Universidad Científica del Sur
Carrera de Medicina Humana
Informe sobre técnicas de degradación de
proteínas
● Introducción
Las proteínas presentan una estructura nativa la cual en los medios
adecuados de pH, temperatura, en otras palabras no ha sufrido ningún
cambio en su interacción con el disolvente, se dice que esta proteína es
funcional. La desnaturalización de proteínas consiste en la pérdida de la
estructura tridimensional por distintos factores ambientales, como
temperatura, pH o ciertos agentes químicos; como previamente se mencionó
estos cambios tendrían como efecto la pérdida de la función biológica
asociada a esa proteína. (1)
Los principales agentes desnaturalizantes de las proteínas son:
- pH: El exceso de iones H+ y OH– en el medio desestabiliza las
interacciones de la proteína.
- Temperatura: Las proteínas empiezan a desestabilizarse a
temperaturas mayores de 40 °C, una vez llegada a esa temperatura se
alterarían los puentes de hidrógeno de las proteínas.
- Sustancias químicas: La presencia de sustancias polares o apolares
en altas concentraciones genera alteración en los puentes de
hidrógeno que estabilizan a las proteínas.
- Agentes reductores: Agentes como el β-mercaptoetanol y el
ditiotreitol afectan a la estructura nativa de las proteínas.
Teniendo en cuenta todo lo previamente mencionado y su posterior definición
es que este informe se centra en el estudio de la desnaturalización de las
proteínas mediante el método de electroforesis para así comprender e
identificar de manera práctica los factores que afectan la estructura de la
proteína.
● Objetivos
- Conocer la desnaturalización de proteínas y la electroforesis en gel de
Poliacrilamida con dodecilsulfato sódico.
- Identificar los componentes y procedimientos de la electroforesis en
gel de Poliacrilamida con dodecilsulfato sódico.
● Fundamento Teórico
La electroforesis es un método analítico –semipreparativo, en el que se separan
biomoléculas, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de
un campo eléctrico. (2) Cabe señalar que, En un principio se utilizaron geles de
almidón, pero posteriormente se reemplazaron por geles de poliacrilamida,
impartiendo a las proteínas una carga negativa, misma que ocasiona que migren al
ánodo de un circuito eléctrico. El principio que se utiliza en electroforesis se
fundamenta en la atracción de cargas eléctricas. Cuando una proteína presenta una
carga eléctrica neta, en un campo eléctrico se desplazará al electrodo con carga
contraria. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas
de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa, más rápida será
la migración.(3)
Dentro de esta técnica se encuentran varios tipos, las que se dan en condiciones
desnaturalizantes en donde se tiene a la Electroforesis gel de poliacrilamida-SDS
(SDS-PAGE)y la Electroforesis gel de urea-SDS, y las que se dan en condiciones no
desnaturalizantes como la Electroforesis gel nativo:Separa proteínas basado en su
tamaño y su carga. Con respecto a la electroforesis SDS PAGE, el dodecilsulfato
sódico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aniónico que se une a las
proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de
moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es
directamente proporcional a su longitud en aminoácidos y su carga queda
enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es también
proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la proteína
depende exclusivamente de su masa [Link] señalar que, la muestra se
trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y se calienta
brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se suele añadir
también β-mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las
subunidades de la proteína y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS. De
manera que tiene una gran utilidad en el análisis de proteínas pura, determinación
del peso molecular de una proteína, detección de proteólisis, identificación de
proteínas inmunoprecipitadas, detección de modificación de proteínas, separación
de proteínas marcadas radioactivamente. Asimismo tiene un alta sensibilidad, esto
debido a que depende principalmente del marcador teniendo así al Coomassie blue:
0,1-1 µg por banda y la Tinción de plata: 2-10 ng por banda.
● Procedimiento experimental:
Materiales y Métodos:
Materiales:
Reactivos:
● Acrilamida, grado electroforesis
● Bis-acrilamida (N,N´-methylenebisacrylamide
● Tris (2-hydroxymethyl-2-methyl-1,3-propanediol)
● SDS (Sodium dodecyl sulfate or sodium lauryl sulfate)
● TEMED (N,N, N´, N´-tetramethylene-ethylenediamine)
● Persulfato de amonio.
● Mercaptoetanol
● Glicerol
● Azul de bromofenol
● Glicina
● Ácido Hidroclórico
● Dithiothreitol (DTT)
Solución Stock:
● 2 M Tris-HCl (pH 8,8)
● 1 M Tris –HCl (pH 6,8)
● 10% (p/v) SDS
● 50% (v/v) glicerol
● 15 (p/v) azul de bromofenol
Soluciones de trabajo:
● Solución stock de acrilamida (100 mL)
● 30% (p/v) acrilamida, 0,8% (p/v) bis- acilamida.
● Tampón de gel de separación 4 x (100 mL)
-75 mL 2 M Tris-HCl (pH 8,8)
-4 mL 105 SDS
-21 mL de H2O
● Tampón de gel concentrador (100 mL)
-50 mL 1M Tris HCl (pH 6,8)
-4 mL 10% SDS
-46 mL H2O
● Persulfato de amonio, 5 mL
-0,5 g de persulfato de amonio
-5 mL de agua destilada
● Tampón de electroforesis:
-3 g de Tris
-4,4 g de glicina
-1 g SDS
-1 L de agua destilada
Tampón de muestra 5x:
● 0,6 mL 1 M Tris-HCl (pH 6,8)
● 5 mL de glicerol 50%
● 2 mL SDS 10%
● 0,5 mL 2- mercaptoethanol
● 1 mL azul de bromofenol 1%
● 0,9 mL de agua destilada
Métodos: Electroforesis SDS-PAGE
Procedimiento:
● Desinfección y ensamblado
Lavar cristales con alcohol y ensamblar cassette colocar el espaciador y
marcar 1cm por debajo(para tener la separación entre los dos tipos de geles)
● Polimerización del gel: gel separador (resolving gel)
Al 8%:
-2,7 mL de la solución de acrilamida
-2,5 mL del tampón del gel de separación
-4,8 mL de agua destilada
-50 µL persulfato de amonio 10%
- 5 µL persulfato de amonio 10%
● Ensamblar para realizar el gel de separación.
● Dejar polimerizar por 30 a 60 minutos
● gel acumulador o concentrador (stacking gel)
Al 5%:
-0,67 mL de la solución de acrilamida
-1,0 mL del tampón del gel de concentración
-2,3 mL de agua destilada
-30 µL persulfato de amonio 10%
- 5 µL persulfato de amonio 10%
● Realizar pocillos (peine) antes de polimerizar el gel acumulador
● Colocar el gel en soporte
● Quitar peine de pocillos de muestra.
● Añadir tampón de corrida.
● Cargar muestra.
● Iniciar corrida
● Colorear gel par visualizar las bandas
● Solución de tinción:
-Coomassie blue, 1 L
-1,0 g de Coomassie blue R-250
-450 mL metanol
-100 mL de ácido acético glacial
(Agitar por 10-20 min)
● Discusión
- La desnaturalización de proteínas mediante la electroforesis con gel de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), separa las proteínas basado principalmente
en su peso molecular, de ello depende su movilidad electroforética, sobre el
soporte sólido por acción del campo eléctrico. El detergente se une a la
proteína y trabaja interrumpiendo los enlaces, desnaturalizarlas y provocando
que pierdan su conformación.
- El uso de tampones en el sistema asegura la migración de todas las
proteínas que fueron cargadas en los pocillos hacia el frente de migración o
hacia el ánodo (+), debido a que fueron acomplejadas con SDS (cargados
negativamente).
- El proceso de electroforesis necesita un orden y ensamblaje de sistema el
cual va según los materiales previamente mencionados, en principio es
importante indicar que se cuenta con una plataforma y bases para poder
elaborar el gel y montar los cristales, a ello se le agregas peines con pocillos
los cuales permiten generar los espacios para cargar la muestra, la cual va
estar mediada por un gel separador y concentrador. El gel separador, separa
la muestra según su peso molecular y el gel concentrador es donde se ubica
la muestra para que se pueda establecer la variante de peso molecular
mediante una carga eléctrica dada por la fuente de energía la cual presenta
un voltaje constante para así generar el campo eléctrico y permitir la
migración y separación de las proteínas en el gel.
- Al finalizar la corrida, se colorea los fragmentos de la proteína
desnaturalizada con Nitrato de plata para visualizar las bandas y determinar
el peso molecular de la proteína.
● Conclusiones
- La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más
utilizados para la degradación de proteínas.
- La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte generalmente sobre geles
de poliacrilamida (PAGE)
- La electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) permite determinar el peso
molecular de la proteína porque se utiliza proteínas de referencia de peso
molecular conocido
● Recomendaciones
- Con respecto a los buffer de trabajo se debe tener mucho cuidado en
controlar los pH por que de estos depende en gran parte los resultado de la
electroforéticos
Referencias Bibliográficas
1. Wade, L. (2011). Aminoácidos, Péptidos Y Proteínas. Química Orgánica. Vol2
Séptima edición(pp.1191-1192). México: Pearson Educación.
2. Pérez, [Link] al. Electroforesis en gel de poliacrilamida‐SDS como
herramienta en el estudio de las proteínas miofibrilares. Una
revisió[Link]. H Vol. 9, No. 2, pp. 77‐96, 2015.
3. García, H. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,
actualidad e importancia. Laboratorios Beterá. UNIV DIAG 2000;1(2):31-41.
Disponible en:
[Link]
_material=638201
