Métodos y Técnicas de Tinción

Por Quistián Hylary

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una
superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a
la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
         Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
         Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas
o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien
ciertos reactivos complementarios para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente,
como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La
fijación produce generalmente encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace
que las células parezcan mayores de lo que son realmente.
Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

Tinción de Gram
1)      Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero con una
solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este
punto las células Gram positivas y Gram negativas, están teñidas de azul/violeta.
2)      El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico. El KI hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta. En este punto las células se mantienen iguales.
3)      Se inicia con la decoloración usando una solución de Alcohol-acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo I2-Cristal violeta. Algunos microorganismos no se decoloran. La
diferencia esencial entre los dos tipos de células es la resistencia que presentan ante la
decoloración.
Después de la decoloración las células Gram positivas son azul\violeta, y las Gram
negativas son incoloras.
4)      Para poner de manifiesto las células Gram Negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es de color rojo, como la safranina.
Tinción ácido-alcohol resistencia
1)      Se coloca sobre el portaobjetos una mezcla de fucsia-fenol, en la que la  fucsia  hace de
colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido-alcohol-
sensibles como las resistentes.
2)      Se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido-alcohol sensibles se
decoloren mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.
3)      Se utiliza un colorante de contraste, como el azul de metileno.
Tinción de Esporas
1)      Sobre el portaobjetos con la preparación se coloca “verde malaquita” que tiñe las células
de verde.
2)      Se lava con agua destilada con lo que las células quedan incoloras y las esporas verdes.
3)      Se usa safranina para obtener bacterias de color rojo/rosa mientras que las endoesporas
continúan verdes.
      

Por Ramírez Jessica

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y
por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos
colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología
todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en
un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar
estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o
fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias.
Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana
extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la
morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación
química con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se
utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de
procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une aciertas
estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común
la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los
responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos,
covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre
los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado
para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la
tinción negativa
se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio
circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.
OBSERVACIÓN “IN VIVO”
Método de la gota pendiente.
Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de organismos vivos, nos
proporciona información sobre la morfología, tamaño, color y movilidad de las bacterias.
Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una práctica que se utiliza
únicamente para la observación del movimiento.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas [Link] medios de cultivo líquido
(caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa  de siembra,
pipeta Pasteur, aceite de inmersión.
Procedimiento
Tomar una gota de un cultivo líquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o una
pipeta Pasteur estéril.
Colocar en el centro de un cubreobjetos y añadir cuatro pequeñas gotas de aceite en los
cuatro extremos.
Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada
en el centro de la depresión.
Dar la vuelta al portaobjetos.
Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión (100x).
Esta técnica permite observar el desplazamiento rápido y rectilíneo o dando giros y
volteretas en aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las bacterias
inmóviles presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento browniano, debido
al choque de las moléculas enuna solución líquida.
Método de observación directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este
caso la suspensión de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de
fases o interferencia diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste. El
microscopio de contraste de fases utiliza un condensador con un diafragma anular opaco
con un anillo transparente que provocan variación de la longitud de onda dependientes de la
densidad y el índice de refracción de la muestra, se observan las células más brillantes
sobre un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la observación
tridimensional de la muestra por la incorporación de prismas que generan haces de luz
polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias entre los componentes celulares
por lo que es muy útil para la observación de esporas, inclusiones, filamentos septados o
vainas entre otros.
Material necesario
Cultivos bacterianos en medio líquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, aceite
de inmersión.
Procedimiento
Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un
portaobjetos excavado. La preparación se observa directamente al microscopio decontraste
de fases o de [Link] (Biología). Serie Microbiología.3 (5): 15-38, 2010ISSN: 1989-
362018. Observación de Zooglea ramigeray bacterias filamentosas. Microscopía de
Interferencia diferencial (100x).Observación de Anabaenasp., cianobacteria filamentosa.
Microscopía de contraste de fases (100x).
TINCIONES
Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con
cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes.
En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos
son productos particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este
tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se
observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tinción simple
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados
de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está
cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes
básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son
safranina, fuchina básica y verde malaquita.
Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH
interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así
los colorantes básicos son los más eficaces.
Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un
cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos
componentes como las proteínas.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador,
cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de
inmersión.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota
de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño
y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un
método muy sencillo y rápido.

TINCIÓN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la
aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio
que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas
células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente
químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una
misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la
tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia.
Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian
Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos
fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los
pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente
por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba
a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el
tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de  Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de
tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.
Material necesario
Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.
 Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa
de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estéril.
Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de
siembra. Dejar secar.
Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Añadir el mordiente lugol, solución de yodo -ioduro potásico, durante 1 minuto.
Lavar el exceso de mordiente con agua.
Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30
segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).
Lavar inmediatamente con abundante agua.
Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos
hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias Gram
positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram
negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante
de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color
violeta.
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los
microorganismos a esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física
como a la composición de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de
péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuirá la retención del
colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias Gram negativas la delgada
capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la
pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la pérdida del colorante
fundamental después de la decoloración con alcohol.
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-
Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves
(ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol
resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente.

 Por Ramos Michelle

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma
tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
         El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el
KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero
no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
         La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),
sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece
como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
         En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.

Tinción Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de
los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.
Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión
"taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que
presentan las células bacterianas.
En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y
de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, a veces de gran tamaño

Bacilos
grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en

una misma especie.
Por Rangel Hugo
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos
que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes
colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de
tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares
(por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas
dentro de células individuales.
En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de
manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para
cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el
marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.
Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un
proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada
es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram,
quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas. Debido a su importancia en
taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células
fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta
(otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso
de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las
grampositivas, están eñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de
yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gram positivas
como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la
decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran
mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner
de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después
de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se
colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la
tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un
colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en
revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Por Rascón Lizeth

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada para mejorar el contraste en la

imagen vista al microscopio. Los colorantes son sustancias que usualmente se utilizan para
aumentar la definición y examinar poblaciones celulares.
Tipos de técnicas de tinción
Tinciones simples
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del
mismo color. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para
que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser
observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial
consta de dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción
de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por
el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.
Tinciones específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.
Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la
muestra en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el
exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de
un mordiente. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la
tinción mordentada permanece.
Tinción negativa:
Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y
que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción
negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un
portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y
cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los
microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo
claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea
Tinción indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente
habitual es el ácido tánico.
Tinción directa:
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato,
sin otro tratamiento previo.
Tinción Gram:
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular bacteriana
(cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM
1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este
momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas
retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram
negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les
proporciona un color violeta más intenso.
Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:
1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el
interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina
la fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su
superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de
Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.
Tinción: RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen
de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos
ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden
ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción
con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten
la diferenciación morfológica.
Tinción: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se
intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la
tinción.
Colorantes:
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más
visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser
utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células
vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe
las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en
la coloración de Gram.
 Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la
hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al
material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además
imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en
algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se
utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una
coloración amarilla al colágeno.
Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo
claro, para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.
Por Reyes Diego
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes.
Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido
fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción.
Conceptos básicos.
      Tinción primaria: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a las

células.

       Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción.

Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una
      

parte de las células que se han teñido.

Tinción de contraste: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido previamente
      

decoloradas y además le da un color diferente de la primera vez que se tiño. 

Tinciones para microbiología.
      Tinción de Gram.
       Tinción de Ziehl-Neelsen
 La tinción de Kinyoun es una variante de la tinción clásica de Ziehl-Neelsen que utiliza
como colorante primario Fucsina básica con fenol a concentraciones altas, lo que permite
la coloración en frío, mientras que la tinción clásica de Ziehl-Neelsen precisa la utilización
de calor en la etapa de la coloración primaria.

a tinción Kinyoun es una técnica de coloración utilizada para

teñir bacterias y parásitos ácido alcohol resistentes. Nació de la
modificación de la coloración de Ziehl-Neelsen; ambas técnicas se
interpretan de la misma manera pero se diferencian en dos
elementos: en la preparación del reactivo principal y en que la
técnica de Kinyoun no utiliza calor.

Por esta razón también es conocida como Ziehl-Neelsen modificada

en frío o tinción en frío de Kinyoun. Esta indicada para la
coloración de Micobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae,
micobacterias atípicas, Nocardias sp, Criptosporidium parvum,
Criptosporidium meleagridis, Criptosporidium felis, Criptosporidium
muris  y Cyclosporas cayetanensis
       Tinción de Schaeffer-Fulton
       Tinción de Conklin TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos géneros bacterianos, entre
los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia
denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables
(agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.)
formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la
célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años.
Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su
 estudio y observación son de enorme interés.

       Tinción de Grocott

Tinción simple.
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma
tonalidad.
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula
huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y
la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno
de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la
presencia de leucocitos.
Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un
proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada
es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram,
quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción
de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una
solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas
después para quitar el exceso de colorante.
En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro
potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace
soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien
alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la
resistencia a la decoloración.
Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las
gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza
una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son
rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen
un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la
tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina –
fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se
tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un
decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren
mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se
utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células
ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de
color rosa.
Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de
verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de
color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde de la verde malaquita.
 Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se
colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células.
La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad
con los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china
(que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro
insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de
las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de
cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Por Rios Selene
Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

         Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.

         Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.
         Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.
Tipos de colorantes:
Ácidos:
         En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas
positivamente y no las células, que tienen carga negativa.
         Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...
Básicos:
         En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las
células.
         Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o
carbol-fucsina.

Características de un cultivo para una buena tinción:

         Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.
         Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario
usar un cultivo liquido.
Preparación de un frotis:
         Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua
         Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.
         Secado al aire.
         Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la
llama rápidamente.
Tipos de tinciones:
         Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se
suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el
grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las
agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.
         Diferenciales: Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de
distintas especies.
TINCIÓN DE GRAM
Es la más importante en bacteriología. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:
  Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)
  Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)
Las gram + aparecerán violetas, y las gram – aparecerán rosas. Las diferencias entre + y –
obedecen a la estructura de su pared celular:
Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que
las gram – son muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.

Técnica de tinción simple

En una técnica de tinción simple , un tinte catiónico básico se inunda a

través de una muestra, agregando color a las células. Antes de continuar,
definamos la palabra catiónica. Un catión es simplemente un ión cargado
positivamente. Las moléculas que componen los tintes básicos tienen
 carga positiva. Esto es importante porque la pared celular y el citoplasma
de las células bacterianas tienen carga negativa. El tinte cargado
positivamente es atraído por las células cargadas negativamente, lo que
mejora la capacidad del tinte para adherirse y colorear las células. Ahora,
esas celdas casi incoloras deberían aparecer en la diapositiva en cualquier
número de colores.
s importante tener en cuenta que antes de que una muestra pueda teñirse
con un simple tinte, debe fijarse con calor al portaobjetos. Durante la
fijación por calor, se agita un portaobjetos de vidrio sobre una llama
abierta. Esto mata las bacterias, une las células al portaobjetos y mejora la
absorción de la tinción. Este proceso hace que la tinción sea más efectiva,
pero puede dañar o distorsionar las células, cambiando su apariencia de un
estado verdaderamente natural y de vida libre. El azul de metileno es un
ejemplo clásico de una simple mancha. Esta mancha azul coloreará todas
las células de azul, haciéndolas destacar sobre el fondo brillante del
microscopio óptico. Observe a continuación cómo el fondo permanece
generalmente claro, mientras que las células bacterianas son de un azul
profundo.

Se emplea un solo colorante (azul de metileno)

 Técnica de tinción negativa

En una técnica de tinción negativa , se mezcla un tinte aniónico ácido

con una muestra de células. El tinte cambia el color del fondo, no las
células, lo que hace que las células se destaquen. Este proceso puede
considerarse lo contrario de la tinción simple. Un anión es un ion con
carga negativa, por lo tanto, un tinte aniónico tiene una carga
negativa. Cuando el tinte cargado negativamente se agrega a las células
cargadas negativamente, las dos se repelen, lo que significa que se
separan. Cuando la mezcla se coloca en un portaobjetos y se seca al aire,
el resultado es un fondo teñido de oscuro que rodea a las células claras y
sin teñir. Las células transparentes ahora son muy visibles, pero no se
ven afectadas por el contacto directo con el tinte y la distorsión de la
fijación por calor, que no es necesaria en una tinción negativa.

La tinta china es el ejemplo clásico de tinción negativa. Cambiará el

fondo de un marrón oscuro a negro, dejando las células claras y brillantes
sin teñir y muy visibles. A continuación se muestran las células del
patógeno fúngico Cryptococcus. La tinta china ha coloreado el fondo de
marrón, dejando a las células su color natural.
 Técnica de tinción diferencial

Las tinciones simples y las tinciones negativas son excelentes para

observar las células, pero teñirán casi todas las células por igual. ¿Qué
sucede si tiene una muestra mixta, lo que significa que hay más de un
tipo de bacteria presente o sospecha que su cultivo puro está
contaminado? Sería bueno si pudiera teñir algunas células, pero no otras,
o si diferentes tipos de bacterias se verían diferentes.
Ingrese a la técnica de tinción diferencial , un procedimiento que permite
al observador distinguir visualmente entre diferentes tipos de células
bacterianas basándose en la idea de que no todos los tipos de células se
tiñen por igual. Esta técnica aprovecha las diferentes propiedades físicas
que han desarrollado distintas bacterias. La mejor manera de entender
este concepto es observar la técnica de tinción diferencial más famosa, la
tinción de Gram.
La tinción de Gram es una técnica de tinción diferencial que puede
detectar dos tipos diferentes de bacterias según las diferencias en la
estructura de la pared celular. Hay dos tipos principales de paredes
celulares, que llevan el nombre de cómo aparecen después de la tinción
de Gram. Las paredes de las células grampositivas tienen una capa
gruesa de peptidoglicano, un compuesto en forma de malla que agrega
fuerza y rigidez a la pared celular. Las paredes de las células
gramnegativas tienen una capa delgada de peptidoglicano que está
cubierta por una membrana externa.

Durante una tinción de Gram, la tinción primaria, cristal violeta,

convierte todas las células en moradas, pero puede eliminarse fácilmente
de la fina capa de peptidoglicano de las paredes de las células Gram
negativas, dejándolas transparentes. La capa gruesa de peptidoglicano
atrapa el cristal violeta en las células Gram positivas, evitando que se
elimine por lavado.
La adición de una segunda tinción, safranina, teñirá las células Gram
negativas transparentes de un color rojo. Las células grampositivas
permanecerán violetas. Puede ver a continuación cómo esto distinguirá
las células grampositivas de las células gramnegativas en función de las
diferentes formas en que las paredes celulares absorben la tinción. Las
bacterias con paredes celulares compuestas por una capa gruesa de
peptidoglicano se vuelven moradas o son Gram positivas. Las bacterias
con paredes celulares compuestas por una fina capa de peptidoglicano y
una membrana externa se vuelven rojas o son gramnegativas.
Tinción de Gram
     

¿Qué es una tinción de Gram?

La tinción de Gram es una prueba que busca bacterias en una parte del cuerpo donde se
sospecha una infección o en ciertos fluidos corporales, como la sangre o la orina. Esto incluye
la garganta, los pulmones, los genitales y lesiones en la piel.
Hay dos categorías principales de infecciones bacterianas, grampositivas y gramnegativas.
Las categorías se diagnostican según cómo reacciona la bacteria a la tinción de Gram. La
tinción de Gram es de color púrpura. Cuando la tinción se combina con la bacteria en una
muestra, las bacterias puede seguir de color púrpura o volverse rosadas o rojas. Si se
mantienen púrpura, son grampositivas. Si se vuelven rosadas o rojas, son gramnegativas. Las
dos categorías causan tipos diferentes de infecciones:
 Las infecciones grampositivas incluyen el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM),
las infecciones por estreptococos y el shock tóxico
 Las infecciones gramnegativas incluyen salmonela, neumonía, infecciones del tracto urinario y gonorrea
La tinción de Gram también puede usarse para diagnosticar infecciones por hongos.
Nombres alternativos: Coloración de Gram

¿Para qué se usa?

La tinción de Gram se suele usar para saber si usted tiene una infección bacteriana. Si es así,
la prueba muestra si la infección es grampositiva o gramnegativa.

¿Por qué necesito una tinción de Gram?

Usted puede necesitar esta prueba si tiene síntomas de una infección bacteriana. El dolor,
la fiebre y la fatiga son síntomas comunes de muchas infecciones bacterianas. Otros síntomas
dependen del tipo de infección y de la parte del cuerpo afectada.
¿Qué ocurre durante una tinción de Gram?
El profesional de la salud necesita tomar una muestra del lugar donde se sospecha que hay
una infección o de ciertos fluidos corporales. Esto depende del tipo de infección. Los tipos más
comunes de tinción de Gram se enumeran a continuación.

Muestra de una herida:

 El profesional de la salud usa un hisopo especial para tomar una muestra del lugar de la herida
 Análisis de sangre:
 El profesional de la salud toma una muestra de sangre de una vena de un brazo
Análisis de orina:
 Usted entrega una muestra de orina estéril en un recipiente siguiendo las instrucciones de su profesional
de la salud
Cultivo de garganta:
 El profesional de la salud inserta un hisopo especial en la boca para obtener una muestra de la parte
trasera de la garganta y las amígdalas
Cultivo de esputo: El esputo es la mucosidad espesa que se expulsa de los pulmones al toser.
Es diferente de un escupitajo o de la saliva.
 El médico le pedirá que tosa el esputo en una taza especial, o puede usar un hisopo especial para tomar
una muestra de la nariz

¿Debo hacer algo para prepararme para la prueba?

La tinción de Gram no requiere ningún preparativo especial.

¿Tiene algún riesgo esta prueba?

Las pruebas con hisopo, de esputo y de orina no tienen ningún riesgo.

Los riesgos de un análisis de sangre son mínimos. Tal vez sienta un dolor leve o se le forme
un moretón donde se inserta la aguja, pero la mayoría de los síntomas desaparecen
rápidamente.

¿Qué significan los resultados?

Su muestra se colocará en el portaobjetos de un microscopio y se tratará con la tinción de
Gram. Un profesional del laboratorio examinará la muestra con un microscopio. Si no se
encuentran bacterias, eso significa que usted probablemente no tiene una infección bacteriana
o que no había suficientes bacterias en la muestra.

Si se encuentran bacterias, éstas tienen ciertas características que pueden entregar

información importante sobre su infección:

 Si la bacteria es de color púrpura, es probable que tenga una infección grampositiva

 Si la bacteria es rosada o roja, es probable que tenga una infección gramnegativa
Sus resultados también incluyen información sobre la forma de las bacterias de la muestra. La
mayoría de las bacterias son esféricas ("cocos") o tienen forma de vara ("bacilos"). La forma
también puede indicar cuál es el tipo de infección.

Aunque los resultados no identifiquen el tipo exacto de bacteria en su muestra, pueden darle
pistas al profesional de la salud sobre la causa de su enfermedad y la mejor forma de tratarla.
Quizás necesite más pruebas, como un cultivo de bacterias para confirmar qué tipo de
infección tiene.
Los resultados de la tinción de Gram también pueden mostrar si tiene una infección por
hongos y su categoría, si es una candidiasis o una infección por moho. Pero tal vez necesite
más pruebas para saber qué infección fúngica específica tiene.

Si tiene preguntas sobre sus resultados, consulte con su médico o profesional de la salud.

Obtenga más información sobre pruebas médicas, rangos de referencia y cómo entender los
resultados.
¿Debo saber algo más sobre la tinción de Gram?
Si le diagnostican una infección bacteriana, es probable que le receten antibióticos. Es
importante que tome su medicamento siguiendo las indicaciones del médico, incluso si sus
síntomas son leves. Esto puede evitar que la infección empeore y cause complicaciones
graves.

Revisemos.
Las células bacterianas individuales son casi incoloras, lo que dificulta su
visualización con el microscopio óptico. Para superar este problema, las
bacterias se tiñen para mejorar la visibilidad. Existen muchas técnicas de
tinción diferentes.
En una técnica de tinción simple , una tinción con carga positiva colorea
las células cargadas negativamente, haciéndolas destacar sobre el fondo
claro. El azul de metileno es una mancha simple que colorea las células
de azul.
En una técnica de tinción negativa , una tinción cargada negativamente
colorea el fondo, dejando las células de color claro y sin teñir. Las
células brillantes son fácilmente visibles contra el fondo oscuro. La tinta
china es una mancha negativa que colorea el fondo de color marrón,
dejando las células brillantes y visibles.
Una técnica de tinción diferencial es un procedimiento que permite al
observador distinguir visualmente entre diferentes tipos de células
bacterianas basándose en la idea de que no todos los tipos de células se
tiñen por igual. Algunas características físicas conducen a una absorción
desigual de una mancha, dependiendo de las bacterias específicas. La
diferencia de color resultante se puede utilizar para distinguir diferentes
tipos de células. La tinción de Gram es una técnica diferencial que
colorea las células Gram-positivas con una pared celular espesa de
peptidoglicano de color púrpura mientras que colorea las células Gram-
negativas con una pared celular delgada de peptidoglicano de rojo.