un
incremento de cincuenta a cuatrocientas veces, ya que la lente proyecta los
electrones en una pantalla fluorescente, S. En la pantalla la imagen se visuali-
za directamente, se fotografı́a en una pelı́cula fotográfica de grano fino (lo que
puede incrementar el tamaño de cinco a diez veces) o se registra mediante un
sensor fotográfico digital (CCD, CMOS, etc.), que puede proporcionar una
resolución y aumento todavı́a mayores, además de la posibilidad de análisis
digital mediante un computador.
A partir de todo lo expuesto se puede concluir que el aumento global está
comprendido entre 100x y 1.000.000x. Como el ojo humano puede discriminar
entre puntos separados 0,2 mm, el lı́mite inferior de observación es, entonces,
desde 2 micras hasta 0,4 nm, si bien ciertos procedimientos especializados
pueden resolver, en los casos más favorables, prácticamente los átomos in-
dividuales (0,2 nm). Para ello se requiere una estabilidad excepcionalmente
alta de la corriente eléctrica en el sistema de lentes electromagnéticas.
Finalmente, el equipo incluye un sistema de análisis quı́mico, consisten-
te en un espectrómetro de Fluorescencia de rayos X por energı́a dispersiva
(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy, EDS), y/o un sistema de Es-
pectroscopia de pérdida de energı́a de electrones (Electron Energy Loss
Spectroscopy, EELS). Estos equipos miden la energı́a cinética perdida por
los electrones dispersados por la muestra debido a que el haz incidente pue-
de arrancar electrones de los orbitales atómicos más internos de la muestra
(EELS), o bien la energı́a (frecuencia) de los fotones de rayos X generados
por el haz incidente cuando promueve transiciones entre electrones de los or-
bitales atómicos de la muestra (EDS). En ambos casos, el espectro obtenido
permite deducir información acerca de la composición quı́mica de la super-
ficie de la muestra (’surface chemical mapping’) y, en ocasiones, el tipo de
enlace quı́mico o incluso el espesor de la muestra.

2.1.1. Preparación de la muestra

La preparación de especı́menes para su observación por TEM puede ser
muy laboriosa.
En TEM, los electrones del haz incidente viajan esencialmente a través
del material antes de incidir sobre la pantalla, sensor CCD o placa fotográfi-
ca empleada para formar la imagen final. Por lo tanto, la muestra debe ser
”transparente a los electrones”. En otras palabras, la muestra debe ser extre-
madamente delgada para que los electrones la puedan atravesar, idealmente
por debajo de los 100 nm de espesor, en equipos convencionales, aunque esto

21
 C

L1

L2

L3

Figura 13: Diagrama esquemático de un microscopio electrónico de transmi-

sión. Fuente: Estelrich, 2002 [1].

depende también de la composición de la muestra: la absorción y dispersión

de electrones aumenta de forma aproximadamente proporcional al cuadrado
del número atómico Z. Aunque este requisito se vuelve menos estricto si se
utiliza un voltaje más alto para la aceleración de electrones. En la actualidad,
existen equipos de TEM que utilizan voltajes entre 120 y 300 kV.
Los materiales que tienen dimensiones lo suficientemente pequeñas co-
mo para ser transparentes a los electrones, como nanomateriales en polvo,
organismos pequeños, virus etc., se pueden preparar rápidamente mediante
la deposición de una muestra diluida que contiene la muestra en forma de
pelı́culas delgadas sobre las rejillas de soporte (grids), y la posterior evapo-
ración del disolvente. Las muestras biológicas se pueden incrustar en resina
epoxi para resistir el alto vacı́o en la cámara de muestra y para permitir

22
cortar tejido en secciones delgadas transparentes a los electrones. Para esto
último se emplean los denominados ultramicrotomos5 , que utilizan cuchi-
llas de diamante de alta precisión para obtener secciones ultrafinas de un
espesor por debajo de los 100 nm, con una deformación mı́nima.
En el caso de las nanopartı́culas, éstas deben distribuirse de forma regular
y espaciada en la cuadrı́cula del grid para obtener una imagen clara.
Las muestras TEM de nanomateriales orgánicos y tejidos biológicos nece-
sitan tinciones con sales de elementos de alto número atómico para mejorar
el contraste. El compuesto de tinción absorbe o dispersa eficazmente los elec-
trones del haz que, de lo contrario, se proyectarı́an directamente sobre el
sistema de registro de imagen. Para ello, se usan compuestos de metales pe-
sados como osmio (tetróxido de osmio), plomo, uranio (acetato de uranilo) u
oro (en el marcaje inmunológico) antes de la observación TEM para deposi-
tar selectivamente átomos densos en electrones sobre la muestra o de forma
especı́fica en regiones celulares o proteicas deseadas. Este proceso requiere
una comprensión de cómo los iones metálicos se unen a tejidos biológicos
especı́ficos y estructuras celulares.
Sin embargo, es necesario tener precaución al interpretar las imágenes
obtenidas mediante los procedimientos de tinción. Es probable que el proce-
dimiento de tinción y secado afecte la estructura y morfologı́a de la mues-
tra. Podrı́an tener lugar fenómenos de contracción, colapso de la estructura,
modificación dimensional de las estructuras, agregación de las partı́culas co-
loidales, y/o aplanamiento de la muestra durante el secado, obteniendo una
imagen distorsionada de la muestra original.

2.1.2. Variantes de la TEM convencional

En los casos en los que se sospecha que la preparación de la muestra puede
alterar significativamente su morfologı́a, se recurre a las técnicas criogéni-
cas de microscopı́a electrónica (Cryo-TEM)6 .
Básicamente, la Cryo-TEM utiliza un TEM con un portaobjetos capaz de
enfriar muy rápidamente la muestra a temperaturas de nitrógeno lı́quido o
helio lı́quido. Esto permite obtener imágenes de muestras preparadas en hielo
vı́treo (no cristalino), de forma que la muestra conserva toda la integridad
morfológica de su estado hidratado nativo. Esta es la técnica de preparación
preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o conjuntos ma-
cromoleculares, obtener imágenes de interfases vitrificadas sólido-electrolito,
y materiales que son volátiles en alto vacı́o a temperatura ambiente, como el
azufre.
5
https://en.wikipedia.org/wiki/Microtome
6
https://en.wikipedia.org/wiki/Transmission electron cryomicroscopy

23
 Si bien el desarrollo de la técnica comenzó en la década de 1970, los
avances recientes en tecnologı́a de detectores y algoritmos de software han
permitido la determinación de estructuras biomoleculares con una resolución
casi atómica. Esto ha atraı́do una gran atención hacia la Cryo-TEM como
una alternativa a la cristalografı́a de rayos X o la espectroscopia de RMN para
la determinación de la estructura macromolecular (p.ej., de proteı́nas) sin la
necesidad de cristalización (un proceso largo y laborioso que puede emplear
varios meses, o incluso no ser factible en el caso de muchas proteı́nas).
En 2017, el Premio Nobel de Quı́mica fue otorgado a Jacques Dubo-
chet, Joachim Frank y Richard Henderson ”por desarrollar microscopı́a crio-
electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de bio-
moléculas en solución”. De hecho, la revista Nature Methods denominó la
Cryo-TEM como el ’Método del año’ en 2015.
En el Campus Virtual (Carpeta ’Microscopı́a electrónica’ puedes encon-
trar dos artı́culos breves de Nature al respecto).
Finalmente, hay que señalar que, aunque la TEM clásica es una técnica
diseñada para obtener imágenes en 2D, en la actualidad existen variantes que
permiten obtener imágenes en 3D (tomografı́a). Para ello se emplean por-
tamuestras que permiten la rotación de una muestra en un ángulo deseado,
con lo que se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra girando
el ángulo de la muestra a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar
varias imágenes de una sola muestra de TEM en diferentes ángulos, nor-
malmente en incrementos de 1◦ , se puede recopilar un conjunto de imágenes
conocido como ”serie de inclinación”. En condiciones ideales, este conjunto
de imágenes se puede utilizar para construir (mediante software) una re-
presentación tridimensional de la muestra. Alternativamente, el análisis de
secciones adyacentes obtenidas mediante ultramicrotomo y su reconstrucción
digital posterior, también permite obtener imágenes en 3D.

2.2. Microscopı́a electrónica de barrido (Scanning Elec-

tron Microscopy, SEM)
La microscopı́a electrónica de transmisión está limitada en cuanto a su
capacidad de mostrar la forma de las partı́culas, ya que generalmente se
obtiene una proyección de las mismas en 2D. La microscopı́a electrónica
de barrido, en cambio, puede proporcionar un tipo de imágenes que el ojo
interpreta como tridimensionales (Fig 14).

24
 Figura 14: Imagen SEM de un ciliado de agua dulce. Fuente: 7 .

Puedes ver un corto vı́deo explicativo del fundamento de la técnica en el si-

guiente link: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Scanning Electron
Microscope.ogv. También he colgado otro vı́deo más detallado en el Cam-
pus Virtual.

2.2.1. Fundamento de la técnica: Generación de la señal

En la microscopı́a SEM, en lugar de registrar la imágen formada por los
electrones que ’atraviesan’ la muestra, se registran los electrones ’reflejados’
por la superficie de la misma. Concretamente, el haz incidente de electrones
(que forma un cierto ángulo con la muestra) es colimado y enfocado en un
pequeño punto (≈ 5-10 nm) que se desplazará por encima de la superficie
de la muestra, recubierta previamente por una capa (≈ 20 nm de espesor)
de oro o de un metal pesado (que aumenta la reflexión de los electrones).
Cuando el haz incide sobre el metal, penetra hasta una cierta distancia bajo
la superficie. La profundidad de penetración depende de la naturaleza del
material, la energı́a del haz incidente de electrones (electrones primarios),
y el ángulo de incidencia. Cuando los electrones primarios inciden sobre el
material, se producen diferentes tipos de interacciones:

• dispersión elástica (elastic scattering): electrones que ’rebotan’ en

el material y retornan a través de la superficie conservando su energı́a
cinética, a través del vació hacia el detector correspondiente. Estos
electrones se denominan ’backscattered ’. Tienen energı́as cinéticas rela-
tivamente elevadas y, por lo tanto, pueden penetrar más profundamente
en la capa superficial de la muestra.
7
http://www.science.smith.edu/cmi/images/scanning-electron-microscopy-gallery/

25
 • dispersión inelástica (inelastic scattering): los electrones primarios
interactúan con la corteza electrónica de los átomos del material exci-
tando electrones de sus orbitales, que son reemitidos como electrones
secundarios, con una energı́a cinética menor (por debajo de los 50 eV).
Debido a su menor energı́a, sólo los electrones más cercanos a la super-
ficie consiguen salir al vacı́o exterior y alcanzar el detector especı́fico
correspondiente.

• también se emiten rayos X, como consecuencia de las interacciones

de los electrones primarios con los átomos del material: las sucesivas
excitaciones y relajaciones provocan la emisión de fotones en esta lon-
gitud de onda caracterı́stica. Esta señal se emplea en microanálisis por
Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDS) para mapear la
distribución y abundancia relativa de los diferentes elementos quı́micos
de la superficie de la muestra.
Los distintos mecanismos de interacción del haz de electrones de la fuente
con la superficie del material, se muestran en la Fig. 15.
PE SE

PE BSE

PE SE
Characteristic
X-ray

Figura 15: Diferentes tipos de interacción electrón-material y mecanismos

de emisión de electrones secundarios (SE), electrones ’backscattered ’(BSE) y
rayos X caracterı́sticos a partir de los átomos de la muestra irradiados con
los electrones primarios (PE). Fuente: Wikipedia8 .

8
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Electron-matter interaction volume and
various types of signal generated - v2.svg
8
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Electron emission mechanisms.svg

26
 Como se ha mencionado arriba, cada tipo de señal es registrada por un
detector especı́fico. A partir de la relación existente entre el número de elec-
trones emitidos (o rebotados) y el ángulo del haz incidente hacia la superficie,
la imagen formada por los electrones recolectados tiene una apariencia tridi-
mensional.
Con un microscopio SEM se puede lograr una profundidad de campo
muy grande (de trescientas a quinientas veces la que se obtiene con un
microscopio óptico de los mismos aumentos). Sin embargo, el lı́mite de reso-
lución (≈ 3 nm) es unas diez veces superior (menos ’fino’) que el obtenido con
la microscopı́a electrónica de transmisión, aunque depende del tamaño del
rayo explorador y de la velocidad de exploración del objeto (cuanto menores
sean el diámetro del haz y la velocidad de barrido, mayor resolución).

Electron gun

Electron beam

First condenser lens

Spray aperture

Second condenser lens

X-ray detector
Deflection coils
Objective lens
Final lens aperture

Backscatter
electron detector
Sample

Secondary
Vacuum pump electron detector

Figura 16: Diagrama de un microscopio electrónico de barrido. Fuente: Wi-

kipedia9 .

Los microscopios electrónicos no producen imágenes en color de for-

ma natural, ya que un SEM produce un solo valor por pı́xel: este valor
corresponde al número de electrones recibidos por el detector durante un
pequeño perı́odo de tiempo de exploración cuando el haz se dirige a la posi-
ción del pı́xel (x, y). Este número único suele estar representado, para cada
pı́xel, por un nivel de gris, formando una imagen .en blanco y negro”. Sin
embargo, con mucha frecuencia, las imágenes SEM publicadas se colorean
artificialmente. Esto se puede hacer por un efecto estético, para aclarar la
estructura o para agregar una apariencia realista a la imagen aunque ge-
neralmente no aporta información sobre la muestra. La coloración se puede
9
https://en.wikipedia.org/wiki/Scanning electron microscope#/media/File:
Schema MEB (en).svg

27
realizar manualmente o semiautomáticamente con un software de edición
fotográfica adecuado. También se pueden obtener imágenes coloreadas di-
rectamente en el instrumento SEM al combinar (superponer) las imágenes
obtenidas simultáneamente mediante los detectores de electrones secundarios
y ’backscattered’. De esta forma se obtienen imágenes que mantienen la in-
formación topográfica de la muestra, y la combinan con información acerca
de la densidad local del material, proporcionada por un código de color. Esta
variante se denomina ’density-dependent color SEM’ (DDC-SEM).

Detalles instrumentales:
El esquema instrumental de un microscopio SEM es muy semejante al
TEM (v. Fig.16). Las principales diferencias entre ambos están en que el SEM
contiene una bobina deflectora (’deflection coil ’), en el tipo y localización de
los detectores (de electrones ’backscattered’, de electrones secundarios y de
rayos X) y en la energı́a del haz primario de electrones (que suele ser del
orden de ∼5-30 keV, frente a los ∼100-300 keV tı́picos del TEM). La bobina
deflectora se emplea para dirigir el haz primaro de electrones y realizar el
’barrido’ o ’escaneo’ de la superficie de la muestra en el plano x-y.

2.2.2. Preparación de la muestra

Las muestras de SEM deben ser lo suficientemente pequeñas para caber
en la platina portaobjetos y pueden necesitar una preparación especial para
aumentar su conductividad eléctrica y estabilizarlas, de modo que puedan
resistir las condiciones de alto vacı́o y el haz de electrones de alta energı́a. Las
muestras generalmente se montan rı́gidamente en el portamuestras usando
un adhesivo conductor.
Las muestras no conductoras acumulan carga negativa cuando son esca-
neadas por el haz de electrones y, especialmente en el modo de imagen de
electrones secundarios, esto causa fallos de escaneo y otros artefactos de ima-
gen. Para obtener imágenes convencionales en el SEM, las muestras deben ser
conductoras de la electricidad, al menos en la superficie, y estar conectadas
a tierra para evitar la acumulación de carga electrostática.
Los objetos metálicos requieren poca preparación especial para SEM, ex-
cepto por la limpieza y el montaje conductivo en el portamuestras. Los mate-
riales no conductores se recubren normalmente con un revestimiento ultrafino
de material conductor de la electricidad, que se deposita sobre la muestra
mediante un revestimiento por pulverización catódica a bajo vacı́o (’sputter
coating’10 ) o por evaporación a alto vacı́o (v. Fig.17). Los materiales conduc-
10
https://en.wikipedia.org/wiki/Sputter deposition#Sputter coating

28
tores que se utilizan actualmente para el recubrimiento de muestras incluyen
oro, aleación de oro / paladio, platino, iridio, tungsteno, cromo, osmio y
grafito. El recubrimiento con metales pesados puede aumentar la relación
señal/ruido para muestras de bajo número atómico (Z). Esto se debe a que
los materiales con alto valor de Z tienen una mayor emisión de electrones se-
cundarios. Una alternativa al recubrimiento para algunas muestras biológicas
es aumentar la conductividad general del material mediante la impregnación
(tintado) con sales de osmio.

Figura 17: Una araña recubierta de oro para prepararla como muestra para
microscopı́a electrónica de barrido. Fuente: Wikipedia11 .

También se pueden obtener imágenes de muestras no conductoras sin re-

cubrimiento utilizando la variante denominada ’Environmental SEM’ (ESEM)
o un modo de funcionamiento SEM de bajo voltaje. En los instrumentos
ESEM, la muestra se coloca en una cámara de presión relativamente alta y
la columna óptica de electrones se bombea diferencialmente para mantener
el vacı́o adecuadamente bajo en el cañón de electrones.
Si el SEM está equipado con una platina frı́a para microscopı́a criogénica,
se puede utilizar la criofijación y realizar microscopı́a electrónica de barrido a
baja temperatura en las muestras fijadas criogénicamente. Las muestras crio-
fijadas pueden crio-fracturarse al vacı́o en un aparato especial para revelar
la estructura interna, recubrirse por pulverización catódica y transferirse a
la platina criogénica SEM mientras aún están congeladas. La microscopı́a
electrónica de barrido de baja temperatura (LT-SEM) también es aplicable
a la obtención de imágenes de materiales sensibles a la temperatura como el
hielo y las grasas.
11
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gold Spider SEM sample.jpg

29
2.3. Microscopı́a de fuerza atómica (AFM)
La microscopı́a de fuerza atómica es una microscopı́a de barrido que per-
mite hacer un estudio cuidadoso de la superficie de la muestra estudiada.
Es uno de los métodos de observación superficial con mayor poder de re-
solución, ya que permite conseguir imágenes a escala atómica. Se trata de
un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los
nanonewtons.

Figura 18: Imagen de un cantilever de AFM obtenida por microscopı́a

electrónica de barrido. Fuente: Wikipedia12 .

La microscopı́a de fuerza atómica rastrea la superficie de la muestra con

una sonda o punta afilada de forma piramidal o cónica, de un par de micras
de longitud y menos de 10 nm de diámetro. La punta se encuentra localizada
en el extremo libre de un soporte o micropalanca (’cantilever ’), muy flexible,
de unas 100-200 micras de largo (Fig.18).
Mientras la punta va sondeando de forma continua la superficie de la
muestra (o la muestra se hace mover bajo el punzón), el apoyo experimenta
unas flexiones, que dependen de la fuerza de interacción entre la superficie de
la muestra y la punta. Esta flexión es medida por un detector y estas medidas
permiten a un ordenador reconstruir imágenes de la topografı́a superficial de
la muestra (Fig.19).
La fuerza de interacción es muy débil, generalmente inferior a 10−9 N.
El sistema de detección no mide la fuerza directamente, sino la deflexión del
soporte. Aunque se han utilizado sistemas interferométrico a base de fibra
óptica, el sistema detector de la deflexión más generalizado es el de la reflexión
del haz luminoso. Este sistema que está formado por un diodo láser que emite
un rayo de luz sobre la superficie reflectora del soporte (’cantilever’). El haz
reflejado llega a un fotodetector sensible a la posición. En este arreglo, una
12
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:AFM (used) cantilever in Scanning
Electron Microscope, magnification 1000x.JPG

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Figura 19: Diagrama esquemático de un microscopio de fuerza atómica. El
escaner piezoeléctrico desplaza la muestra bajo el punzón. Fuente:[1].

pequeña deflexión del soporte producirá un cambio importante en el haz

reflejado y cambiará la posición en la que el haz incide en el detector.
Varias fuerzas contribuyen a la flexión del soporte, pero las más impor-
tantes son las fuerzas de Van der Waals, que son atractivas y se dan a dis-
tancias pequeñas entre punzón y muestra, y las fuerzas repulsivas de Born,
que actúan a distancias extremadamente pequeñas.
Según cuál sea la distancia entre punzón y muestra se tienen tres tipos
de interacciones, que dan lugar a tres maneras de hacer la medida en AFM
(Fig.20):
• En contacto (’contact mode’): hay un contacto permanente entre
muestra y punzón (distancia de separación de unas pocas décimas de
nm). Las flexiones son debidas a la repulsión de los electrones corres-
pondientes (fuerzas de Born). V. Fig.21.
• Intermitente (’tapping mode’): el punzón oscila tocando la muestra
dos veces en cada perı́odo. Es muy útil en muestras lı́quidas, que de
esta manera no son arrastradas por el punzón.
• Sin contacto (’non-contact mode’): el punzón se mantiene separado
de la muestra por una distancia que puede ser de decenas de nm. En

31
 estas condiciones las fuerzas que actúan son las atractivas de Van der
Waals.

Figura 20: Modos de operación en AFM: (a) contacto; (b) sin contacto; (c)
’tapping mode’. Fuente: Wikipedia13 .

Podéis encontrar un breve vı́deo explicativo del funcionamiento de la

técnica en el siguiente link.
La microscopı́a de fuerza atómica presenta múltiples ventajas respecto a
otros tipos de microscopı́a: permite la observación directa de la muestra sin
necesidad de fijarla o inactivarla (p.ej. por deshidratación), con los incon-
venientes biológicos que ello implica; las muestras pueden observarse en los
fluidos biológicos correspondientes; se pueden medir las fuerzas interactivas
a nanoescala, etc.

Figura 21: Barrido topográfico de una superficie de vidrio obtenido mediante

AFM (en modo contacto), donde se puede observar la rugosidad del material.
Fuente: Wikipedia14 .

13
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Afm modes 12-10.svg
14
https://en.wikipedia.org/wiki/Atomic force microscopy#/media/File:
AFMimageRoughGlass20x20.JPG

32
3. Métodos de determinación del área super-
ficial especı́fica
4. Técnicas de fraccionamiento y purificación
(pendiente)

Bibliografı́a
[1] Joan Estelrich. Dispersions col · loı̈dals. Edicions Universitat de Barce-
lona, 2002, págs. 205-206. isbn: 8483383454.
[2] Peter Lang. Scattering Methods: Basic Principles and Application to
Polymer and Colloidal Solutions. Inf. téc. 2017. url: https://www.fz-
juelich.de/SharedDocs/Downloads/IBI/IBI- 4/EN/Lang%7B%5C %
7D002.pdf?%7B%5C %7D%7B%5C %7Dblob=publicationFile.
[3] Malvern Instruments Ltd. Size theory. 2013.
[4] Lars Øgendal. Light Scattering: a brief introduction. Inf. téc. 2019. url:
https://www.nbi.dk/%7B∼ %7Dogendal/personal/lho/LS%7B%5C %
7Dbrief%7B%5C %7Dintro.pdf.

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