Muestras
La genética Forense trabaja a través de la comparación de muestras. Por eso, podemos
distinguir 2 tipos de muestras:
TIPOS DE MUESTRAS SEGÚN SU PROCEDENCIA
Muestras Indubitadas. ADN de referencia, que se conoce a quien pertenecen.
Muestras Dubitadas o de referencia. Son aquellas de procedencia desconocida, y se quiere
conocer si coinciden con las muestras indubitadas.
de víctima: Restos biológicos del cuerpo del fallecido: sangre, saliva, tejidos, huesos, dientes,
etc. Restos biológicos del fallecido que permanezcan en el ámbito familiar: saliva (cepillo de
dientes, sobres, sellos, colillas), restos epiteliales (maquinillas de afeitar).
[Link] de familiares: Restos biológicos de familiares directos del fallecido: padres, hijos…
(Sangre o saliva)
[Link] de sospechoso: Sangre o saliva. Normalmente se toma muestra de saliva. Esta se puede
tomar mediante torunda o mediante Tarjeta FTA. (Las tarjetas FTA *contienen productos
químicos que lisan las células, desnaturalizan las proteínas y protegen los ácidos nucleicos de
las nucleasas, la oxidación y los daños causados por radiación UV. Estas tarjetas inactivan
rápidamente organismos, como los patógenos de transmisión hemática, e impiden el
crecimiento de bacterias y otros microorganismos)
MUESTRAS DE ORIGEN HUMANO.
-TIPOS DE MUESTRAS SEGÚN TEJIDO
• Sangre En ropas, armas, efectos, suelos, etc.
• Esperma Puede plantear problemas al encontrarnos mezclas. El perfil genético de la víctima y
del presunto agresor. • Saliva Se asientan sobre filtros de cigarrillo, chicles, cepillos de dientes,
sobres y sellos, vasos, latas, botellas, pasamontañas, etc.
• Pelos Pelos aptos: arrancados. Pelos no aptos: caídos. Importante determinar si es humano.
El ciclo de crecimiento del pelo consiste de tres etapas que se describen a continuación: Fase
Anagénica (o etapa de crecimiento): el folículo se desarrolla y se produce la fibra de pelo. Esta
fase puede durar entre 7 y 94 semanas, dependiendo de la región anatómica donde se
encuentre y crece a razón de 0,22-0,52 mm por día o 0,6-1,4 cm por mes. Fase Catagénica (o
etapa de regresión): cuando la actividad del bulbo folicular se detiene y la zona papilar se
contrae mientras el folículo alcanza la fase de descanso o etapa Telogénica. Fase Telogénica:
En esta etapa el pelo deja de crecer completamente y comienza a caerse. Luego de ésta, el
pelo entra a un nuevo ciclo de crecimiento, el cual se ve afectado por factores tales como la
raza, deficiencias nutricionales y la edad. El pelo de la cabeza de un adulto esta un 85% del
tiempo en fase anagénica y el 15% restante en fase de descanso.
• Uñas Para la identificación o uñas de la víctima por si ha mediado lucha
• Tejidos. Músculos u Órganos. Para identificación de cadáveres Elección de zonas no
afectadas (putrefacción o carbonización) Bazo e hígado mayor cantidad de ADN pero muy
perecederos Músculo esquelético: 10-20 gr.
• Restos Óseos Las piezas esqueléticas de elección para los análisis de ADN son
preferentemente las piezas dentales de apariencia exterior intacta, y los huesos largos (fémur,
tibia), por presentar una gruesa cortical en la diáfisis con abundante tejido óseo compacto.
• Dientes Darán mejor resultado aquellos que no tienen tratamientos dentales, con las raíces
intactas. En general, los que aún se encuentren incluidos en los alvéolos del hueso estarán
mejor conservados
• Restos Celulares Prendas de vestir: zonas de rozamiento (cuello, puños y axilas)
Empuñaduras de armas Cascos de moto y gorras: en zonas de contacto con la frente Guantes
TÉCNICAS DE ANÁLISIS
6.1 PRELIMINARES Orientadas a conocer y determinar la naturaleza de la muestra. Partimos de
una Evidencia y cabe preguntarse… ¿Es sangre?
Pruebas de Orientación: Destinadas a poner en evidencia la presencia de sangre en la muestra:
a) Adler a la Bencidina: se trata de una prueba no especialmente especifica, ya que puede dar
falsos positivos, pero frente a esa falta de especificidad oponen una gran sensibilidad. Son
capaces de demostrar trazas de sangre a diluciones 1:[Link]: Se basan en la
presencia en la sangre de peroxidasas, enzimas que son capaces de descomponer un peroxido,
en este caso el agua oxigenada, en oxigeno que oxida a la Bencidina (leucobase), la reacción es
la siguiente: Bencidina (Marrón) SANGRE (enz. Peroxidasas) + H2O2 H2O + O Bencidina (azul-
verdoso) El oxígeno desprendido, en contacto con las peroxidasas de la sangre hace que la
bencidina tome un color azul-verdoso.
Preparación: Se disuelve la bencidina a saturación en Ácido Acético glacial. La reacción ha de
ser inmediata a la aplicación de las gotas de H2O2, ya que la bencidina se oxida también por el
oxígeno del aire. Una segunda aplicación sobre una muestra de resultado negativo, nos puede
dar un falso positivo.
La prueba es concluyente exclusivamente cuando es negativa..
Valor de la prueba: La prueba solo tiene valor cuando es negativa, su gran sensibilidad permite
excluir que la negatividad de la prueba se deba a escasez de sangre (falta de concentración). En
cambio la reacción positiva no implica que sea sangre porque cualquier muestra con
peroxidasas catalasas nos va producir igualmente la reacción de oxidación. Esta prueba debe
realizarse SIEMPRE en campana de seguridad biológica. En caso de que el efecto no pueda ser
introducido en la misma para la realización de la prueba y haya de hacerse fuera de campana,
se realizara fuera de la misma mediante una torunda impregnada en la preparación de Adler, y
se pondrán la mascarilla todos los usuarios de la sala. Esto es debido a que la Bencidina es un
compuesto cancerígeno de tipo 1 (Hay estudios suficientes que demuestran la relación directa
de su utilización y la aparición de cáncer).
Pruebas de Certeza: Absolutamente especificas. Se basan en poner de manifiesto algún
elemento característico de la sangre, en este caso la Hemoglobina.
a) Cristales de Teichman: es una prueba cristalográfica. Se basa en la existencia de ciertos
derivados de la Hemoglobina que tienen tendencia a cristalizar, en este caso el Clorhidrato de
hematina y el hemocromógeno
.Fundamento: Se trata a la hemoglobina en caliente con un ácido orgánico (ac. Acético glacial),
lo que produce un desdoblamiento de esta en hemo y globina a la vez que se oxida el hierro
del grupo hemo que en presencia de una sal halogenada (cloruro) se forman cristales de
clorhidrato que son visualizados al microscopio óptico.
Método: - En principio se realizaba calentando la sangre solamente con Ácido Acético hasta
llevar a ebullición, repitiendo la operación de ebullición 4 o 5 veces se observan los cristales de
Teichman al microscopio por cristalización con el cloruro sodico existente en la propia sangre.-
Modificación: Reactivo de Gabriel-Bertrand donde se añade una sal halogenada junto con el
Ácido Acético para forzar la reacción. La observación microscópica de la preparación muestra
unos cristales de forma prismática alargada de color pardo oscuro.
Es recomendable el uso de la campana de seguridad biológica para efectuar dicha reacción y
evitar aspirar los vapores cuando se somete el portaobjetos al calor. La valoración de la prueba
irá en función de la concentración de hemoglobina que presente la muestra.
¿Es esperma? Orientadas a conocer y determinar la naturaleza de la muestra, en este caso,
esperma humano. Consideramos cuatro pruebas, la luz forense, el test colorimétrico, el
inmunotest y la visualización de espermatozoides, que se definen a continuación según el
orden que debe seguirse:
a) Luz forense de 495 nanómetros, para detectar la presencia de posibles manchas de
esperma. Se basa en la fluorescencia emitida por las flavinas, presentes en gran cantidad en el
esperma humano. La coloración de las manchas bajo la luz láser es blanquecina y el aspecto
denso, con difusión cromática desde el centro hacia la periferia de las mismas (menos densas
hacia el exterior de la mancha). Pueden darse falsos positivos (orina, sudor, lejía, flujo vaginal),
así como falsos negativos, en casos de telas con elastano u otras fibras de color negro que
puedan absorber la fluorescencia emitida.
b) Test colorimétrico de la fosfatasa ácida, Dicha enzima está muy presente en el esperma,
siendo su actividad enzimática muy alta. Para ello se utiliza una solución de ácido alfa-naftil-
fosfato en tampón citrato, con la que se impregnan las muestras a comprobar, de tal forma
que la muestra quede sumergida en la solución. La preparación consiste en tomar con una
espátula aproximadamente media cucharita de espátula de polvo de naftil y añadir con una
pipeta Pasteur 1 mililitro hasta llenar el eppendorf, resuspender para diluir completamente. Se
añaden un par de gotas a todas las muestras a testar. Tras diez minutos, se añade una gota de
una solución de azul sólido en tampón citrato (preparada de la misma forma que el naftil),
debiendo tornarse de color violáceo en caso de presencia de esperma. Pueden obtenerse
falsos positivos o bien coloraciones intermedias, debido a que otros fluidos, como la sangre o
los flujos vaginales, también poseen fosfatasa ácida, aunque en menor cantidad.
c) Visualización de espermatozoides mediante tinción con eritrosina amoniacal. Dicha tinción
permite visualizar espermatozoides y células diploides y realizar un contaje por campo visual.
En caso de individuos azoospérmicos, esta prueba será negativa, puesto que no se visualizarán
espermios. En caso de que sea positiva, la certeza es del 100 %. La preparación se realiza sobre
un porta, deshilachando (foto izq. inferior) con agujas o bisturís una mínima porción de la tela,
torunda o una mínima cantidad de lavado vaginal, impregnados en 10 microlitros de agua
miliQ autoclavada. Después, se deja secar y se añaden 8-10 microlitros de eritrosina
amoniacal, se coloca un cubre y se visualiza a microscopio óptico Una de las consideraciones a
tener en cuenta en la visualización a microscopio óptico es la diferencia entre espermatozoides
y bacterias de la propia flora vaginal o bien otros tipos celulares (procedentes de infecciones).
¿Es saliva? Pruebas de Orientación Test de la Amilasa salival con PHADEBAS Fundamento. La
pastilla esta compuesta por un almidón que lleva incluida en su estructura un colorante. En
presencia de saliva, degrada el almidón y el colorante se libera en el medio. Al leerlo veremos
el medio azul oscuro. Si no hay saliva, el almidón no se degrada y el colorante no queda en el
medio. Al leerlo lo veremos transparente.
. Lo siguiente que cabe preguntarse es ¿la evidencia es HUMANA? En ese caso se realizan
estudios de Individualización mediante Estudios de ADN
SIGUIENTE
MARCADORES GENETICOS más del 90% Dado que es imposible estudiar todo el ADN se
estudian distintos fragmentos de la molécula de ADN, que vamos a denominar marcadores.
Estos deben de ser Polimórficos, es decir que exista variación entre personas. Con el estudio
de varios marcadores finalmente llegamos a la obtención de un perfil genético del individuo.
El ADN minisatélite y microsatélite, que son los marcadores utilizados con fines forenses,
consisten en repeticiones de fragmentos de ADN de número variable, por lo que
genéricamente se denominan VNTR ("variable number of tandem repeats"). La
repeticiones en el ADN microsatélite son de tamaño pequeño (de 2 a 6 pares de bases)
por lo que se suelen denominar STRs ("short tandem repeats"). Las repeticiones en un
locus minisatélite tienen un tamaño entre 15 y 50 pares de bases para un total de 300
bp hasta 20 Kb. El tamaño total de los STRs es de 50 bp a 500 bp
En el campo forense utilizamos básicamente STRs de 4bp y 5bp en la unidad de
repetición. Los de menos repeticiones son muy propensos a artefactos (bandas
tartamudas) lo que dificulta la interpretación de perfiles de ADN obtenidos a partir de
mezclas de diferentes individuos.
Además de los STRs en cromosomas autosómicos son de gran importancia los STRs
de cromosoma Y particularmente para el caso de agresiones sexuales.
También, como ya veremos no sólo el ADN nuclear es interesante, sino que desde el
punto de vista forense es de gran importancia forense el análisis de ADN mitocondrial
(regiones hipervariables HV1 y HV2 en el bucle D) pues es más eficaz en muestras
degradadas y es el único polimorfismo que se puede analizar en cabellos sin bulbo,
que son vestigios que aparecen con mucha frecuencia en la escena de delitos
El ADNmt se presenta como un marcador con múltiples aplicaciones en el
campo de la Genética Forense debido fundamentalmente a su modo de herencia, su
elevada tasa de mutación y a la existencia de miles de moléculas por célula, lo que
permite su estudio en condiciones en las que el material biológico a analizar se
encuentra en mal estado o en cantidad insuficiente para estudiar cualquier otro
marcador nuclear.
siguiente
Las técnicas empleadas en genética forense están principalmente basadas en la determinación
de fragmentos y secuencias de ADN. Las muestras que normalmente se encuentran en el
campo de la criminalística no suelen ser el material idóneo para trabajar con las técnicas
clásicas de biología molecular. Con mucha frecuencia el ADN que se consigue de estas
muestras tiene unas características que hacen necesario el desarrollo de nuevos protocolos y
tecnologías para obtener resultados.
Las características del ADN en los casos de criminalística son: su bajo número de copias
(material biológico en escasa cantidad y dañado), fragmentación (segmentación del ADN en
distintos tamaños inferiores al inicial), inhibición (aparición de partículas que dificultan hacer
copias del contenido genético) y modificaciones estructurales en la secuencia de bases del
ADN10.
siguiente
Los grupos de investigación que se enfrentan a este tipo de ADN solucionan las dificultades
empleando nuevos procedimientos y tecnologías para solventar los problemas citados
anteriormente.
- Obtener la máxima cantidad de ADN posible: Es fundamental en este tipo de casos no perder
ADN de la muestra de partida11, ajustando los protocolos de extracción hasta el punto de
finalizar este tratamiento obteniendo una concentración de ADN similar a la de partida. Esto se
realiza mediante el uso de filtros concentradores o diseñando Kits específicos para cada
muestra de partida.
- Diseñar estrategias que reduzcan el tamaño del ADN problema: eliminando los problemas de
fragmentación del ADN, utilizando primers dentro de un pequeño rango en pares de bases o
diseñando parejas de primers o kit multiplex con rangos de amplificación no mayores a los
250pb12,13.
- Purificar el extracto de ADN: mediante detergentes, agentes quelantes, lavados con
soluciones hipotónicas, materiales absorbentes,
Dependiendo del tipo de iones o moléculas
que nos impidan que la amplificación del ADN de nuestra muestra, se procederá al tratamiento
adecuado con una técnica u otra14-16.
- Conocer los procesos que ocurren en el ADN antiguo y degradado10,17-19: las reacciones de
oxidación (cambios en los azúcares de las bases), la radiación, las reacciones hidrolíticas, los
procesos de degradación enzimática,... Resultados que pueden aparecer en este tipo de ADN:
mezclas o contaminación con otros ADN, pérdida de la heterozigosidad, uniones cruzadas de
fragmentos o fragmentos y primer, introducción de bases erróneas,... Este último punto ha
hecho que se estudien de manera exhaustiva los protocolos de amplificación y secuenciación,
número de ciclos, temperaturas, diseño de primers; características que debe de tener un
laboratorio forense y qué criterios de calidad debe seguir, así como, qué tipo de ADN y zonas
de éste, de toda nuestra dotación genética, son más útiles para la realización de un estudio
determinado.
SIGUIENTE
Análisis de polimorfismos de ADN mediante PCR
El análisis de polimorfismos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) solucionó muchos problemas y actualmente la mayoría de los vestigios
biológicos de interés criminal se analizan utilizando esta técnica.
La PCR es una técnica de amplificación in vitro de pequeños segmentos de ADN con
la que a partir de una cadena única se pueden hacer millones de copias, de modo que
el producto amplificado puede ser fácilmente analizado, incluso sin recurrir al uso de
sondas.
Básicamente la PCR consiste en una serie de ciclos que se realizan automáticamente
en un termociclador (baño termostático que proporciona temperaturas muy exactas a
gran velocidad). Cada ciclo consta de tres etapas: desnaturalización, acoplamiento
(“annealing”) de los cebadores(“primers”) y extensión, esto es creación de una cadena
complementaria de ADN con una polimerasa termoestable (Taq polimerasa). Los
cebadores son oligonucleótidos de cadena corta (unos 20 bp) que se sintetizan en
sintetizadores de oligonucleótidos. Una PCR típica para fines forenses tiene 28 ciclos
y no se suelen utlizar más salvo circunstancias excepcionales y controles estrictos
para monitorizar la contaminación.
Los polimorfismos de más interés analizables por PCR son los minisatélites y los
microsatélites (STRs), especialmente estos últimos que son los más utilizados.
Las grandes ventajas de los STRs son su estabilidad y la posibilidad de PCR multiplex
con las que se pueden amplificar varios loci mini o microsatélite simultáneamente a
partir de una muestra minúscula.
Los polimorfismos analizables por PCR antes de ser aceptados para la práctica
forense deben cumplir una serie de requisitos y pasar sucesivos controles de
validación.
SIGUIENTE
La prueba de ADN aplicada a criminalística tiene, como hemos visto hasta ahora,
cuatro etapas básicas:
1. Análisis laboratorial de la muestra, lo que incluye analizar el mayor número de
polimorfismos de ADN posible, obteniendo así un perfil genético de la muestra objeto
de análisis.
2. Comparación de los resultados con los obtenidos en el inculpado o en la víctima.
Ello implica que si aparece un vestigio biológico en la víctima la comparamos con el
análisis genético del agresor, o bien, si, por ejemplo, aparece una mancha de sangre en
el agresor la comparamos con la sangre de la víctima.
[Link] entonces ocurrir que los patrones sean diferentes en uno o más grupos con lo
que concluiremos que ese vestigio biológico no se corresponde con el individuo con el
que lo comparamos.
Pero puede suceder que los polimorfismos de ADN analizados en el vestigio se
correspondan con el individuo con el que se compararan. Entonces hay que valorar la
probabilidad de que ese vestigio provenga de ese individuo lo que depende de la
frecuencia de esos grupos en la población. La tercera etapa del análisis es pues la
valoración probabilística de la prueba en el caso de coincidencia de patrones.
15
4. Por último la emisión del correspondiente informe médico-legal y, en su caso, la
comunicación de los resultados en el juicio oral.
Estas etapas de análisis laboratorial que concluyen en el informe médico-legal tienen
un precedente básico que es la correcta recogida y envío del vestigio al laboratorio
médico-legal.
[Link]
MV_Lareu_clase_genetica_forense.pdf
[Link]
[Link]
%C3%[Link]/11df9b27-799f-f20b-e7bb-1724233b39d9?version=1.0
