TEMA 8: HIBRIDACIÓN

INSTRUMENTAL
- Propiedades generales de los acoplamientos
- Espectrometría de masas en tándem
- Técnicas de separación acopladas a MS molecular
- Cromatografía de gases acoplada a MS
- Cromatografía de líquidos acoplada a MS
 PROPIEDADES GENERALES DE LOS ACOPLAMIENTOS

El acoplamiento a una técnica MS se realiza con el fin de mejorar la

separación de los componentes de la muestra previa a su detección

La primera técnica (técnica acoplada) tiene como objetivo separar total

o parcialmente los componentes de la muestra. La segunda técnica
(detección MS) debe recibir los componentes separados y detectarlos.

¿Por qué acoplar MS a una técnica de separación?

- cuando trabajamos con compuestos parecidos.

- cuando un compuesto se encuentra en una proporción mucho más
elevada que otro.
- cuando la matriz de la muestra interfiere.
 Aspectos a tener en cuenta en el acoplamiento de
técnicas instrumentales

 Compatibilidad. Los solutos que abandonan la primera técnica están

en una fase móvil de cierta naturaleza química, a una presión, flujo
y temperatura dados, cuyas características pueden impedir o no el
funcionamiento de la segunda técnica, siendo posible un
“acoplamiento directo” o necesario una “interfase de conexión”.
Otra dificultad es el tiempo de respuesta de ambas técnicas.
 Complementariedad. Combinar la información de ambas técnicas
para conseguir resolver un problema que cada técnica por
separado no podría.
 Ortogonalidad. El acoplamiento de técnicas ortogonales (basadas
en mecanismos totalmente diferentes) permite aprovechar al
máximo la capacidad de las técnicas que se acoplan.
 Combinaciones posibles en los sistemas de hibridación
instrumental:

Técnicas de MS entre si  MS en tándem (MS/MS o MS2).

Técnicas de separación entre si  Técnicas multidimensionales de

separación o cromatografía multidimensional.

Técnicas de separación con MS  GC/MS, LC/MS, ...

ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM
 Algunas técnicas de ionización son blandas y, por tanto, no permiten
la fragmentación de los iones.

 Con fines a obtener información estructural será necesario inducir

tal fragmentación: espectrometría de masas en tándem.

 En esta técnica se induce la fragmentación de los iones formados

(ión progenitor) a través de la colisión de éstos con átomos de un gas o
la aplicación de un potencial. Los iones obtenidos tras la fragmentación
de ion progenitor se llaman iones hijos.

La espectrometría de masas en tándem puede concebirse de dos

formas diferentes: tándem en el tiempo (implica la utilización de un
único analizador de masas) y tándem en el espacio (implica el
acoplamiento de analizadores de masas (MS1 y MS2) físicamente
diferentes).

 SOLO EN LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM EN EL

ESPACIO SE DA EL ACOPLAMIENTO DE DOS ANALIZADORES DE
MASAS.
 Espectrometría de masas en tándem en el espacio
Analizador de Analizador de
Fuente de masas Q Se bombea un masas Q y TOF
ionización blanda gas (Ar, N2)

Iones progenitores
o precursores Iones producto
o iones hijos

CAD: Disociación activada por colisión

CID: Disociación inducida por colisión
 Ventajas MS/MS en el espacio:

 Mejora la selectividad
 Mejora la sensibilidad
 Permite la elucidación de estructuras complejas

Posibles configuraciones:
Cuadrupolo/cuadrupolo (QqQ)
Cuadrupolo/tiempo de vuelo (QTOF)
Sector magnético/cuadrupolo (EB/Q o EBE/Q)
SISTEMAS
HÍBRIDOS

Sector magnético/sector magnético (EBE/EBE)

Sector magnético/tiempo de vuelo (EBE/TOF)
 Tiempo de vuelo/tiempo de vuelo (TOF/TOF)
 Triple cuadropolo (QqQ)

Detector 1 (MS)

Q1 q2 Q3

Célula de Colisión Detector 2

(Ar o N2) (MS/MS)
1 torr 10-3 torr 10-6 torr

DISOCIACIÓN INDUCIDA POR COLISIÓN (CID)

DISOCIACIÓN ACTIVADA POR COLISIÓN (CAD)
Ventajas QqQ:

- Sencillez de automatización y control debida a los bajos voltajes

empleados.

- Posibilidad de obtener resolución unidad tanto en precursores como

en fragmentos.

- Posibilidad de utilizar diferentes modos de barrido que permiten no

solo obtener información estructural sino obtener una mayor
selectividad y sensibilidad.

Inconvenientes del QqQ:

- Limitado a trabajar con moléculas de baja masa molecular.

 Modos de barrido en Barrido de iones producto
espectrometría de QqQ

Barrido de iones precursores

En equipos de MS/MS en el
tiempo (ejem., trampa de
iones) solo es posible el

Exclusivos QqQ
barrido de iones producto!!!!
Barrido de fragmento neutro

SRM (selected reaction monitoring)

Indicado para hacer análisis
cuantitativo por su elevada
sensibilidad  no genera
espectro de MS/MS
Barrido de iones producto

Barrido de iones precursores

Barrido de fragmento neutro

Espectro de MS (a) y MS/MS
(b) correspondiente a una
muestra de orina tratada
para detectar ácido biliares
 Selected reaction
monitoring (SRM) Se monitoriza una sola transición

m/z
m/z  m/z’ m/z’

Multiple reaction Se monitorizan transiciones múltiples

monitoring (MRM)

m/z  m/z’ m/z m/z’

m/z  m/z’’
m/z’’

m/z* ’
m/z  m/z’ m/z
m/z*  m/z* ’ m/z’
m/z*
 Q-TOF (sistema híbrido)

* La principal ventaja del QqQ vs. QTOF

es que se puede realizar barrido de
iones precursores, barrido de
fragmentos neutros y SRM/MRM.

* La principal ventaja de QTOF vs. QqQ

es su mayor sensibilidad en modo
SCAN, su resolución, exactitud y
rapidez.
14
 MS/MS en el espacio vs. MS/MS en el tiempo
MS/MS en el espacio requiere la utilización de diferentes
analizadores y que los iones sean transferidos de un analizador a otro
a través de un cámara de colisión  la técnica es más cara y
compleja que MS/MS en el tiempo.
 MS/MS en el espacio permite la utilización de diferentes modos de
barrido.
En MS/MS en el espacio, los iones sufren múltiples colisiones y tan
pronto como se forman se reactivan por colisión y pueden volver a
fragmentarse. En MS/MS en el tiempo, si la fragmentación tiene lugar
por la irradiación de energía de una determinada frecuencia, solo se
excita el ión precursor y no los hijos.

Comparación de un barrido de iones

producto realizado en un equipo que
hace MS/MS en el tiempo y en el espacio
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN ACOPLADAS A MS

 El funcionamiento de un
detector de MS acoplado a
una técnica de separación es
totalmente diferente al
funcionamiento de otros
detectores típicos de estas
técnicas.
 Tipos de cromatogramas que se pueden obtener en función del modo
de adquisición de datos utilizado en MS

 Modo SCAN
Se mide repetidamente el espectro de masas completo dentro de un
intervalo de masas.

Cromatograma de Iones
Intensidad Totales (TIC)
de corriente

Tiempo
de corriente
Intensidad

m/z m/z m/z

Espectros de masas
El cromatograma de iones totales (TIC) representa en el
tiempo la intensidad de todos los iones detectados dentro
del intervalo de masas de trabajo en cada instante de
tiempo.
El cromatograma de pico base (BPC) representa en el
tiempo la abundancia del ion más abundante (pico base)
en cada espectro de masas.
El cromatograma de iones extraídos (EIC) representa en
el tiempo la abundancia de un determinado ión elegido
entre todos los iones del espectro obtenido en cada
momento.

 Modo SIM (Cromatograma en modo de adquisición SIM)

 Modo MS/MS (Cromatograma en modo de adquisición de
espectrometría de masas en tandem)
 Modo SRM/MRM (Cromatograma en modo de adquisición
SRM/MRM)
 TIC
(Total ion chromatogram o
cromatograma de iones totales)

BPC
(Base peak chromatogram o
cromatograma de pico base)

EIC
(Extracted ion chromatogram o
cromatograma de ion extraído)
Sensibilidad TIC < sensibilidad SIM (cuadrupolo)

Orina con 2 ng/ml (2 ppb) de Clenbuterol

1.6 x 107

X 160
TIC Clenbuterol ?

SIM: m/z 277.1 Clenbuterol

1.0 x 105
(± 0.5 Da)
S/N = 14
Extracción típica con cuadrupolo
 Sensibilidad TIC < sensibilidad EIC (TOF)

1.9 x 104 X 840 TIC

S/N = 102 Clenbuterol

EIC: m/z 277.0866

(± 0.008 Da)

Extracción con TOF

Al disponerse de alta resolución se podrán efectuar extracciones de iones

con ventanas muy estrechas para mejorar la selectividad y sensibilidad
Sensibilidad SIM (LC/MS (Q)) < sensibilidad SRM (LC/MS/MS (QqQ))

100 ppb en
plasma

*
(Dextromethorphan)
 MS requiere un alto vacío para evitar las
colisiones durante la separación de los iones,
mientras las técnicas de separación son
técnicas de alta presión

Necesario interfase para acoplar ambas técnicas

GC/LC

Alta presión Baja presión

CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A MS

Incompatibilidades del acoplamiento GC/MS

 El efluyente que sale de la columna lo hace a presión atmosférica
mientras que el MS trabaja en condiciones de alto vacío.

 Eliminación del flujo de gas inerte (He) que se emplea como gas
portador.

 Velocidad de adquisición de datos.

Equipos con fuentes de iones de EI y CI junto con cuadrupolos,

trampas de iones, sectores magnéticos y TOF

Acoplamiento directo
Posibilidades de acoplamiento Acoplamiento en régimen abierto
Sistemas de enriquecimiento

En desuso
Acoplamiento directo

 Se utiliza con columnas capilares de sílice fundida con flujos de gas

portador comprendidos entre 1-2 mL/min.

 La misma columna capilar llega hasta la fuente de ionización a través de una

línea calentada para evitar condensaciones  el 100% de la muestra eluida
llega al MS  MÁXIMA SENSIBILIDAD.

 El hecho de incorporar un MS a alto vacío a la salida de la columna de GC

hace que se genere un gradiente de presiones que modifica los tiempos de
elución de los compuestos con respecto a los que aparecían en el caso de no
darse la detección por MS.

 El cambio de columna también es más problemático.

Acoplamiento en
régimen abierto
 Acoplamiento en régimen abierto
 La salida de la columna GC se conecta a un tubo en forma de T
abierto a la atmósfera y barrido por un flujo de He.

 Este dispositivo está, a su vez, conectado a la fuente de iones a

través de un tubo capilar de d.i. mayor al de la columna y calentado para
evitar condensaciones.

 La caída de presión entre los extremos de la columna de separación

se reduce ya que el extremo final de la columna estará a presión
atmosférica.

 El cambio de columna es más sencillo.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A MS

Incompatibilidades del acoplamiento LC/MS

HPLC MS
Trabaja en fase líquida (1-2 mL/min) Trabaja en fase gaseosa
Trabaja a presiones altas (50-200 bar) Trabaja en vacío
Trabaja a Tª entre 25-50 ºC Trabaja a Tª entre 100-350 ºC
Puede usar tampones inorgánicos Solo tolera tampones volátiles

Flujo Flujo gas a Patm Flujo gas (10-6 Torr)

(mL/min) (mL/min) (x1000 L/s)

Hexano 1 184 2300

Metanol 1 593 7400
Agua 1 1240 15500

DESARROLLO DE DISTINTAS INTERFASES

Interfases desarrolladas para el acoplamiento LC/MS:

 Basadas en la evaporación selectiva del disolvente previamente a

su entrada en el MS (moving belt, particle beam).

 Basadas en la reducción del flujo de líquido que se introduce en el

MS para lo cual era necesario la utilización de columnas capilares
(µL/min) o divisores de flujo.

 La utilización de interfases de MS a presión atmosférica admite

directamente flujos de fase móvil de hasta 1 mL/min no siendo
necesario una interfase adicional para que se de el acoplamiento entre
LC y MS.

La ionización a presión atmosférica (APCI y ESI) resultan ser las más

adecuadas en el acoplamiento directo LC/MS
 NEBULIZADOR Gotas
Inestables

ESI
Cono de
Taylor
Iones en
Fase gaseosa

contraelectrodo

APCI
Comparación de ESI y APCI en su acoplamiento con LC

- APCI es más tolerante que ESI a aditivos, tampones, etc. debido a que
la ionización en APCI se da en la fase gaseosa y no en disolución como
ocurre en ESI.

- APCI no funciona bien a bajos flujos de fase móvil (nL/min) y funciona

adecuadamente cuando se trabaja con flujos de mL/min contrario a lo
que le ocurre a ESI que sus condiciones óptimas de trabajo se
alcanzan con flujos bajos.

- Mientras ESI es más empleado con compuestos iónicos o polares,

APCI se utiliza con compuestos que presentan baja o moderada
polaridad por lo que son técnicas complementarias.

- APCI no es adecuado en el análisis de moléculas de gran tamaño o

termolábiles. Se trata de una técnica más agresiva que ESI con un
límite de masas de 1000 Da.
Comparación de GC/MS vs. LC/MS

GC/MS  los espectros por EI presentan elevada información

estructural y son independientes de las condiciones de la separación
(las moléculas llegan en fase gaseosa).
LC/MS  los espectros por API apenas fragmentan a la molécula,
dando información del ion cuasimolecular, siendo dependientes de las
condiciones experimentales y equipo.

Espectro “universal”
Identificación haciendo uso de la
Identificación por comparación
especificidad de la “masa exacta” y/o
con librería
selectividad de experimentos “ MSn ”
OH
86

(M+H)+
9000 Cl
Clenbuterol C12H18Cl2N2O
HN
CH3 [M+H]+= 277.0874
H2N
CH3
277.0874
Cl H3C 5.4e5
5.0e5
Espectro LC/MS
5000 4.5e5
4.0e5
Clenbuterol
Espectro GC/MS 3.5e5 279.0845
3.0e5

57
Clenbuterol MM+ 2.5e5
2.0e5
1.5e5
41 127
1.0e5

1000 71 190 243

99
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
0
40 100 200 m/z 280 m/z
EQUIPOS DE BAJA
RESOLUCIÓN

EQUIPOS DE ALTA
RESOLUCIÓN