TECNOLOGICO NACIONAL DE MEXICO
COMITANCILLO
ESTUDIENTE:
MARVIN YAHIR DOLORES DE JESUS
ASESOR:
ING. EDGARDO HERNANDEZ TOLEDO
UNIDAD DE CONTENIDO:
BIOLOGIA CELULAR
TRABAJO:
Desarrollo del tema 5.- Técnicas de estudios de la célula.
SUPTEMAS:
5.1 Microscopia:
5.2 Métodos citoquímicos.
5.3 Métodos histológicos.
5.4 Fraccionamiento del contenido celular.
5.5 Marcaje de moléculas celulares.
GRUPO:
1 AB
FECHA:
08 DE OCTUBRE DE 2021
NUMERO DE CONTROL:
21710071
5.- Técnicas de estudios de la célula.
Desarrollamiento del tema
5.1 Microscopia:
Se define la microscopía como la observación de objetos muy pequeños bajo grandes
aumentos. Los aparatos que se usan para ello se denominan microscopios. En la
medicina se usan la microscopía especialmente para analizar tejidos, células,
componentes sanguíneos y microorganismos. Normalmente hay varios trabajos que
preceden la observación de un material bajo el microscopio (p.e. cortes, técnicas de
color) que permiten una mejor observación, como puede ser la estructura de una
célula. Los microscopios convencionales, microscopía de luz, se consigue un gran
aumento del objeto a investigar a través de un procedimiento de proyección en dos
niveles. En este tipo de microscopía el microscopio produce primeramente una imagen
invertida real aumentada del objeto iluminado mediante el objetivo. En un segundo
paso se aumenta nuevamente esta imagen mediante el ocular. Los aumentos parciales
del objetivo y el ocular producen el aumento total. Cuando se requiere un gran
aumento, o cuando se analizan objetos muy pequeños, se usa un objetivo de
inmersión. Además, se suele aplicar una gota de aceite sobre el objeto a investigar
para rellenar el espacio entre el objeto y el objetivo, lo que optimiza la capacidad de
resolución.
5.2 Métodos citoquímicos.
El objetivo de estos métodos es la localización e identificación de las sustancias
químicas constituyentes de las células, para lo cual hay dos líneas de investigación:
·Obtención de fracciones subcelulares y su posterior análisis bioquímico,
·Determinación de diferentes compuestos químicos en el interior de la célula.
Técnica citoquímica
Las células y los tejidos están constituidas por proteínas, carbohidratos y otros
componentes, los cuales se encuentran formando parte de la estructura de los mismos.
Estas sustancias son químicamente activas, es decir, que en determinadas condiciones
es posible hacerlas reaccionar con otros compuestos.
Esta capacidad de reacción es el principio en que se basan las técnicas citoquímicas e
histoquímicas para la demostración, en las células y en los tejidos, de un compuesto o
sustancia, o para la determinar la actividad de una enzima, o complejos enzimáticos
celulares e hísticos.
El producto de estas reacciones son compuestos coloreados visibles al micros-copio
óptico, o de alta densidad para su visualización al microscopio electrónico; por ejemplo,
la demostración de lípidos acumulados intracelularmente en algunas patologías, o la
demostración de lípidos que forman parte de estructuras celulares, se puede llevar a
efecto mediante diversas técnicas con substancias que reaccionan con las grasas; uno
de estos es el tetraóxido de osmio, que reacciona con los lípidos no saturados, y da un
compuesto de color negro que puede distinguirse tanto al microscopio óptico como al
microscopio electrónico debido a su alta densidad.
En otras ocasiones, es posible, mediante esta técnica, demostrar la presencia o
ausencia de un orgánulo celular. Las células objeto de estudio se ponen en contacto
con sustratos específicos que reaccionarán con los componentes químicos de un
orgánulo dado, así dando coloración al M/O. Estas técnicas brindan una información de
la composición química celular, así como de sus elementos estructurales y su
localización.
Técnica inmunohistoquímica
Determinadas células de organismos superiores tienen la capacidad de responder ante
sustancias extrañas, antígenos, sintetizando otros compuestos llamados anticuerpos.
La técnica inmunohistoquímica se basa en el reconocimiento del antígeno por un
anticuerpo que previamente se ha conjugado con un fluorocromo, una enzima o un
coloide de un metal pesado (por ejemplo, el oro).
Al conjugarse con estos compuestos, los anticuerpos pueden reconocer en el tejido o
en la célula, los componentes antigénicos contra los cual fueron desarrollados,
poniendo así de manifiesto la localización o presencia de aquellas estructuras objetos
del estudio, mediante reacciones químicas o a través de microscopios especializados
(microscopios de fluorescencia y electrónico). Si se emplea un microscopio de
fluorescencia, el marcador será un fluorocromo, los cuales emiten fluorescencia al ser
excitados por la luz ultravioleta; si la reacción antígeno-anticuerpo se evidencia
mediante una enzima se hace necesario el empleo del sustrato de esta, además de
una sustancia que proporcione un color determinado o un precipitado que pueda ser
distinguido en un microscopio óptico de campo brillante o con una técnica adecuada al
microscopio electrónico.
5.3 Métodos histológicos.
Obtención del material histológico
Los tejidos se pueden obtener de diferentes formas:
Biopsia- Biopsia excisional - Biopsia incisional - Biopsía endoscópica -
Biopsia colposcópica - Punción aspiración con aguja fina (PAAF) - Biopsia
por punción con aguja gruesa (Tru-cut)
Necropsia/autopsia
En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora, generalmente
líquida, para evitar los cambios post-mortem y para lograr conservar la forma original
del tejido. Uno de los fijadores más usado es el formol al 10% (formaldehído). En el
caso de que realicemos estudios mediante el microscopio electrónico, deberemos usar
otros fijadores más específicos como paraformaldehido, glutaraldehido y tetróxido de
osmio.
Lavados
Se debe lavar el tejido para quitar el exceso de fijador (químico). El exceso de fijador
durante el posterior proceso de infiltración, incluso en la Microtomía, podría afectar
los cortes histológicos, y por ello se debe lavar con agua destilada.
Deshidratación
La deshidratación se realiza empleando diferentes soluciones de alcohol a
concentraciones crecientes hasta llegar a alcohol puro. La técnica de la parafina, para
cortar fácilmente.
Aclaramiento
En este paso se sustituye el alcohol por una sustancia que haga de intermediario entre
el agua y la parafina que se usará posteriormente para la infiltración. La sustancia
comúnmente utilizada es el xilol (xileno) aunque también pueden usarse otros
disolventes orgánicos como benceno. Tras varios años, se consigue eliminar el alcohol
puro y todo el tejido queda impregnado del xilol, el cual habrá entrado hasta lo más
profundo del tejido. Durante este proceso el tejido pierde color dando lugar al término
de aclaramiento.
Infiltración
La muestra se coloca en parafina histológica en estado líquido, lo cual se consigue
calentando la parafina por encima de su punto de fusión. Como se ha dicho en el paso
anterior el tejido está completamente impregnado de xilol que es un disolvente de la
parafina, por lo que tras varios años con concentración creciente de parafina se
consigue embeber todo el tejido en parafina pura.
La deshidratación, aclaramiento e infiltración pueden ser realizadas manualmente pero
hoy en día se realizan de modo automático en máquinas específicas.
Inclusión
Tiene como finalidad proporcionarle al tejido un soporte sólido que posibilite realizar un
corte muy fino, por lo que es de suma importancia que el medio utilizado para la
inclusión penetre al interior del tejido. Aquí se forman bloques de parafina dentro de los
cuales están las muestras a estudiar. También hay máquinas especializadas para la
inclusión en parafina de tejidos. Después de su inclusión y posterior secado, estos se
deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte. Puede llevarse a cabo
en Parafina
Microtomía
Se realizan cortes histológicos muy delgados según lo requerido o la costumbre del
laboratorio donde se realice la técnica. Los cortes van desde 0,5 micras hasta 8 u 10
micras. Los cortes se echan al baño de flotación y se ´pescan´ con un portaobjetos, se
marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tinción con que se van a procesar. El ángulo
de corte entre el cuchillo del microtomo y el bloque ha de estar entre 10º y 15º. Una vez
realizado el corte se da un baño de agua destilada, para que la parafina se estire. Un
buen corte histológico debe tener un grosor aproximado de 3-5 micras para que sea
fácilmente atravesado por la luz del sol y atraviese los poros celulares.
Tinción
Las células, por sí mismas, no poseen coloración. Por tanto, para poder observar la
morfología tisular deben "teñirse". Existen muchos tipos de tinciones para diferenciar
las distintas estructuras o sustancias en los tejidos.
La tinción más usada o también llamada "de rutina" es la
de hematoxilina y eosina (H&E). Se usa un colorante llamado hematoxilina que tiñe las
sustancias ácidas o que las contengan, como el núcleo que contiene ácido
desoxirribonucleico (ADN) La eosina amarillenta tiñe las estructuras básicas como
el citoplasma y demás orgánulos eosinofílicos de la célula.
Como se mencionó anteriormente hay muchas tinciones . Otros ejemplos son:
Masson
PAS
Perls
Plata metenamina
Warthin-Starry
Ziehl-Neelsen
Van Gieson
Azul alcian
Sudan III
Rojo Congo
Observación
Como se mencionó al principio algunos autores no consideran la observación como un
paso de la técnica histológica sino el objetivo final de la misma. Como se puede
deducir, se observa la laminilla al microscopio y se busca lo que se necesite ver para
llegar a un diagnóstico.
La técnica histológica es muy empleada en laboratorios y hospitales. Permite hacer
diagnósticos de distintas enfermedades, como para saber si un tumor es maligno o
benigno, etc.
5.4 Fraccionamiento del contenido celular.
Paso 1.- romper sus células:
Para acceder al contenido dentro de algo, debes abrirlo. Las células no son
diferentes. Los detergentes permiten abrir la membrana celular para poder obtener
el contenido dentro de la célula. Los detergentes alteran las membranas celulares
porque pueden interactuar tanto con las membranas como con partes de la célula
que son solubles en agua. Dado que los detergentes pueden interactuar con partes
lipídicas (membrana) y solubles (citoplasmáticas) de la célula, permiten que los
componentes celulares se mezclen u homogeneicen. Cuando los componentes
celulares se mezclan, se forma un homogeneizado celular o lisado celular. De
hecho, la razón por la que los detergentes y jabones eliminan el aceite y la grasa es
porque permiten que las cosas que normalmente no se mezclan con agua se
disuelvan en agua y se laven. La lisis o apertura de las células en detergente se
suele combinar con un método físico que rompe aún más la célula, como máquinas
que son similares a las licuadoras, perlas de vidrio o romper la célula utilizando
energía sonora. El uso de métodos físicos en combinación con detergentes asegura
que todas las células de la muestra se rompan y pueda aislar la mayor cantidad
posible de su fracción celular.
Paso 2.- separación:
Los homogeneizados de células se separan en fracciones haciéndolos girar súper
rápido en un proceso llamado centrifugación. Si alguna vez ha montado en un
carnaval antigravedad, entonces comprende cómo funciona la centrifugación. Estos
paseos eventualmente alcanzan la velocidad suficiente como para ser empujado
contra las paredes y no necesita un cinturón de seguridad para mantenerse
levantado. De manera similar, la centrifugación produce fuerzas que son miles de
veces más altas que la gravedad y los componentes celulares son empujados hacia
el fondo del recipiente en el que se encuentran.
La centrifugación aplica suficiente fuerza a los homogeneizados de células para
permitir que diferentes fracciones celulares se separen en función de propiedades
como la masa, la densidad y la forma, como se muestra aquí en la figura.
La centrifugación hace que los componentes que son demasiado pesados para
resistir la fuerza de la gravedad se muevan hacia el fondo del tubo, como se ve en
esta figura.
Paso 3.- Colección:
La forma en que se recolectan las fracciones celulares dependerá del líquido en el que
se centrifugan las fracciones celulares. Las fracciones celulares generalmente se
centrifugan en un medio o líquido que proporciona soporte osmótico como sacarosa o
Percoll. Los líquidos ayudan en la separación de componentes celulares según la
densidad y el tamaño. Si solo se usa una concentración de sacarosa o Percoll, se
denomina centrifugación diferencial porque las diferentes fracciones se recolectarán
centrifugando la muestra varias veces, como se muestra en esta figura.
Las fracciones de células también se pueden separar en un paso usando un gradiente
de densidad, como se muestra en esta figura. Las fracciones de células se aplican a un
tubo de ensayo que tiene capas de diferentes densidades de sacarosa o Percoll, lo que
permite separar las fracciones de células en función de la densidad. La fracción celular
se encontrará en capas según su densidad. Aunque la centrifugación en gradiente de
densidad es conveniente, es más complicado recolectar la fracción celular porque es
fácil mezclar las fracciones nuevamente. La recolección de las fracciones de un
gradiente de densidad generalmente se realiza con mucho cuidado con una aguja.
Comprobación de sus fracciones celulares:
El paso final en el fraccionamiento celular es probar la pureza de sus fracciones
celulares. Esto significa que está comprobando que ha aislado la parte correcta de la
célula. Por ejemplo, si está tratando de examinar la fracción celular para la
producción de energía, no desea que el retículo endoplásmico contenga
mitocondrias; podría llevarlo a creer que se produce cierta producción de energía en
el retículo endoplásmico.
El análisis de Western blot es la forma más común de preguntar si ha recolectado la
fracción deseada. El procedimiento de transferencia Western permite separar e
identificar las proteínas mediante el uso de anticuerpos contra proteínas exclusivas
de una fracción celular. Si está tratando de recolectar mitocondrias, su análisis de
Western blot solo debe ser positivo para las proteínas que se encuentran en las
mitocondrias. Si es positivo para las proteínas que se encuentran en otras fracciones
celulares, debe tomar más medidas para purificar su fracción.
Términos claves del fraccionamiento celular:
Fraccionamiento celular: proceso mediante el cual diferentes partes de
una célula pueden separarse mediante centrifugación.
Lisis: proceso de apertura de células
Centrifugación diferencial: recogida de fracciones de células mediante
centrifugación en una muestra varias veces
Gradiente de densidad: proceso en el que las fracciones celulares se
separan según la densidad utilizando un tubo de ensayo que tiene
capas de diferentes densidades de sacarosa o Percoll.
Análisis de transferencia Western: permite la separación e identidad de
proteínas mediante anticuerpos
5.5 Marcaje de moléculas celulares.
El marcaje celular nos permite conocer una gran variedad de mecanismos e
interacciones moleculares que se efectúan en organismos complejos (células,
proteínas, etc.). Un método típico consiste en añadir a las células un marcado con
radioisótopos, dentro de este tipo de marcaje con isótopos se aplica principalmente el
método de autor radiografía (Frei Felder, 1991) Fundamento: Se
denominan isótopos (del griego: ἴσος, isos = mismo; τόπος, tópos = lugar) a
los átomos de un mismo elemento, cuyos núcleos tienen una cantidad diferente
de neutrones, y, por lo tanto, difieren en masa. La mayoría de los elementos químicos
poseen más de un isótopo. Solamente 21 elementos (ejemplos: berilio, sodio) poseen
un solo isótopo natural; en contraste, el estaño es el elemento con más isótopos
estables. El autor radiografía fue descubierta en 1867, cuando las emulsiones de
cloruro de plata y yoduros ennegrecieron por las sales de uranio. No se hizo mucho con
este descubrimiento hasta que Marie Curie y su marido, Pierre, lo demostraron en 1898
en su búsqueda de la radiactividad. Sus estudios enautorradiografía condujeron al
descubrimiento de la radiación.
Actividad de clase 1: Estructura de la célula
La estructura común a todas las células comprende la membrana plasmática, el
citoplasma y el material genético o ADN.
Membrana plasmática: constituida por una bicapa lipídica en la que están englobadas
ciertas proteínas. Los lípidos hacen de barrera aislante entre el medio acuoso interno y
el medio acuoso externo.
El citoplasma: abarca el medio líquido, o citosol, y el morfoplasma (nombre que recibe
una serie de estructuras denominadas orgánulos celulares).
El material genético: constituido por una o varias moléculas de ADN. Según esté o no
rodeado por una membrana, formando el núcleo, se diferencian dos tipos de células:
las procariotas (sin núcleo) y las eucariotas (con núcleo).
Las células eucariotas, además de la estructura básica de la célula (membrana,
citoplasma y material genético) presentan una serie de estructuras fundamentales para
sus funciones vitales (ver t27 y t28):
El sistema endomembranoso: es el conjunto de estructuras membranosas
(orgánulos) intercomunicadas que pueden ocupar casi la totalidad del citoplasma.
Orgánulos transductores de energía: son las mitocondrias y los cloroplastos. Su
función es la producción de energía a partir de la oxidación de la materia orgánica
(mitocondrias) o de energía luminosa (cloroplastos).
Estructuras carentes de membranas: están también en el citoplasma y son
los ribosomas, cuya función es sintetizar proteínas; y el citoesqueleto, que da dureza,
elasticidad y forma a las células, además de permitir el movimiento de las moléculas y
orgánulos en el citoplasma.
El núcleo: mantiene protegido al material genético y permite que las funciones de
transcripción y traducción se produzcan de modo independiente en el espacio y en el
tiempo.
Actividad 2: 3 equipos que se utilizan para el estudio de la célula
1. Microscopio electrónico
Proporciona una mayor resolución y se usan para conocer en detalle la estructura
interna de las células e inclusos de virus. Son instrumentos muy costosos por lo que
no son de uso generalizado y usan electrones en lugar de luz y electroimanes en
vez de lentes.
2. Microscopio óptico
Utiliza la luz natural o artificial para iluminar el preparado. Algunos tipos de
microscopios ópticos son el compuesto, el digital, el fluorescente, el de disección y
también el quirúrgico.
3.
