TALLER EXPERIMENTAL

“ESTUDIO ELECTROFISIOLÓGICO IN VITRO DEL NERVIO CIÁTICO DE BATRACIO”

Parte 1
*Un experimento “In vitro” se refiere a una técnica para realizar un determinado experimento
en un tubo de ensayo, o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.

Video 1.
Se accede al nervio ciático de la rana.
Como estimulo se utiliza la ligadura del extremo proximal del nervio ciático (estímulo
mecánico).
Como respuesta se obtiene, inmediatamente, un movimiento muscular de flexión en la
extremidad posterior ipsilateral de la rana.
La razones que explicarían el porqué de esta causa-efecto podrían ser que: -el nervio es una
estructura excitable que frente a un estimulo presenta una respuesta activa propagada; -existe
una transmisión neuro-muscular y –el músculo es capaz de contraerse (acoplamiento excito-
contráctil).

Para verificar estas hipótesis; los investigadores se proponen extraer el nervio para su estudio
IN VITRO y estimularlo para así observar y estudiar la respuesta.
En cuanto a la estrategia pensada…
-Ventajas: el estudio in vitro permite controlar las variables ambientales como la temperatura,
composición hidroeléctrica del medio, pH, etc.
-Desventajas: se necesita conseguir y apropiarse de un ser vivo; y al extraer una estructura
aislada del mismo, se deben controlar todas las variables para que permanezca estable y vivo.

En cuanto a utilizar un anfibio para este experimento…

-Ventajas: los anfibios son vertebrados como los seres humanos y tal vez más accesibles
éticamente para un estudio. (Es mas ético experimentar con un animal que este más abajo en
la escala filogenética).
Además, los anfibios son poiquilotermos, o sea que se adaptan a la temperatura del ambiente,
lo que sería una variable menos que controlar.

Video 2.
Se presenta el conjunto de componentes que constituye el dispositivo a través del cual se
procederá para realizar el experimento.
El estímulo es extracelular y bipolar.
El registro de la respuesta será extracelular, bitópico (contiene 2 registros) y diferencial (todo
el tiempo se ve la diferencia)
Referencias de la imagen:
1. Estimulador.
2. Caja para nervio.
3. Amplificador.
4. Conversor A/D (análogo/digital).
5. Computadora (permite adquisición y
almacenamiento de datos
1. El estimulador aplica un pulso eléctrico que consiste en un pulso rectangular de voltaje
(diferencia de voltaje entre cátodo y ánodo).
2. La caja para nervio contiene una serie de electrodos de Plata clorurada separados cada 0,5
cm y que atraviesan perpendicularmente las caras de la caja. Arriba es cubierta por un porta
objetos de vidrio.
3. El amplificador mide el potencial eléctrico extracelular entre 2 electrodos de registro (G1 Y
G2) ubicados en el extremo proximal del nervio y lo amplifica a través de la ganancia. O sea
que realiza el cálculo de la diferencia de potencial entre G1 Y G2 y lo multiplica por la ganancia
(que puede ser X10, x100, x1000, etc) para obtener así un valor de voltaje.
Da una señal analógica.
4. El conversor A/D convierte la señal analógica en digital. Al digitalizar la señal, esta puede ser
leída en la computadora.
5. La computadora puede almacenar, grabar y exhibir la señal digital.

*Electrodos de estimulación:
-Cátodo= electrodo con carga negativa; atrae a los cationes.
-Ánodo=electrodo con carga positiva; atrae a los aniones.
El hecho de utilizar un estímulo eléctrico y no mecánico en este experimento nos permite
tener una fuente controlable y medible. Este estímulo es innocuo.

Se realiza una calibración del dispositivo de registro para obtener una relación precisa entre la
magnitud de la señal y el signo. Se establece una diferencia de potencial entre G1 Y G2 tal que
G1 es negativo y se utiliza ese conocimiento como referencia. O sea que las deflexiones hacia
abajo en el gráfico simbolizan que el P.A está en el electrodo G1.
Video 3
Se procedió a estimular repetidamente el preparado con una frecuencia constante y al
digitalizarse las señales, se va viendo la amplitud y duración del pulso. Luego se puede hacer
un promedio de todos los pulsos y obtener uno solo.
Proceso:
-En el extremo distal del nervio se colocan los electrodos de estimulación. El cátodo se pone
por dentro y el ánodo por fuera. La estimulación es catódica porque el P.A se genera debajo
del cátodo.
-En el extremo proximal del nervio se colocan los electrodos de registro. G1 se pone por
dentro y G2 por fuera.

Respuesta: se obtiene una gráfica que muestra 2 tipos de señales (1 y 2).

-Señal 1: es una señal NO biológica. Esto se evidencia porque la latencia es casi 0.
-Señal 2: es una señal biológica. Tiene latencia.

Tres características de la señal biológica:

-Tiene una forma o deflexión negativa y luego positiva.
-No se invierte la polaridad cuando se cambia de lugar el cátodo y el ánodo.
-Tiene un período de latencia.
Latencia.
Es el tiempo entre que se estimula una estructura y se observa una respuesta.
Existen dos tipos:
-Latencia de generación es el tiempo que demora en generarse un P.A desde que se aplicó el
estímulo hasta que se generó.
-Latencia de conducción es el tiempo que demora en propagarse un P.A desde que se generó
hasta el lugar donde está el electrodo de registro. Se puede modificar con la distancia.

En la señal 2 (biológica) las deflexiones hacia abajo indican que las cargas negativas se acercan
a G1 y cuando esa “nube” de cargas negativas llega hasta G2, la grafica muestra una deflexión
hacia arriba.

Lo marcado en amarrillo representa el lugar por donde va el P.A en un momento dado.

Video 4
Se realiza nuevamente el experimento pero con un cambio; se invierte la polaridad del
estímulo. Por lo tanto, se invierten los electrodos de estimulación, o sea que ahora el cátodo
estará por fuera y el ánodo por dentro (conf. “A”).
Se observa que de esta forma, varía la latencia de conducción en la señal 2 (biológica) porque
se modificó la distancia (se aumentó) desde el cátodo (que es el que genera el P.A) hasta G1
(que es quien lo registra). Este cambio se ve en el trazado de la configuracion “A” donde la
latencia aumentó porque se aumentó la distancia.

Video 5
En la maniobra realizada en este video, se realiza el experimento nuevamente pero con otro
cambio. Ahora se intercambian los electrodos de registro; o sea que se invierte la posicion
entre G1 Y G2. (G1 estará por fuera y G2 por dentro).
Lo que se observa como respuesta en este caso, es que este cambio genera que se inviertan las
polaridades en ambos tipos de señales. Hay primero deflexiones hacia arriba y luego hacia
abajo (conf. “2”). Esto se da porque ahora el P.A llegará primero a G2 y luego a G1 (que es el
que genera deflexiones hacia abajo).

Parte 2
Fenómenos que subyacen a la propagación de un P.A en una fibra excitable.
Las fuentes y sumideros nos dan una idea del lugar o zonas por donde existen corrientes de
entrada y de salida en la fibra.
La fuente es el elemento capaz de generar una diferencia de potencial entre sus extremos, de
proporcionar una corriente eléctrica. Puede ser pasiva o activa.
Los sumideros son los lugares de entrada de corriente, por lo tanto de entrada de Na+.

Referencias:
1. Fuente activa dada por la salida de
K+ y una pequeña entrada de Na+.
2. Sumidero por la entrada de sodio.
3. Fuente pasiva por la salida de K+
Video 7
Se estimula el preparado pero ahora en vez de ser con pulsos constantes, se hace con pulsos
crecientes. En la siguien gráfica se muestran as señales obtenidas (en mV) y en la parte
inferior los estimulos aplicados (en mA y que fueron creciendo).

En la siguiente figura los tazados superpuestos se ven individualmente porque son

separados y asi podemos ver los cambios en las respuestas 1 y 2 (no biológica y biológica) a
medida que el estimulo va aumentando.

Resultados:
-A estímulos muy bajos se observan SOLO respuestas no biológicas pero no se ven respuestas
biológicas porque el estimulo no alcanzó el umbral para que se gener un P.A.
-Se observa que las señales no biológicas van dando respuestas mayores a estimulos mayores;
o sea que su comportamiento es lineal.
-Por otro lado, las respuestas biológicas llegan a una meseta en determinado momento. en
donde aunque el estímulo sea muy grande, no podran responder linealmente. Esto se debe a
que no hay mas fibras musculares que reclutar entonces no se puede seguir aumentando la
respuesta al estímulo.
La siguiente gráfica intenta mostrar los resultados:

Referencias:
1. Señal no biológica. Observamos que la pendiente arranca desde 0 porque con el mínimo
estímulo ya se obtiene una respuesta
2. Señal biológica.
a. Todavía no se ha reclutado ninguna fibra porque el estímulo no ha llegado a alcanzar el
umbral.
↓ La flecha corresponde al umbral.
[Link] que los estímulos son ahora supraumbrales, se comienzan a excitar las fibras.
c. Se llega a una meseta porque las fibras son saturables, o sea que en el momento en que
todas esten siendo excitadas, no podrán responder a más estímulos.

Podemos llegar a la conclusion de que el comportamiento de la señal biológica es “de todo o

nada” en una sola fibra pero no lo es si vemos todas las fibras en conjunto ya que ellas tienen
un comportamiento de aumento progresivo.

Video 8
En esta oportunidad, se agrega un par de electrodos de registro (G1 Y G2) que se
colocan mas cercanos a los electrodos de estimulación; o sea mas cercanos al extremo distal
del nervio.

Esto se realiza para poder medir exactamente la latencia de conducción sin involucrar a la
latencia de generación. Colocando estos electrodos de registro cercanos al inicio del P.A ya
generado, se podra medir solamente la latencia de conducción, es decir cuanto demora de
llegar de un par de G1 Y G2 al otro par.
Respuestas: -Se deduce que a mayor distancia entre que se produce el P.A y se mide con el
registro, mayor es la latencia de conducción. –Se observa un cambio morfológico en las ondas
(mas estiradas) que se da porque cuanto mas lejos se esta desde que se generó el P.A, mayor
es la diferencia de velocidad entre las fibras que conducen rapido y las que conducen lento,
hay como una desincronización.