Laboratorio de análisis instrumental I QI-642.

Universidad Tecnológica de Pereira

Espectrofotometría parte B
Spectroscopy part B

Autor 1: Londoño-Chica, Natalia; Autor 2: Espinoza-Marulanda, Mariana;

Autor 3: López, Sebastián.
Universidad Tecnológica de Pereira.
Correo-e: n.londono1@[Link];
[Link]@[Link]; jhoan.lopez2@[Link]

Resumen— En la práctica se realizó la determinación eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura
fotométrica de manganeso en un acero comercial y uno estándar, atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura,
realizando determinado tratamiento a cada muestra y fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica
determinando finalmente la concentración de manganeso en el constituye un valioso instrumento para la determinación y
acero comercial, también se determinó la concentración de
caracterización.
nitritos en una muestra de agua de la llave mediante una curva
de calibración realizada con estándares de nitritos.
Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por
Palabras clave— Espectro, espectrofotómetro, una molécula se origina un salto desde un estado energético
Celdas, absorbancia, barrido espectral, blanco basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado
fotométrico. excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que permita el
salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de
Abstract— In practice, the photometric determination of estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de
manganese was carried out in a commercial steel and a standard moléculas. El grado de agitación depende del tipo de
one, carrying out a certain treatment to each sample and finally sustancia, ya que cada sustancia puede absorber a ciertas
determining the concentration of manganese in the commercial
radiaciones y otras no.
steel, the concentration of nitrites in a sample of water from the
key using a calibration curve made with nitrite standards.

Key Word — Spectrum, spectrophotometer, Cells, absorbance,

spectral scan, photometric blank.

INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que

permite determinar la concentración de un compuesto en
solución. Se basa en que las moléculas absorben las
radiaciones Figura 1. Diagrama de niveles de energía en una molécula.
electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida La absorción de energía luminosa hace que la molécula
depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado
tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía
puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)
una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la
misma. En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma
visible de radiación electromagnética, sino también a las
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de formas UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometría de
las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la

Figura 2. Espectro electromagnético

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La región UV se define como el rango de longitudes de onda en tanto por ciento: % T = I t/Io x 100 La transmitancia nos da
de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Provoca
una medida física de la relación de intensidad incidente y
daño al ojo humano, así como quemadura común. Los
transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la
compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces,
concentración no es lineal, pero asume una relación
enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y
logarítmica inversa. La transmitancia será del 100% si no es
otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región
absorbida por la sustancia, si esta radiación es absorbida será
UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación
menor a 100%.
cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos
factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la
alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por
de los espectros UV. La fuente de radiación ultravioleta es una la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
lámpara de deuterio. En la región visible apreciamos el color consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log I t/ Io. Cuando la
visible de una solución y que corresponde a las longitudes de
intensidad incidente y transmitida son iguales (I o = It), A= 2-
onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que
absorbe es el complementario del color que transmite. Por log %T, la transmitancia es del 100% e indica que la muestra
tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario no absorbe a una determinada longitud de onda entonces (A)
utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución será igual log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida dependerá
coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una de la distancia que atraviesa la luz a través de la solución del
lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por cromóforo y de la concentración de éste.
debajo de 320 nm.
 Ley de Lambert-Beer

La ley de Beer establece que si a través de una solución con

concentración C en una especie absorbente, contenida en una
celda de espesor b, pasa una radiación monocromática que es
absortividad por la especie, se cumple la relación: A=abC,
siendo A, la absorbancia y a la absortividad especifica, o sea,
que la magnitud de la absorbancia es proporcional al poder
absorbente, al espesor de la celda y a la concentración, b se
La absortividad especifica “a” y la absortividad molar “E” son expresa en cm y C g/L o mg/mL, la absorbancia A también es
factores que indican la capacidad de una sustancia para igual a Ebc (A= Ebc), siendo E la absortividad molar (E=a*
absorber una radiación determinada y junto con su curva pm) donde pm= peso molecular de la sustancia, cuando se
espectral son los parámetros usados para la identificación de utiliza esta expresión c se expresa en moles por litro.
un compuesto.
La medida cuantitativa de la absorción de radiación por la
 Transmitancia y Absorbancia materia implica medir los cambios (reducción ) en la potencia
del haz de radiación, P, que pasa a través de la celda de
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda absorción que contiene la sustancia absorbente.
de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una
disolución de un compuesto químico que absorbe luz o Cuando la radiación monocromática no atraviesa la cubeta se
cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación produce una atenuación del haz.
incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma que se
cumple: Io = Ia + It

P1: Potencia del haz incidente.

P2: Potencia de la radiación transmitida
P0: Potencia tras atravesar la primera pared de la celda.
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la P: Potencia tras atravesar el medio absorbente.
relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al P1, 2,..n es la E de la radiación (o número de fotones) que
detector una vez que ha atravesado la muestra, I t, y la cantidad llega al detector por unidad de sección y unidad de tiempo.
de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente
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Si P1 es el poder radiante del haz en ausencia de disolución

absorbente y P2 la potencia de la radiación transmitida b. Comparación de las características técnicas de los
cuando se ha colocado la disolución absorbente. diferentes modelos de espectrofotómetros.

 Blanco fotométrico

Cuando se determina el poder absorbente de una sustancia,

esta se encuentra generalmente dentro de un medio formado
por el solvente, los reactivos agregados u otras sustancias que
la acompañan, todo lo cual puede llegar a generar
interferencias en la medida. Para corregir estas interferencias
se debe disponer de una base de comparación, que es una
solución que contiene las sustancias que pueden causar
interferencia pero no contiene la especie absorbente que se
pone en estudio. Esta solución donde están todos los reactivos
agregados a la solución en estudio se le denomina blanco
fotométrico.

1.1 RECONOCIMIENTO DE LOS EQUIPOS

a. Roctec V-1200

MATERIALES Y MÉTODOS
-Longitud de onda Calibración de fuente de luz cambio
deuterio y lámpara de tungsteno Auto.
 2 fotómetros uno digital y uno análogo
 Varias celdas para los fotómetros
Modelo UV-1100 UV-1200 V-1200
La gama de 200-1000nm 325-1000nm  5 tubos de ensayo
De la banda espectral 4nm (2nm)  2 beaker de 100 mL
Longitud de onda de ± 2nm ± 1nm  2 beaker de 250 mL
precisió n  5 matraces aforados de 25 mL
Longitud de onda de ≤ 0.2nm  1 matraz aforado de 50 mL
repetibilidad  1 matraz aforado de 100 mL
La luz pará sita ≤ 0.2% T en 220nm... ≤ 0.2% T en  1 matraz aforado de 250 mL
360nm 360nm  1 pipeta volumétrica de 5 mL
Fotométricas de precisió n ± 0.5% T  1 pipeta volumétrica de 10 mL
Fotométricas repetibilidad ≤ 0.2% T  1 pipeta graduada de 10 mL
La estabilidad ± 0.002A/h en 500nm  1 probeta de 50 mL
Forma de trabajo TACE  1 bureta de 25 mL graduación 1/20
Rango de visualizació n 0-200% T-0,3-3A  1 vidrio reloj 100 nm de diámetro
Sistema de Visualizació n 128*64 LCD  1 frasco lavador
Modo Cero Auto  1 espátula acanalada
Dimensió n 470*370 * 180nm  Solución problema (P2) muestra de un acero
Peso (Kg) 12Kg  Estándar de acero cuyo Mn sea conocido
Tabla 1. Espectrofotómetro Roctec características.  Permanganato de potasio de peso 158.04 y 99% pureza
 Ácido nítrico 1:3
 Peroxidisulfato amónico
 Ácido fosfórico concentrado
 Peryodato de potasio
 Acido clorhídrico concentrado
 Acido sulfurico 0,5 molar
 Sulfonamida
 Dihidrocloruro de nafti-etilendiamina
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-MANEJO Y CALIBRACION DEL INSTRUMENTO

Primero se conecta el equipo y se espera alrededor de 20 presentaron una absorbancia de:
minutos para empezar a manipular el equipo, después se Celda 1: 0.068
designa la longitud de onda a la cual se va a trabajar o si se Celda 2: 0.061
realiza un barrido espectral, se inicia alrededor de los 350 nm, Lo cual indica que son equivalentes
una vez realizado este proceso se quiere obtener celdas
equivalentes para en una tener el blanco fotométrico y en la Se inició la práctica realizando preparando los patrones de 0,5
otra la sustancia a analizar, para hallar estas celdas se mide su mg/L; 1 mg/L; 1,5 mg/L; 2 mg/L; 2,5 mg/L y midiendo su
absorbancia con agua destilada, y esta debe presentar un respectiva absorbancia (tabla 2) y realizando su respectiva
mínimo error, una vez realizado este proceso se realizo el curva de calibración (grafica 1).
tratamiento de las muestra y el estándar de acero en
simultaneo para esto se peso una muestra de acero de 0,6 g;
concentracion Abs Abs 2
este valor debido a que se usaron grapas para grapadora, y así
(mg/L)
aumentar su concentración , se transfirió a beaker de 250 ml y
se adiciono 25 ml de ácido nítrico (1:3), se calentó lentamente 0,5 0,016 0,001
para acelerar la digestión, una vez esta finalizo y no se
observaron partículas se filtró, y se añadió en varias etapas 0,5 1 0,038 0,017
g de persulfato amónico, se hirvió durante 10 min para oxidar
compuestos de carbono, si se genera coloración se realiza un 1,5 0,065 0,04
procedimiento extra el cual no fue necesario. A partir de esta
solución que se encuentra a 50 mg/L se prepararon patrones 2 0,094 0,064
de concentraciones de 0,5 mg/L; 1 mg/L; 1,5 mg/L; 2 mg/L;
2,5 0,124 0,082
2,5 mg/L respectivamente y se midió su respectiva
absorbancia a 526 nm, una vez se obtuvieron estos valores se
Tabla 1. Concentración vs absorbancia patrones manganeso
realizo la curva de calibración (grafica 1) y se determinó la
concentración del acero comercial y del estándar.
Para la determinación de nitritos en agua se preparó una Patrones Mn
solución coloreada, para esto se agregó en un matraz de 50
ml; 5 ml de acido fosfórico, 0,5 g de sulfonamida, 40 ml de 0.14
agua, se agito y finalmente se añadió 0,05 g de dihidrocloruro 0.12
0.1 f(x) = 0.0544 x − 0.0142
de nafti-etilendiamina; para realizar los estándares de nitritos R² = 0.996659122750296
se tomaron 1,232 g de Na2C2O4 y se aforo a 100 ml, esta 0.08
Abs

0.06
solución tiene una concentración de 250 mg/L, se procedió a
0.04
aplicar una seri de diluciones para llegar a una concentración
0.02
de 50mg/L , y de esta a una solución de 0,5 mg/l para 0
finalmente con esta realizar los patrones de concentraciones: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0.002 mg/L; 0.008mg/L; 0.014mg/L; 0.020mg/L; .0.025mg/L concentracion (mg/L)
a cada patrón se le agregaron 2ml de la solución colorada
mencionada anteriormente y se realizó la curva de calibración
para así determinar la concentración de la muestra de agua de Grafica 1. Curva de calibración espectrofotómetro 1.
la llave, también se prepararon 2 veces mas los patrones de
0.002 mg/L y 0.025 mg/L, se midió su absorbancia para pendiente 0,0544 -0,0142 intercepto
comprobar la repetibilidad del método. se (slope) 0,00181842 0,003015515 se( intercept)
R2 0,99665912 0,002875181 se(y)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN F 894,967742 3 df
ssreg 0,0073984 2,48E-05 ssresid
Para obtener una medición adecuada de
transmitancia o absorbancia de alguna especie se Tabla 2. Estadística de calibrado.
deben usar celdas que transmitan porcentajes
equivalentes, o sea deben tener igual espesor, la LoQ=10*(sy/x)/m LoQ 0,52852595
misma transparencia. La razón de no equivalencia de LoD=3,3*(sy/ LoD 0,17441356
las celdas pueden ser pequeñas diferencias en la x)/m
geometría de ellas, pequeñas suciedades adheridas o Tabla 3. Límites de detección y cuantificación
que las paredes estar rayada
Se obtuvo que en la celda 1 la absorbancia fue de
0,073
Se obtuvo que en la celda 1 la absorbancia fue de
0,076
Lo cual indica que las celdas utilizadas en la
determinación de Mn son equivalentes; por otro lado,
las celdas usada en la determinación de nitritos
 6 Laboratorio de análisis instrumental I QI-642. Universidad Tecnológica de Pereira

patrones Mn
0.1
0.08
f(x) = 0.0418 x − 0.0219
0.06 R² = 0.995737211634905
abs

0.04
0.02
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
concentracion (mg/L)

Grafica 2. Curva de calibración espectrofotómetro 2.

pendient 0,0442 -0,0267 intercepto

e
se (slope) 0,00720278 0,01194445 se( intercept)
R2 0,92621179 0,01138859 se(y)
F 37,6569005 3 df
ssreg 0,0048841 0,0003891 ssresid
Tabla 4. Estadística de calibrado 2.

LoQ=10*(sy/x)/m LoQ 2,57660425

LoD=3,3*(sy/ LoD
x)/m 0,8502794
Tabla 5. Límites de detección y cuantificación

Una vez se obtuvieron las respectivas curvas de calibración se

procedió a determinar la concentración del acero estándar y del
acero comercial para ello se midió su absorbancia y se despejo
en la ecuación:

La absorbancia del acero estándar fue de 0.172 al encontrarse

muy
concentrado y no entrar en nuestro rango se aplicó un factor de
dilución de 2 veces, la nueva absorbancia dio: 0.121
y = 0,0544x - 0,0142
x=y+0,0142/0,0544
x=0.121+0.0142/0.0544
x= 2.4852
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la concentración de acero estándar es de 4,9706 mg/L

nitritos en agua
la absorbancia del acero comercial fue de 0.031
y = 0,0544x - 0,0142 0.12
x=y+0,0142/0,0544 0.1
f(x) = 3.52790973871734 x + 0.0145148456057007
x=0.031+0.0142/0.0544 0.08 R² = 0.995029992295847
x= 0.8308 0.06

abs
0.04
la concentración del acero comercial en este caso grapas de 0.02
grapadora es de 0.8308 mg/L 0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
La absorbancia del acero estándar fue de 0.183 al encontrarse concentracion (mg/L)
muy concentrado y no entrar en nuestro rango se aplicó un factor
de dilución de 2 veces, la nueva absorbancia dio: 0.033
y = 0,0418x - 0,0219 Grafica 3. Curva de calibración Nitritos en agua
x=y+0.0219/0.0418
x=0.033+0.0219/0.0418 pendient 3,527909739 0,014514846 intercepto
x=1.3133 e
se (slope) 0,143951861 0,002311313 se( intercept)
la concentración del acero estándar es de 2.6267 mg/L R2 0,995029992 0,002641821 se(y)
F 600,6207947 3 df
la absorbancia del acero comercial fue de 0.047
ssreg 0,004191862 2,09376E-05 ssresid
y = 0,0418x - 0,0219
x=y+0.0219/0.0418 Tabla 6. Estadística de calibrado niritos 1.
x=0.047+0.0219/0.0418
x=1.6483 LoQ=10*(sy/x)/m LoQ 0,485628789
LoD=3,3*(sy/ LoD
la concentración del acero comercial en este caso grapas de x)/m 0,002471154
grapadora es de 1.6483 mg/L Tabla 7. Límites de detección y cuantificación nitritos

Se inicio la segunda parte de la sección preparando los patrones

de 0.002 mg/L; 0.008mg/L; 0.014mg/L; 0.020mg/L; nitritos en agua
0.025mg/L, una vez obtenido se procedió a tomar su
0.12
absorbancia (tabla 5) y a graficar la curva de calibración para así
determinar la concentración de nitritos en agua de la llave: 0.1
f(x) = 3.90023752969121 x + 0.0077767220902613
0.08 R² = 0.998470536911907
concentracion (mg/L) abs abs2 0.06
abs

0,002 0,023 0,014 0.04

0,008 0,041 0,040 0.02
0
0,014 0,065 0,064 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
0,02 0,082 0,086 concentracion (mg/L)
0,025 0,105 0,104
Tabla 4. Concentración vs absorbancia patrones nitritos Grafica 4. Curva de calibración Nitritos en agua

pendient 3,779691211 0,010840261 intercepto

e
se (slope) 0,236372627 0,003795235 se( intercept)
R2 0,988403228 0,004337937 se(y)
F 255,6926694 3 df
ssreg 0,004811547 5,64531E-05 ssresid
Tabla 8. Estadística de calibrados nitritos 2.

LoQ=10*(sy/x)/m LoQ 0,01147696

LoD=3,3*(sy/ LoD
x)/m 0,0037874
 8 Laboratorio de análisis instrumental I QI-642. Universidad Tecnológica de Pereira

Tabla 9. Límites de detección y cuantificación nitritos 2. x2=0.1-0.0145/3.5279

x2=0.02423
La absorbancia que presenta la muestra problema es de 0.006
este valor es muy pequeño y no entra en nuestro rango de para el límite superior se admite un error de hasta el 10%
calibración por lo tanto se concluye que la concentración de
nitritos en agua de la llave es <0.002 mg/L

Repetibilidad del método:

Se preparan 2 veces mas los patrones de 0.002 mg/L y 0,025
mg/L se midio su absorbancia y esta dio (tabla 10)

concentracion abs 1 abs 2

(mg/L)
0,002 0,016 0,053
0,002 0,029 0,04
0,025 0,099 0,098
0,025 0,1 0,099
Tabla 10. Repetibilidad
Vamos a calcular la concentracion para comprobar su
repetibilidad
y = 3,5279x + 0,0145
x1=y-0.0145/3.5279
x1=0.016-0.0145/3.5279
x1=0.004

y = 3,5279x + 0,0145
x2=y-0.0145/3.5279
x2=0.029+0.0145/3.5279
x2=0.004
para este límite inferior se admite un error de hasta el 50%
debido a la dificulta de llegar a esta concentración

y = 3,5279x + 0,0145
x1=y-0.0145/3.5279
x1=0.099-0.0145/3.5279
x1=0.02395 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
y = 3,5279x + 0,0145 -La fotometría es una técnica muy utilizada para
x2=y-0.0145/3.5279
determinación de concentraciones o identificación de sustancias a
partir de sus barridos espectrales o absorbancias de sus patrones.
- Cuando se desea hacer una análisis a una sustancia mediante
el método de fotometría visible, se debe conocer la longitud
de onda en la que la sustancia presenta su máximo de
absorción, debido a que esto nos da una idea de cuál es la
sustancia, pues estos máximos son característicos para cada
especie, y además nos permite resultados óptimos.
-Para obtener buenos resultados al aplicar la técnica
fotométrica, es necesario utilizar los adecuados materiales
volumétricos para la preparación de los patrones y de las
muestras necesarias para la aplicación.
Laboratorio de análisis instrumental I QI-642.. Universidad Tecnológica de Pereira 9

APLICACIÓN INDUSTRIAL

La espectrofotometría es de gran utilidad en el análisis de

espacies químicas sobre todo para el químico analítico, se
utiliza por ejemplo para:
• Identificar compuestos por su espectro de absorción.
• Conocer la concentración de un compuesto en una
disolución.
• Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de
análisis químico.
• Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.
• Determinar la cantidad de concentración en una solución.
• Para la determinación de estructuras moleculares.
• La identificación de unidades estructurales especificas ya
que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos
funcionales o isomerías).
• Determinación del almidón, azúcares, reactores, proteínas,
en alimentos.
- El espectrofotómetro es de gran utilidad en análisis
cuantitativo de proteínas, en la determinación de ácidos
nucleicos incluyendo ADN / ARN, enzimas

REFERENCIAS

[1]. 404 Not Found. (s. f.). Recuperado 28 de

septiembre de 2022, de
[Link]
39/exe2%20de%20agosto/leccin_3_transmi
t ancia_y_absorbancia.html
[2]. Federmán Castro E, Análisis instrumental l,
manual de prácticas de laboratorio, Cámara
colombiana del libro, Colombia 2014.
[3]. Federmán Castro E, Análisis instrumental
Algunos métodos fotométricos y
espectrometricos, Apuntes de clase,
Colombia.