BLOQUE 3

UNIDAD 8
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE
LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

Ariadna Medina
OBJETIVOS
1. Entender el procedo de hibridación con sondas fluorescentes.
2. Conocer los tipos de sonda y tipos de marcaje.
3. Seleccionar el tipo de sonda y de marcaje en función del sistema de detección.
4. Dominar las técnicas de hibridación en soporte sólido y líquido, en
preparaciones de cromosomas y en cortes de tejidos.
5. Describir el proceso de hibridación, las fases y los factores que influyen en él.

Ariadna Medina
Hibridación
¿Qué significa hibridación?
Proceso de unión (artificial) de dos cadenas monocatenarias
mediante la complementariedad de bases para formar una
cadena bicatenaria hibrida. Pueden ser
• Dúplex • ADN + ADN
• Heteroduplex • ARN + ARN
• ADN + ARN
¿Aplicación en BMC?
Detectar secuencias concretas
de ácidos nucleicos (ADN o
ARN) mediante el empleo de
fragmentos complementarios
o sondas que se marcan para
poder ser visualizados

Ariadna Medina
Hibridación
ELEMENTOS BÁSICOS PARA LA DETECCIÓN DE UNA SECUENCIA

Secuencia diana Sonda Marcador

Secuencia concreta de BN que
se pretende detectar en la
muestra problema
Bicatenarias Monocatenarias

Cadena de nucleótidos cuya secuencia

de BN es complementaria a la
secuencia diana.

Ariadna Medina
Hibridación
PRINCIPIO BÁSICO DE HIBRIDACIÓN
1. DESNATURALIZACIÓN
1 molécula de doble hebra  2 moléculas de hebra sencilla
• Separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria debido a:
• Rotura de los puentes de hidrógeno entre pares de bases.

AGENTES DENATURALIZANTES
1. Temperatura
• A ↑Abs (260 nm)  ↑ temperatura  ↑ % desnaturalización
• CURVA SIGMOIDEA
o Zona A: Valor constante de A260
ADN bicatenario. Sin desnaturalizar (0%)
o Zona B: Aumento de la absorbancia a 260nm
Desnaturalización progresiva
o Zona C: Pendiente nula
Valor casi constante de A260  ADN 100% desnaturalizado

Ariadna Medina
Hibridación
PRINCIPIO BÁSICO DE HIBRIDACIÓN
2 puentes de hidrógeno 3 puentes de hidrógeno

1. DESNATURALIZACIÓN

AGENTES DENATURALIZANTES
1. Temperatura
• Correlación lineal Tm con su contenido de G +C A+T
 Mayor contenido de G + C  mayor cantidad de triples C+G
enlaces  mayor TM
2. Agentes químicos
• Urea Interactúan directamente con las BN ,
compitiendo con la formación de PH entre las
• Formamida bases complementarias, con lo que impiden
• Formaldehído un apareamiento correcto entre ellas

Ariadna Medina
Hibridación
PRINCIPIO BÁSICO DE HIBRIDACIÓN
Fase lenta Fase rápida “cierre
(unión de PH) de cremallera”
2. RENATURALIZACIÓN
2 moléculas de hebra sencilla  1 molécula de doble hebra
• A ↑ [Cadenas]  ↑ Posibilidad de reencontrase

• CURVA DE RENATURALIZACIÓN
PROCARIOTAS EUCARIOTAS
A- Secuencias altamente repetidas
B- Secuencias moderadamente repetidas
C- Secuencias única

Ariadna Medina
Hibridación
• El tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
Existen diferentes
técnicas de hibridación
• El tipo de sonda que se va a utilizar.
que se diferencian por • El tipo de marcaje de la sonda.
• El medio o soporte (sólido, líquido o in situ) en el que se realiza la hibridación.

Los ensayos de hibridación se pueden clasificar en tres grupos

HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA HIBRIDACIÓN IN SITU HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO

• La muestra de ADN diana se inserta en una

• Es la mas sencilla y rápida (1h) • No se necesita extracción matriz sólida a la que se le añade una
• La reacción de hibridación se de ácidos nucleicos. solución de hibridación con sondas marcadas.
realiza en disolución. • La sonda se aplica sobre • TÉCNICAS:
• TÉCNICAS: muestras en su ubicación • Southem
• Captura de híbrido natural (cortes de tejidos, • Northen blot
• ADN ramificado células intactas, núcleos
• CHG
• USO: detección de virus aislados…)
• Microarrays de ADN

Ariadna Medina
Sondas
Fragmento de ácido nucleico (ADN o ARN) que ha sido marcado con enzimas, sustratos antigénicos,
quimioluminiscencia o radioisótopos para du detección y que se pueden unir a una secuencia
complementaria diana de ácido nucleico.

• Especificidad --> Capacidad que tiene la

sonda para discriminar la secuencia diana
con la que se tiene que hibridar
¿CÓMO o Las sondas muy pequeñas (14-16
ELEGIMOS nucleótidos)  se unen de forma
LA SONDA? inespecífica
• Sensibilidad  Probabilidad de detectar
cantidades mínimas del híbrido sonda-
diana.
• Depende del marcaje.

Ariadna Medina
Sondas
TIPOS DE SONDAS DEPENDIENDO DE LA NATURALEZA DEL ÁCIDO NUCLEICO
SONDAS DE ADN SONDAS DE ARN SONDAS SINTÉTICAS
Son las más utilizadas Son monocatenarias (No desnaturalización ) Oligonucleótidos* obtenidos mediante
Fáciles de obtener • Obtenidas por: síntesis química (15-50 kb)
• Obtenidas por: o Transcripción de ADN clonados en • No contienen grupos fosfatos
o Clonación de ADN vectores especiales (con ARN polimerasa • No se degradan por nucleasas ni
(0,1-100 kb) específica) proteasas
o Productos de PCR • Los híbridos ADN/ARN son más sensibles a la • Los híbridos formados son mas
(0,1-20 kb) presencia de ARNasas pero la unión es más estables
↑ Sensibilidad & Especificidad fuerte (más estables) ¿TIPOS?

*Oligonucleótido: cadena de ADN o ARN

con aproximadamente 50 pares de bases.

Ariadna Medina
Sondas
SONDAS DE ADN

• Son las más utilizadas

o Son fáciles de obtener en grandes cantidades
o Presentan gran versatilidad en cuanto tamaño y marcaje
o Sus cinéticas de des y renaturalización son las m+ estudiadas

Clonación de ADN PCR

• Se obtienen por un proceso de clonación. • Se obtienen por el proceso de PCR*
CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS: • Se requiere conocer cebadores
SEGÚN EL PROCESO
• Son bicatenarias CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS:
DE OBTENECIÓN SE
• Gran tamaño (admiten un gran • Son bicatenarias
DISTINGUEN
número de moléculas marcadoras  • Tamaño intermedio
↑ sensibilidad)
• No suelen hibridar inespecíficamente
 ↑ especificidad.

*amplificar el fragmento que nos interesa como sonda mediante la reacción en cadena de la polimerasa

Ariadna Medina
Sondas
SONDAS DE ADN

Proceso de clonación de ADN

Extracción Extracción
INSERTO
Unión con ligasa

PLÁSMIDO
ADN circular bicatenario
SONDAS
ADN lineal monocatenario

REPRODUCCIÓN
DESNATURALIZACIÓN
Extracción
CÉLULA ANFITRIONA
Bacteria

Ariadna Medina
Sondas
SONDAS DE ARN

• Conocidas también como ribosondas

• Son menos utilizadas
• Son monocatenarias, no requieren desnaturalización
• VENTAJAS: Los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN
• DESVENTAJAS: Sensibles a contaminación por ARNasas que las degradan

• TRANSCRIPCIÓN  transcripción de un vector que contiene el fragmento de interés

¿CÓMO SE OBTIENEN?
• TRANSCRIPCIÓN MEDIANTE FAGO SP6

Ariadna Medina
Sondas
SONDAS SINTÉTICAS
TIPOS

Condensación química secuencial

SONDAS DE ADN Monocatenarias 40-50 nucleótidos
↓ Sensibilidad & ↑ Missmatch
Condensación química secuencial
SONDAS DE ARN Ribosondas Monocatenarias
Tamaño intermedio
Esqueleto de aminoetilglicina unidas por enlaces amida
SONDAS DE ÁCIDOS
No tienen carga eléctrica (No grupos fosfato)
NUCLEICOS
No degradadas por ADNasas/ARNasas
PEPTÍDICOS (PNA)
↑ Estabilidad & Especificidad
SONDAS DE ÁCIDOS Oligómeros sintéticos de ribonucleótidos modificados
NUCLEICOS ↑ Sensibilidad & Especificidad
BLOQUEADOS (LNA)

Ariadna Medina
El marcaje de las sondas
Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para
poder detectar el híbrido formado con la secuencia diana
A través de

MARCAJE

Procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de hibridación

con la finalidad de poder visualizar los resultados.

Tipos de marcaje

MARCAJE DIRECTO MARCAJE INDIRECTO

La propia sonda es la marcada La sonda se une a una macromolécula que se une al hapteno

Marcador + Sonda Marcador + Molécula + Sonda

Ariadna Medina
El marcaje de las sondas
MARCAJE DIRECTO
Marcador + Sonda

A) ISÓTOPO RADIACTIVO  Nucleótidos que contienen isótopos radiactivos • Fósforo-32

• Tritio (3H)
Técnicas de hibridación en filtro
• Fluoresceína
B) FLUOROCROMOS  Nucleótidos que contienen fluorocromos en la base nitrogenada • Cianinas
Técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) • Alexa´Fluor

C) ENZIMAS  Nucleótidos que contienen enzimas específicas que catalizan una reacción para su detección.

MARCAJE INDIRECTO
Marcador + Molécula + Sonda

A) HÁPTENOS  Se acopla a una macromolécula unida a la sonda Digoxigenina + Biotina + Sonda

Estreptavidina + Biotina + Sonda
Técnicas de hibridación in situ cromogénica (CISH)

Ariadna Medina
El marcaje de las sondas
MÉTODOS DE MARCAJE
1. Desplazamiento de mella (Nick Translation)
• Se utiliza para marcar tanto sondas de
ADN de doble cadena como genomas
completos.
• Necesario:
o ADN bicatenario cromosómico
o ADNasa I (corta el ADN por sitios
aleatorios)
o ADN polimerasa I de E. coli
(exonucleasa y polimerasa), elimina
nucleótidos desde el corte y
seguidamente añade los 4 tipos de
nucleótidos (uno de ellos marcado)

Ariadna Medina
El marcaje de las sondas
MÉTODOS DE MARCAJE
2. Cebadores aleatorios (Random priming)
• Consiste en:
1. Desnaturalización por calor del ADN
2. Hibridación con hexanucleótidos que
poseen todas las combinaciones
posibles de seis nucleótidos (marcados
y sin marcar).
3. Los extremos 3’OH de los
hexanucleótidos híbridos actúan como
cebadores
4. ADN polimerasa del fragmento de
Klenow incorpora más nucleótidos.

La unión del cebador es aleatoria

Ariadna Medina
El marcaje de las sondas
MÉTODOS DE MARCAJE
3. Marcaje con transferasa terminal (end blending)
• Cse usa para marcar fragmentos de ADN
muy pequeños (100-200 pb)
• Se necesita:
1. En el extremo 5’ se añade fosfatasa
que elimina el grupo fosfato de 5’.
2. Se añaden nucleótidos marcados con
32P
3. La enzima nucleótido quinasa añadirá
el grupo fosfato marcado a los
extremos 5’ OH

Ariadna Medina
Procedimiento de hibridación
ETAPAS DEL PROCESO DE HIBRIDACIÓN

1 Pre- 2 3 Post- 4 Detección y

Hibridación
hibridación hibridación visualización
Preparación de la Formación del híbrido Conservar híbrido Detección de la sonda
muestra y soporte sonda-diana sonda-diana y revelado de
+ resultados
Eliminar híbridos
imperfectos

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
Captura del híbrido • Sonda + Sec. Diana disueltas  cinética rápida
MEDIO LÍQUIDO • Detección: Indirecto + pocillos-Microtiter
• Ventajas: Análisis múltiple / cuantitativo
ADN ramificado • Aplicación: Diagnóstico microbiológico + virus

Dot-Blot /Slot- Blot

• Sonda + Sec. Diana inmovilizada

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Southern-Blot • Cinética de hibridación: lenta
SEGÚN EL MEDIO MEDIO SÓLIDO • Marcaje: Depende de la técnica
Northern- Blot • Ventajas: Análisis simultáneos / Sencillez
• Aplicación: Diagnóstico de enfermedades

Microarrays
• Sec. Diana en ubicación natural
IN SITU Fluorescente (FISH) o Cromosomas metafásicos / céls / tejds
• Marcaje: Depende de la técnica
• Aplicación: Mutaciones / cáncer

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO

CARÁCTERÍSTICAS
• El híbrido sonda/secuencia diana se forma en solución. Normalmente en pocillos de una placa
microtiter. Después se fija a la pared del pocillo para detectarlos.
• Muestra: ADN o ARN en disolución
• Hibridación: ADN o ARN en disolución + sonda en disolución
• Cinética: rápida

VENTAJAS
• Análisis simultaneo de múltiples muestras
Captura del híbrido
APLICACIONES. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
 Estudio de la estructura del ARNm EN MEDIO LÍQUIDO
empleando una nucleasa S1 AN ramificado
 Detección de virus

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO CAPTURA DE HÍBRIDO

• Técnica que permite la detección de híbridos heterodupleX (ADN-ARN)

o Secuencia diana es ADN= Sonda ARN
o Secuencia diana es ARN = Sonda ADN
• Método de detección del híbrido: Indirecto  ANTICUERPOS

APLICACIONES.
 Detección de VIH, VPH, VHB, VHC

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO CAPTURA DE HÍBRIDO

Lisis cápsida del virus + Captura del

Desnaturalización del ADN
Hibridación
híbrido
Detección Revelado

↑ ºC Mezclar la secuencia Pasar mezcla a pocillos. Añadir Añadir sustrato

↑ pH diana (ADN) + sonda Pared con anticuerpos anticuerpos quimioluminiscente
Solución alcalina marcada (ARN) Incubación y retención marcados con
Fosfatasa Alcalina

Formación de heteroduplex

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO ADN RAMIFICADO

• Técnica conocida como BRANCHED AND (bADN)

• ¿EN QUE SE BASA?  En hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen la secuencia diana de ADN o
ARN y las secuencias introducidas a la reacción para amplificar la señal.
• Método de detección: Indirecto  Anticuerpos

CARACTERÍSTICAS DE LA TÉCNICA. Sonda Extensión

o Los pocillos están recubiertos de oligonucleótidos de captura
o Sondas:
 Sondas de Captura (anclada al microtiter) = unión al Oligonucleótido de captura + ADN (viral)
 Sonda de Extensión (preamplificador) = Unión ADN (viral) + Oligonucleótido preamplificador

APLICACIONES.
 Cuantificación de la carga genética en Sonda Captura
pacientes con VIH, VHB y VHC.

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO ADN RAMIFICADO

Lisis cápsida del virus + Captura del PreAmplificar Detección +

Hibridación
Desnaturalización del ADN híbrido + Amplificar Revelado

↑ ºC Mezclar la secuencia Pasar mezcla a pocillos. Antes de Se añaden oligonucleótidos

↑ pH diana (ADN o ARN) + los Pared con anticuerpos amplificar se marcados con fosfatasa
Solución alcalina dos tipos de sondas el híbrido queda unido a añade al pocillo un alcalina (que se unen a los
• Captura + extensión la pared de los pocillos oligonucleótido amplificadores)
Incubación y retención preamplificador. + Sustrato
quimioluminiscente

Luego se añaden oligonucleótidos amplificadores que contienen

numerosas secuencias cortas repetidas que se unen a los
preamplificadores, construyendo ramas de amplificación de señal y a
pequeñas secuencias de oligonucleótidos marcados con fosfatasa
alcalina.

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO LÍQUIDO ADN RAMIFICADO

Lisis cápsida del virus + Captura del PreAmplificar Detección +

Hibridación
Desnaturalización del ADN híbrido + Amplificar Revelado

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO

CARÁCTERÍSTICAS
• Técnicas sencillas, versátiles y que permiten el estudio de varias muestras.
• Secuencia diana O la sonda ESTÁN inmovilizadas en soporte sólido previo a la hibridación.
• Cinética: lenta

Dot- Blot / Slot-Blot

Southen blot ADN DIANA FIJADA

TÉCNICAS DE
HIBRIDACIÓN EN
MEDIO SÓLIDO
Northen blot ARN

Microarrays
SONDA FIJADA
(BIOCHIPS)

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO DOT-BLOT / SLOT-BLOT Dot-Blot  Aplicar muestra gota a gota sobre el soporte
Slot-Blot  Aplicar muestra en manchas alargadas sobre soporte
• Técnica rápida y económica.
• Permite detectar de forma sencilla:
o Una proteína de interés
o Ácidos nucleicos en una muestra
o Secuencias de interés de forma simultanea en múltiples muestras

APLICACIONES. MATERIAL NECESARIO.

 Detección de ARNm  Soporte sólido  Membranas
 Detección de virus o parásitos de Nitrocelulosa o de Nailon
 Determinación del sexo  Sondas
 Detectar oligonucleótidos mutados  Directas  radiactivas
 Control de calidad de la PCR o sondas  Indirectas  Haptenos

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO DOT-BLOT / SLOT-BLOT
PROCEDIMIENTO

Aplicar muestra al soporte 1. Fijar la muestra (ADN o ARN) al

soporte de nailon o nitrocelulosa
previamente humedecida con
Pre-hibridación buffer.
2. Colocar la membrana debajo de la
plantilla con los pocillos numerados
Hibridación 3. Depositar las muestras
desnaturalizadas en los pocillos
4. Aplicar cámara de vacío (para fijar
Lavado
ácidos nucleicos). También se
realiza con luz UV
5. Lavado con 2x tampón SSC
Detección

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO DOT-BLOT / SLOT-BLOT
PROCEDIMIENTO

Aplicar muestra al soporte 1. Someter a la muestra a una

solución pre-hibridación sin
sondas.
Pre-hibridación
o SSC
o Solución Denhart  regula pH
o EDTA
Hibridación o ADN carrier (esperma de salmón)
 bloquea las uniones
inespecíficas de los ác. nucleicos
Lavado a la membrana

Detección

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO DOT-BLOT / SLOT-BLOT
PROCEDIMIENTO

Aplicar muestra al soporte

Pre-hibridación
1. Desnaturalización de las muestras
2. Retirar solución pre-hibridación.
3. Añadir solución de hibridación + sondas desnaturalizadas
Hibridación
4. Se incuba con agitación continua (4-24h)

Lavado 1. Se realizan 2-3 lavados con SSC

Detección 1. Se detectan los híbridos formados mediante:

o Haptenos: se observan manchas coloreadas
o Moléculas radiactivas
Puntos negros  Hibridación positiva

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO COLONI BLOT

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO SOUTHERN-BLOT

• Técnica para detectar e identificar fragmentos de ADN desnaturalizados y separados por tamaño mediante
electroforesis.
• Posteriormente el resultado de la electroforesis son transferidos a una membrana de Nailon.
• Cada ADN queda atrapado al Nailon y es entonces cuando se puede hibridar con la sonda para ser detectada.

MATERIAL NECESARIO.
 Soporte sólido  Membranas de Nailon
 Sondas
 Directas  radiactivas

APLICACIONES.
 Estudiar estructura y función de genes
 Detectar mutaciones estructurales 
Enfermedades
Se necesita ELECTROFORESIS PREVIA A LA HIBRIDACIÓN

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO SOUTHERN-BLOT
PROCEDIMIENTO

Digestión enzimática El ADN se corta mediante enzimas de restricción

o Gel de poliacrilamida
Electroforesis en gel Se separan los fragmentos según tamaño. Mediante:
o Agarosa (recomendable)

Transferencia a la membrana El resultado de transfiere por capilaridad a un soporte absorbente tras incubación
y se fija con calor o UV

Hibridación Se incuba la membrana con la sonda específica.

• Mediante: Solución pre-hibridación + ADNcarier
A continuación se lava para eliminar la sonda no hibridada
Detección y revelado
Se detecta mediante radiografía

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO SOUTHERN-BLOT
PROCEDIMIENTO

Digestión enzimática

Electroforesis en gel

Transferencia a la membrana

Hibridación

Detección y revelado

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO NORTHERN-BLOT

• Técnica para detectar e identificar fragmentos de ARN desnaturalizados y separados por tamaño mediante
electroforesis.
• DIFERENCIAS SOUTHERN-BLOT Y NORTHERN-BLOT:

SOUTHERN-BLOT NORTHERN-BLOT
Digestión enzimática SI NO
Electroforesis SIN formaldehído CON formaldehído
Desnaturalización SI NO

APLICACIONES.
 Análisis de expresión génica ARN

 Detectar mutaciones

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO MICROARRAYS (BIOCHIPS)

• Los Biochips son miles de sondas depositadas sobre una matriz sólida.
• La técnica consiste en marcar el ADN del paciente con el fluorocromo
C3 (verde) y el ADN control con el fluorocromo C5 (rojo). De tal forma
que al añadir ambos ADN marcados al array (que contiene
oligonucleótidos complementarios a ambos ADN), los ADN tratarán de
hibridar para unirse a su oligonucleótido complementario.

APLICACIONES. MATERIAL NECESARIO.

 Detectar alteraciones genómicas • Molécula anclada al soporte  Sonda no marcada
 Compara ADN muestra vs ADN sano • Molécula a estudiar  Molécula diana si marcada
 2 fluorocromos de ADN o ARN
 rojo (deleciones) • Marcaje  Fluorescencia
 verde (duplicaciones) • Soporte  Microchips
 Expresión genómica ¿qué genes se expresan?

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO MICROARRAYS (BIOCHIPS)
PROCEDIMIENTO

Marcaje de la muestra El ADN del paciente se marca con C3 y el ADN control con C5
Añadimos los ADNs al array

Hibridación + Lavado Los fragmentos hibridan con las sondas

Lectura de microarray El microarray se escanea y se mide la fluorescencia

Hay la misma intensidad de hibridación de ambos ADN  no hay

Análisis + Interpretación Color amarillo alteración en la muestra del paciente.
Hay más hibridación de la muestra del paciente que la del control  indica
Color verde que hay ganancia de material genético en la muestra del paciente.
Hay menos hibridación de la muestra del paciente  indica que el
Color rojo paciente tiene una pérdida del material genético

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
MEDIO SÓLIDO MICROARRAYS (BIOCHIPS)
PROCEDIMIENTO

Marcaje de la muestra

Hibridación + Lavado

Lectura de microarray

Análisis + Interpretación

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
IN SITU

CARÁCTERÍSTICAS
• Técnicas que permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos sobre cromosomas metafásicos,
células y tejidos (in situ).
• La hibridación de ác. nucleicos se realiza sobre extensiones citológicas o secciones de tejido.
o Secuencia diana  en ubicación natural
• Marcaje:
 Fluorocromos  FISH
 Haptenos  CISH

Fluorescente (FISH)

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
IN SITU
Cromogénico (CISH)

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
IN SITU HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE (FISH)

• Técnica en la que la sonda se marca con reactivos

fluorescentes que permiten su visualización con luz UV.
 Secuencia diana: ADN / ARN
 Marcaje de sondas: Directa  Fluorocromos
 Detección: microscopio de fluorescencia

VENTAJAS APLICACIONES.
Se pueden usar varios tintes  Detección de mutaciones (pequeñas)
fluorescente para detectar  Posicionar genes
numerosas alteraciones  Mutaciones numéricas
 Conocer integridad de cromosomas
 Averiguar los cariotipos

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
IN SITU HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE (FISH)

TIPOS DE SONDAS UTILIZADAS EN FISH CONVENCIONAL.

Sondas específicas de gen o locus (LSI) Sondas centrométicas o de ADN satélite (CEP)
Hibridan con una secuencia única de ADN (son específicas de un Hibridan en regiones repetitivas de la región centromérica del
locus determinado). cromosoma.
Permiten detectar reordenamientos estructurales, deleciones y Permiten detectar cromosomas concretos e identificar
duplicaciones. alteraciones de tipo numérico (monosomías, trisomías)

FISH de una sonda de locus específico para el gen SRY marcada

con fluorocromo verde y una sonda control locus Yq11.23 rojo

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
IN SITU HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE (FISH)

TIPOS DE SONDAS UTILIZADAS EN FISH CONVENCIONAL.

Sondas subteloméricas Sondas de pintado cromosómico (WCP)

Hibridan en regiones cromosómicas próximas a los telómeros. Hibridan los dos cromosomas completos que forman el par de
Contienen secuencias únicas que son específicas de cada homólogos.
cromosoma. Permiten detectar de forma rápida alteraciones numéricas y
Permiten la detección de anomalías cromosómicas que implican estructurales, como translocaciones.
regiones teloméricas

Ariadna Medina
Técnicas de hibridación
IN SITU HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE (FISH)

Fijar y preparar muestra en Contratinción

Hibridación Lavado Visualizar
portaobjetos (DAPI)

• Extensión de la muestra • Desnaturalizar el Sumergir el Tinción con Visualizar a

celular. ADN  incubar portaobjetos contraste DAPI través del
• Envejecimiento de la a 72º (5 min) en una solución • Marcador microscopio de
preparación  3 días a tª • Añadir sonda e de lavado fluorecente fluorescencia.
ambiente o a 90º durante hibridar en para ADN
10 min. cámara húmeda
• Deshidratación de la (hibridizador)
exensión con etanol 70,85
y 100% 1min
• Dejar secar la preparación. Azul  DAPI (núcleo)
Verde  gen HER2 (cáncer de mama)

DAPI (Diamino Fenil Indol)

Ariadna Medina