UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
E. P. de BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA

PRUEBA DE VIRULENCIA BACTERIANA

Dr. CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ

 INTRODUCCIÓN

• Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno, son
propias y características:

 Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria, y se expresa

en un determinado equipo enzimático.

• La caracterización de las enzimas es una útil herramienta para la

identificación y clasificación bacteriana.
 INTRODUCCIÓN

• Los seres vivos son capaces de generar un sinnúmero de reacciones

químicas. A este conjunto de reacciones se le denomina “Metabolismo”:

 Las enzimas son las encargadas de catalizar las diferentes reacciones

metabólicas; éstas pueden ser intracelulares o extracelulares.

• Hay muchas pruebas bioquímicas donde se usan medios de cultivo para

analizar las actividades metabólicas de un microorganismo.
 INTRODUCCIÓN

• Las reacciones que se realizan más a menudo son la capacidad

fermentadora en carbohidratos (sacarosa, lactosa, glucosa):

 El medio TSI es muy usado para la identificación de Enterobacterias.

• Otras reacciones usadas, es la capacidad catabólica en aminoácidos y

urea, y la capacidad de producir:

 Enzimas hidrolíticas, oxidasas, lipasas, reductasas, amilasas, etc.

 OBJETIVOS

• Conocer e interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de

identificación bacteriana de mayor utilidad.
MATERIAL Y MÉTODOS
 MATERIAL Y MÉTODOS

• Medios de cultivo:

 Agar Mac Conkey en placa

 Agar Sangre de Oveja (ASO)

 Agar citrato de Simmons, en slant (inclinación)

 Agar de Kliger (Kliger Iron Agar: KIA) en slant.

 MATERIAL Y MÉTODOS

 Agar fenilalanina, en slant

 Agar manitol sal, en slant

 Caldo de triptona, con NaCl al 0,5 %, en tubo

 Caldo RMVP, en tubo

 MATERIAL Y MÉTODOS

• Reactivos:

 Para la prueba del citocromo c oxidasa

 Para la prueba de la catalasa

 Para la prueba de la fenilalanina desaminasa

 MATERIAL Y MÉTODOS

 Reactivo de Kovac

 Hidróxido potásico 0,1 M

 Alfa-naftol

• Cepas bacterianas:

 Cultivos de enterobacteriáceas y un cultivo de Staphylococcus o

Streptococcus.
 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

• Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características

metabólicas de las bacterias, objeto de identificación.

• Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la

presencia de una enzima preformada, y

 Su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas.

 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

• Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del M’o con una
incubación previa de 18 a 48 horas;

 A este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan

componentes metabólicos, o aquellas que:

 Determinan la sensibilidad de un M’o a una sustancia dada, tras

cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a
metabolizar.
 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

• No obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma

rápida, tras incubación de unas 2 – 6 horas;

 En general, se trata de reacciones enzimáticas cromogénicas, o

pruebas convencionales modificadas.
FUNDAMENTO E INTERPRETACIÓN
 AGAR SANGRE

• Es un medio general rico en nutrientes, por lo que permitirá el

crecimiento de una amplia variedad de bacterias.

 Además, es un medio diferencial, ya que permite comprobar si la

bacteria es capaz de hemolizar los eritrocitos del medio de cultivo.

 Si la hemólisis que se produce es total, se denomina beta hemólisis;

 Si es parcial alfa-hemólisis; y

 Cuando no existe, se habla de hemólisis tipo gamma.

AGAR SANGRE
 AGAR MAC CONKEY

• Es un medio selectivo, por contener sales biliares y cristal violeta, que

inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas.

• Es un medio diferencial, porque contiene lactosa y un indicador de pH,

 Las bacterias capaces de fermentar este azúcar producirán un cambio

en el pH del medio por la liberación de productos ácidos,

 Como consecuencia sus colonias aparecerán de color rosado. Las

colonias lactosa negativa son incoloras o translúcidas.
AGAR MAC CONKEY
 PRUEBA DEL CITOCROMO C OXIDASA

• Determinar la presencia o ausencia de estas proteínas proporcionará

información útil para la clasificación de grupos bacterianos.

• La prueba del citocromo C oxidasa, detecta la presencia de citocromo C

en la bacteria.

• Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamino de

oxidarse al ceder electrones al citocromo.
 PRUEBA DEL CITOCROMO C OXIDASA

• Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse

rápidamente en presencia del citocromo C, produciendo formas
coloreadas (azul).

• Esta prueba permite diferenciar el grupo de las Enterobacteriaceae (que

carecen de citocromo C) de Pseudomonas (que posee citocromo C).
 PRUEBA DE LA CATALASA

• En ambientes acuosos, que contienen oxígeno disuelto, como el

citoplasma celular, aparecen formas tóxicas derivadas del oxígeno:

 Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo

enzimático capaz de neutralizar estas formas tóxicas,

 Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el

peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.
 PRUEBA DE LA CATALASA

• La prueba de la catalasa es positiva cuando se ponen en contacto una

bacteria con actividad catalasa con peróxido de hidrógeno al 3 %, y

 Se producen burbujas de oxígeno.

• Esta prueba se emplea para diferenciar el género Staphylococcus

(catalasa positiva) del género Streptococcus (catalasa negativa).
PRUEBA DE LA CATALASA
 AGAR CITRATO DE SIMMONS

• Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato.

 Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio

como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de
pH.

 Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán

multiplicarse y, utilizarán los fosfatos, liberando iones amonio.
 AGAR CITRATO DE SIMMONS

• Esta liberación de iones básicos, junto con la eliminación del citrato

(ácido),

 Generará una fuerte alcalinización del medio, que se observará por un

cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
AGAR CITRATO DE SIMMONS
 PRUEBA DE LA FENILALANINA

• Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el

aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico,

 Por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la

consiguiente acidez resultante.
 PRUEBA DE LA FENILALANINA

• Se cultiva el M’o en agar fenilalanina, sembrando la superficie con

abundante inóculo, e incubando durante 12 – 16 horas,

 Seguidamente añadir 0,2 ml de una solución de cloruro férrico al 10%,

de manera que inunde todo el crecimiento.

• La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la

aparición de un color característico verde oscuro o verde azulado.
 AGAR DE KLIGER (KIA)

• Este medio diferencial complejo (de color tojo) es muy útil.

• Ya que demuestra varias características enzimáticas de la bacteria:

 Está compuesto principalmente por dos azúcares en distinta

proporción (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %),
 Tiosulfato sódico,
 Citrato férrico, y
 Rojo fenol como indicador de pH.
 AGAR DE KLIGER (KIA)

• Para estudiar el comportamiento de bacterias en condiciones de

aerobiosis y anaerobiosis,

 La siembra en este medio de cultivo se realiza tanto en la superficie

del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis).

• La información que podemos obtener es la siguiente:

 AGAR DE KLIGER (KIA) FERMENTACIÓN
DE LA GLUCOSA

• Viraje a color amarillo en el fondo del tubo. Si la bacteria fermenta sólo la

glucosa, en la superficie del agar, lo utilizará por vía respiratoria, y donde

 La tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña

proporción por vía fermentativa.

 Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie,

al no haber cambio de pH.
 AGAR DE KLIGER (KIA) FERMENTACIÓN
DE LA LACTOSA

• Viraje a color amarillo en la superficie de la parte inclinada del tubo.

 Si la bacteria, además, fermenta la lactosa, los ácidos producidos

modifican también el pH de la superficie del medio.

 Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiará a

amarillo.
 AGAR DE KLIGER (KIA) NO FERMENTACIÓN
DE LOS AZÚCARES

• La parte inclinada del tubo de ensayo no cambia de color.

• Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como, por ejemplo, el

género Pseudomonas, el medio permanecerá con su color original,

 En este caso, los azúcares son respirados, degradándose

completamente hasta CO2 que se elimina y no modifica el pH.
 AGAR DE KLIGER (KIA) PRODUCCIÓN GAS EN LA
FERMENTACIÓN

• APARICIÓN de:

 Burbujas,

 Rotura, o

 Elevación del agar del fondo del tubo.

 AGAR DE KLIGER (KIA) PRODUCCIÓN DE
ÁCIDO SULFHÍDRICO

• Se observará la aparición de un precipitado de color negro en el fondo

del tubo.

• Algunas bacterias anoxibiónticas son capaces de emplear el tiosulfato

sódico como aceptor final de electrones en la cadena transportadora,

 Como consecuencia, este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico,

que, a su vez, reacciona con el hierro (Fe2+) presente en el medio
formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.
AGAR DE KLIGER (KIA) PRODUCCIÓN DE
ÁCIDO SULFHÍDRICO

Resultados en agar Kliger (KIA)

A) Medio sin inocular.
B) Inoculado con Pseudomonas: K/K.
C) Inoculado con Shigella: K/A.
D) Inoculado con Serratia marcescens: K/A+ (gas)
E) Inoculado con Salmonella: K/A - ++++ (H2S).
F) Inoculado con Enterobacter: A/A.
G) Inoculado con Escherichia coli: A/A+ gas.

(A: ácido, color amarillo; K: alcalino, color rojo).

 AGAR MANITOL SAL

• Éste es un medio selectivo y diferencial muy utilizado para el aislamiento

e identificación de Staphylococcus aureus:

 La alta concentración de sal (NaCl al 7,5 %) le proporciona su carácter

selectivo,

 Ya que sólo este tipo de M’o osmotolerante y los M’os osmófilos

pueden multiplicarse en él.
 AGAR MANITOL SAL

• Además, en su composición el único azúcar presente es el manitol, que

únicamente:

 Son capaces de fermentar las cepas patógenas de este género

bacteriano, diferenciándolas así de las que no lo son.

• La producción de ácidos proveniente de la fermentación del manitol,

 Es detectada por un viraje del indicador de pH presente en el medio

(rojo fenol) a amarillo.
 AGAR MANITOL SAL

• Staphylococcus aureus, fermentador del manitol, crecerá en el medio

dando lugar a colonias grandes rodeadas de un halo amarillo,

 Mientras que Staphylococcus epidermidis, que no fermenta el manitol,

 Dará lugar a colonias pequeñas rodeadas de un halo púrpura

 A veces permite el desarrollo de Enterococcus faecalis, pero con

un crecimiento muy pobre).
AGAR MANITOL SAL
 PRUEBAS DEL INDOL

• Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima

triptofanasa en las bacterias:

 Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es el

compuesto que se detecta en este ensayo.

 Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva en un caldo

de triptona con NaCl al 0,5 %

 Este digerido de proteínas animales es especialmente rico en

triptófano.
 PRUEBAS DEL INDOL

• Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio el

reactivo de Kovac,

 Se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la

prueba será considerada positiva.

• El reactivo de Kovac contiene para-dimetilaminobenzaldehído, que:

 Puede reaccionar tanto con el indol como con el triptófano,

produciendo compuestos de coloración rojiza.
 PRUEBAS DEL INDOL

• Para evitar la interferencia del triptófano, el para-

dimetilaminobenzaldehído está disuelto en alcohol isoamílico, inmiscible
en agua.

• A diferencia del triptófano, el indol es soluble en alcohol isoamílico y, por

tanto,

• Sólo él reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado

característico de esta prueba.
PRUEBAS DEL INDOL
 PRUEBAS DEL ROJO DE METILO Y
VOGES - PROSKAUER

• Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azúcares pueden

realizar esto por distintas rutas.

• Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa

en dos fases:

 Primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica)

consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en

 Segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia

(fermentación).
 PRUEBAS DEL ROJO DE METILO Y
VOGES - PROSKAUER

• Esta fermentación puede ser de dos tipos:

 Fermentación ácido-mixta. Los productos finales son ácidos orgánicos

(ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol.

 Fermentación butilenglicólica. Los productos finales son compuestos

neutros como el butanodiol y el etanol,

 Produciéndose acetoína como intermediario.

 PRUEBAS DEL ROJO DE METILO Y
VOGES - PROSKAUER

• La liberación de ácidos orgánicos en el primer tipo de fermentación

 Generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado

añadiendo al medio un indicador de pH

 Como el Rojo de Metilo (rojo a pH de alrededor de 4,0).

 PRUEBAS DEL ROJO DE METILO Y
VOGES - PROSKAUER

• Si la fermentación que se ha llevado a cabo es del tipo butilen glicólica,

 La producción de acetoína puede ser detectada añadiendo al medio

KOH y alfa-naftol:

 Reaccionarán con este compuesto, produciendo un color rojo

característico.
PRUEBAS DEL ROJO DE METILO Y
VOGES - PROSKAUER
Tabla 1
Se resume cuándo se consideran positivos los resultados de las pruebas descritas.

.
RESULTADOS
Figura 01
Determinación de especies

Gram
negativos

Gram
positivos
 TINCIÓN DE GRAM - GRAM POSITIVO

• Esta especie es coagulasa y DNAsa positiva, produce ácido de la

lactosa, maltosa y manitol, reduce los nitratos,

 Hidroliza la urea y reduce el azul de metileno.

 Es por lo general fosfatasa positivo, aunque no crece en agar

fosfato de amonio.
 TINCIÓN DE GRAM - POSITIVO

• La mayoría de las cepas son hemolíticas en agar sangre de caballo,

 Pero la zona de hemólisis es relativamente pequeña si se compara

con el diámetro de la colonia.

 La producción de pigmento amarillo dorado es probablemente la

característica más variable.

 Los cultivos jóvenes pueden no producir ningún pigmento.

 TINCIÓN DE GRAM - POSITIVO

• Puede desarrollarse color si se dejan los cultivos uno o dos días sobre la
mesa del laboratorio a temperatura ambiente.

 Se favorece la producción de pigmento por la presencia en el medio

de lactosa o de otro carbohidrato y de sus productos de escisión.

 La mejor forma de demostrarlo es en agar glicerina monoacetato.

 TINCIÓN DE GRAM - POSITIVO

• Identificación:

 Las colonias de estafilococos en medios ordinarios son pardo doradas,

blancas, amarillas o rosas, opacas, copuladas,

 De 1 – 3 mm de diámetro tras 24 horas en agar sangre y por lo

general se emulsionan fácilmente. Pueden ser b - hemolítica en agar
sangre.
 TINCIÓN DE GRAM - POSITIVO

• Medio de Baird – Parker:

 Después de 24 horas, Staphylococcus aureus forma colonias negras,

brillantes, convexas, de 1 – 1,5 mm de diámetro;

 Hay un estrecho borde blanco y las colonias están rodeadas por

una zona clara de 2 – 5 mm de diámetro.

 Este aclaramiento puede hacerse evidente tan solo a las 36 hrs.

 TINCIÓN DE GRAM - POSITIVO

• Se examinan extensiones teñidas por Gram.

• Se realizan las pruebas de coagulasa y DNAsa sobre los cocos Gram –

positivos que crecen en racimos de la siembra de materiales clínicos.

• Este es un procedimiento abreviado: las cepas positivas para ambas

pruebas son probablemente S. aureus.
 TINCIÓN DE GRAM - NEGATIVO

• Shigella spp. son bacilos Gram negativos, no móviles y no formadores de

esporas.

 El examen microscópico de la materia fecal puede ser útil para

distinguir características diferenciales entre la disentería bacilar y

 La causada por parásitos como amebas.

Tabla 2
Diferencias entre disentería bacilar y amebiana

.
 PRUEBA DE INDOL

• En el tubo con agua de peptona (contiene triptófano) se siembra el

microorganismo problema.

 El medio no lleva glucosa porque aumenta la acidez e inhibe a la

enzima que degrada al aminoácido.

• Tras incubar entre uno y dos días se añade al cultivo 5 gotas de reactivo
de Kovac.

• Agitar el tubo suavemente y dejarlo en reposo unos minutos.

PRUEBA DE INDOL - RESULTADOS

Si el Indol es (+): aparece un anillo rojo en la superficie acuosa.

Si el Indol es (-): aparece un anillo amarillento.
Fuente: Google imágenes
 ROJO DE METILO

• Tubo de ensayo con el medio Clark y Lubs para sembrar el

microorganismo problema.

• Incubar de dos a tres días en estufa.

• Añadir 5 gotas de rojo de metilo (rojo a 4,5 y amarillo a 6,3)

 ROJO DE METILO - RESULTOS

• Cuando se acidifica el medio aparece color

rojo: Rojo Metilo (+).

• Los ácidos orgánicos siguen degradándose

hasta CO2 y se alcaliniza el medio,

 Aparece color amarillo: Rojo de Metilo (-).

Fuente: Google imágenes

 VOGES PROSKAUER

• En un tubo con medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo.

• Tras 2 días de incubación se añaden: 0,5 ml de potasa y 0,5 ml de alfa

naftol en este orden.

• Agitar e inclinar el tubo para favorecer la oxidación de la acetoína.

• Tras 10 - 15 minutos leer los resultados.

 VOGES PROSKAUER - RESULTADOS

• VP (+) : Aparece una superficie

rosada

• VP (-): La superficie queda

amarillenta-cobriza

Fuente: Google imágenes

 PRUEBA DE CITRATO

• Preparar el medio Citrato Simmons en tubo inclinado, se esteriliza y se

agrega en tubos que permanecerán inclinados hasta la solidificación.

• Se realiza la siembra en los tubos por picadura.

• Dejar los tubos con tapón de algodón para que se vaya el CO2.

• Tras esperar dos días se visualizarán los resultados.

 PRUEBA DE CITRATO - RESULTADOS

• Citrato positivo: Color azul intenso en la superficie del medio.

• Citrato negativo: No aparece color ni crecimiento.

Fuente: Google imágenes

 PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

• Las bacterias que presenten esta

enzima en su membrana dará positivo
en la prueba con la tira, aparecerá color.

• Las bacterias que no la presenten,

darán negativo: No aparecerá ningún
color porque no se produce la reacción.

Fuente: Google imágenes

 SIEMBRA EN LOS MEDIOS MAC CONKEY y LEVINE

• Preparar los medios de cultivo para esterilizarlos.

• Cuando se enfrían, agregar en las placas Petri en condiciones estériles.

• Pasadas 24 horas se siembran las muestras de M’os por agotamiento en

los medios. Se incuba a 37 °C por 24 horas.

• Se visualizan los resultados.

 SIEMBRA EN LOS MEDIOS MAC CONKEY y LEVINE

• En el caso del medio Levine, las

colonias verdosas metálicas son
características de E. coli.

• Las que son parduzcas y mucosas, son

de Enterobacter aerogenes, y las
transparentes de Salmonella y Shigella.

Fuente: Google imágenes

 SIEMBRA EN LOS MEDIOS MAC CONKEY y LEVINE

• Caso del medio Mc Conkey, las colonias rosadas son características de

E. coli, las rosadas y mucosas de Enterobacter aerogenes, y

 En el caso de aparecer colonias incoloras que no fermentan lactosa se

trataría de Salmonella, Shigella o Pseudomonas.

Fuente: Google imágenes

 OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN

• Preparar el medio agregando al medio Hugh-Leiffson, la solución al 10% de

glucosa en proporción 10%, por lo que al final queda una solución al 1%.

• Se toma un inóculo del M’o y se siembra en el tubo con Hugh-Leiffson

glucosado.

• La mitad de los tubos se sellan con vaselina para crear un medio anaerobio.

• Por picadura, se introducen los inóculos de microorganismos en los medios

anaerobios.
 OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN - RESULTADOS

• Cuando se forma ácido el

medio vira de verde a amarillo.

• Si aparece gas se forman

burbujas que pueden agrietar
el medio.

Fuente: Google imágenes

 PRUEBA CATALASA

• Con el asa de siembra se toma un inóculo y se introduce en el tubo que

contiene el peróxido.

• En el porta, se coloca una gota de peróxido y sobre la gota con el asa se

deposita el inóculo cogido.

• Tener precaución de no homogeneizar la muestra con el peróxido con el

asa porque puede catalizar la reacción.
 PRUEBA CATALASA - RESULTADOS

• Con algunos de los microorganismos

la prueba da positiva:

 Formación de burbujas de oxígeno

de forma inmediata.

• En otros la prueba de catalasa da

negativa: no aparece burbujeo.

Fuente: Google imágenes

 PRUEBA COAGULASA

• En tubo de hemólisis estéril, colocar 0,5 ml de plasma.

• Recoger un inóculo con dos o tres colonias y mezclar con el plasma.

• Mezclar por rotación suave del tubo.

• Introducir en el baño a 37 ºC e ir observando si se produce o no coágulo

en 30 minutos.
PRUEBA COAGULASA - RESULTADOS

• Se considera la prueba positiva si

aparece coágulo (Coagulasa +)

• Se considera negativa si no aparece

coágulo (coagulasa -)

Fuente: Google imágenes

 SIEMBRA EN AGAR SANGRE

• Se inocula una muestra representativa de la colonia y se siembra por

estría simple en la placa.

 Tras esperar un día se observan los resultados obtenidos y se ve que

las muestras que se sembraron producen hemólisis total o beta.
 SIEMBRA EN AGAR SANGRE - RESULTADOS

• Los M’os que se sembraron producen una

hemólisis total

 Porque se ha destruido el medio alrededor

del crecimiento bacteriano.

• Se puede deducir que las especies

pertenecen al género de los Estreptococos.

Fuente: Google imágenes

 SIEMBRA EN KIA

• Recoger de la colonia una muestra representativa.

• Inocular por picadura y estría en un tubo inclinado con medio Agar -

Hierro - Kliger (KIA)

• Incubar durante un día para realizar la lectura de los resultados.

SIEMBRA EN KIA - RESULTADOS

Fuente: Google imágenes

SIEMBRA EN KIA - RESULTADOS
.

Fuente: Google imágenes

Tabla 3
Resultados de todas las pruebas que se han hecho a las distintas muestras.
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Bailón, L., Cruz, R., & Cervantes, A. (2003). Atlas de pruebas bioquímicas para
identificar bacterias, 31-34. México, México. Recuperado el 30 de octubre de 2017.

• Becton, Dickinson and Company. (Abril de 2013). NSTRUCCIONES DE USO MEDIOS

EN PLACA LISTOS PARA USAR. BD Mannitol Salt Agar. Recuperado el 20 de
noviembre de 2017.

• Aquiahuatl, M., Volke, T., Prado, L., Shirai, K., Ramires, F., & Salazar, M. (2012). Manual
de prácticas de laboratorio de Microbiología general. 29. México. Recuperado el 30 de
Septiembre de 2017.